מאמר שיטה

הערכה של Murine תרגיל סיבולת ללא השימוש ברשת הלם: אלטרנטיבי לתרגיל בכפייה

19.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51846

⸱

14 באוגוסט 2014

 ,  , 
1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

במאמר זה

סיכום

מודגמת שיטה להערכת סיבולת פעילות גופנית בעכברי מעבדה ללא שימוש ברשת הלם. שיטה זו היא חידוד אנושי שיכול להפחית את ההשפעות המבלבלות של לחץ על פרמטרים ניסיוניים.

תקציר

שימוש במודלים של עכברי מעבדה, המסלולים המולקולריים האחראים להטבות מטבולים של פעילות אירובית מתחילים להיות מוגדרים. השיטה הנפוצה ביותר להערכת סיבולת תרגיל בעכברים מנצלת נאלצה לרוץ על הליכון ממונע מצויד ברשת הלם. בעלי חיים שהפסיקו ריצה נדחפים על ידי חגורת הליכון המרגש על רשת המספקת הלם רגל חשמלי; כדי להימלט מהגירוי השלילי, העכברים לחזור לריצה על החגורה. עם זאת, הימנעות התנהגות ומתח נפשי עקב שימוש במתקן הלם חשמלי יכולים להפריע לכמת את סיבולת ריצה, כמו גם מדידות לבלבל של רמות הורמונים וציטוקינים בסרום postexercise. הנה, אנחנו מדגימים ולאמת שיטה מעודנת למדוד סיבולת ריצה בC57BL / 6 עכברי מעבדה נאיביים על הליכון ממונע ללא ניצול רשת הלם. כאשר העכברים preacclimated להליכון, הם רצים מרצון עם הליכה במהירויות ספציפית לכל mousדואר. שימוש ברשת ההלם הוא הוחלף על ידי עידוד עדין על ידי מפעיל אנושי באמצעות כפיס עץ, בשילוב עם רגישות לנכונות וולונטריות לרוץ על החלק של העכבר. נקודות קצה ברורות לכימות זמן ריצה לתשישות לכל עכבר מוגדרים ובאו לידי ביטוי בסימנים התנהגותיים של תשישות כגון תנוחת רגליה פשוקות ונשימה מאומצת. שיטה זו היא עידון אנושי שגם מקטין את תופעות של הבלבול של לחץ על פרמטרים של ניסוי.

מבוא

השמנה, עמידות לאינסולין, וסוכרת מהסוג 2 הם הפרעות בחילוף חומרים הקשורים זה שיפעיל השפעה עמוקה על הבריאות של ארה"ב ובאוכלוסיות בעולם 1-4. אימוני סיבולת יכול למנוע, כמו גם לטיפול, 5,6 תנאים אלה. יתר על כן, הערכה של מהירות הליכה וסיבולת מנוצלות בדיקות קליניות לאבחון כלחולשה, sarcopenia, ואת ההשלכות של הפרעות אחרות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית, בבני אדם 7.

התהליכים הביוכימיים שבבסיס את ההשפעות המיטיבות של פעילות אירובית על הרכב גוף ורגישות לאינסולין מתחילים הובהרו, באמצעות עכברים גנטיים או פרמקולוגית שונה המציגים משופר או מופחת יכולת הגופנית 8-11. עם זאת, מחקרים רבים כאלה מנוצלים הליכונים ממונעים מצוידים ברשתות הלם לכפות עכברים לרוץ 8-11. בעלי חיים שהפסיקו ריצה נדחפים על ידיחגורת הליכון המרגש על רשת המספקת הלם רגל חשמלי; כדי להימלט מהגירוי השלילי, העכברים לחזור לריצה על החגורה. נהלים אלה עשויים להציג את לחץ פסיכולוגי והימנעות התנהגות כגורמים מבלבלים משפיעים פרמטרים ניסיוניים 12. שיטות אחרות של סיבולת מדידה, כגון לכמת את פעילות אמבולטורי באמצעות מנגנון הקורה הפסקה או לכמת את ריצת גלגל בכלוב, עשויות להיות מבולבלות על ידי אפנון של מחזורי היממה, חרדה, אימון שלא במתכוון, או מזון מחפש התנהגות 12-16. יתר על כן, נהלים אלה מחייבים דיור אחת, מקור נוסף ללחץ פסיכולוגי לעכברים. לכן, יש צורך במדידה ישירה של סיבולת תרגיל לא מבולבלת על ידי מתח.

כדי לייתר את החששות האלה, המעבדה שלנו פיתחה ומאומתים שיטה להעריך את יכולת ריצה מקסימלי ומתמשכת מהירות ריצה בעכברים מאומנים, נאיביים באמצעות הליכון ממונע לא שוהpped עם רשת הלם. החלל בסוף מסילת הריצה, שבו רשת ההלם בדרך כלל מתגוררת, ואז הופך פלטפורמה לעכברים לשאר, ומספק מקום לעכברים שמסרבים לרוץ לשבת עד הוסר מהמכשיר. עכברים מעודדים מנוהלים על ידי משקיף אדם באמצעות הקשה עדינה או נגיעה עם כפיס עץ, בשילוב עם רגישות לנכונות וולונטריות לרוץ על החלק של העכבר. שיטה זו נעשתה שימוש כדי לכמת הבדלים בסיבולת גופנית בין C57BL / 6 עכברים גנטי שונה ולשלוט שונים בביטוי של ציטוקינים הנגזרים שריר interleukin-15 (IL-15) 16,17. שיטה זו היא עידון אנושי שמקטין את תופעות של הבלבול של חיזוק שלילי שנגרם על ידי שימוש ברשת הלם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליך המתואר כאן אושר על ידי ועדת סאונד מוסדי טיפול בבעלי חיים והשימוש VA Puget, ועומד במדריך ILAR לטיפול והשימוש בחי מעבדה.

.1 ניסויי הכנה

  1. להחליט מראש אם דם או אוסף רקמות מייד לאחר הפעילות הגופנית היא הכרחית, ואם כן, לקבוע את המרווח שלאחר האימון להולכה של נהלים כאלה. דוגמאות לכך כוללות את נחישות של הורמון תרגיל מושרה או שחרור ציטוקין למחזור הדם (דבר המחייב איסוף דם), קביעת הביטוי מושרה תרגיל של מיני mRNA של עניין (שחייב המתת חסד ואחריו אוסף רקמות). אם דם תרגיל הודעה מיידית או אוסף רקמות מצויינים, יש לי חומרים לנהלים אלה על יד בחדר הניתוח. לקבל את אישור ועדת בדיקה מוסדית ולבצע לפי הנחיות רגולטוריות. לא כל הניסויים דורשים דם postexercise או collecti רקמהעל; השוואה פשוטה של ​​סיבולת ריצה יכולה להיות כל מה שצריך.
  2. החלט מראש על קבוצות ניסוי ונהלי postexercise לעכברים (ראה תיאור לעיל).
  3. הנח את ההליכון על שולחן יציב בחדר שקט המוקדש במהלך הניסויים רצים להליך זה.
  4. הגדר את ההליכון לנתיבי עכבר בגודל ובנטייה מתאימה לפרוטוקול. הנטייה של +5 o משמשת כאן כדי לייתר נזק לשרירים כתוצאה ממימוש אקסצנטרי (התארכות השריר באותו הזמן כמו התכווצות) שמתרחש במהלך ירידה בריצה.
  5. הנח כרית סופגת מתחת לחגורה הליכון לתפוס צואה.

.2 הסתגלות של עכברים להליכון

להחליט אם (לא תרגיל) קבוצה "פעילה" של עכברים היא הכרחית, ולחשוף את העכברים בישיבה להליכון מבלי להפעיל כפי שמתואר בשלבים 2.1-2.5. קבע אם 2 או 4 קבוצות ניסוי נדרשות, . למשל, בישיבה / תרגיל (2 קבוצות); בקרת מימוש / מימוש טיפול (2 קבוצות, אין בעלי חיים כרוך בישיבה); או, בקרה בישיבה / מימוש x / טיפול (4 קבוצות). "הטיפול" יכול להיות הגנוטיפ מהונדס או נוק אאוט, משטר תרופתי, תזונה מיוחדת, או התערבות ניסיונית אחרת.

  1. אפשר העכבר כדי להסתגל להליך החדר בכלוב בבית מועבר, עם חבריהם לכלוב, ל1 - 2 שעות.
  2. בחר עכבר אחת ומספר תג שיא; לשקול עכבר ומשקל שיא.
  3. מקום עכבר בהליכון ללא מנוע מופעל עבור הסתגלות, כ -5 דקות. הפעל כוח על, בלי ריצת חגורת הליכון, ולתת את העכבר להסתגל לרעש המכונה ל5 דקות נוספות.
  4. הסר עכברים בקבוצות "הפעילים" (אם משתמש בו, ראה הערה 1) מדישה בנקודה זו ולהחזיר אותם לכלוב שלהם או לנהל הליכים שלאחר אימון לפי תכנון הניסוי (ראה הערה 2).

s = "jove_title"> 3. מתחיל את בדיקת הפעלה למיצוי

  1. לאחר הסתגלות, להפוך את החגורה למהירות נמוכה (10 מ '/ דקה) כאשר החיה בוחנת את החגורה ולא על הרציף.
  2. לטפוח בעדינות או להרים את האחוריים של העכבר עם כפיס עץ, פעם עד שלוש פעמים, כדי לעודד את בעלי החיים מסרבים להישאר על הליכון והריצה.
    הערה: רוב העכברים יפעלו בקלות, אבל הם לפעמים לעצור לתקופות קצרות. כאשר זה קורה, להשתמש בכפיס העץ להקיש או להרים את חלקו האחורי של בעלי החיים לעידוד חידוש פועל בעדינות. לעתים קרובות, העכברים לא צריכים להיות נגעו עם כפיס העץ; שם לב היד עם כפיס העץ המתקרב אליהם גורם לעכברים לרוץ עוד קצת.
  3. התחל טיימר מעבדה פעם אחת העכבר פועל במהירות הראשונית של 10 מ '/ דקה.
  4. הפעל את המהירות לאט לאט כאשר סמן העכבר נמצא בחלקו העליון (בסוף העלייה) של החגורה, במרווחים של 1 מ '/ דקה, על כל 2 דקות.
  5. הפעל את המהירות עדהגדרה קודמת אם העכבר פועל שוב ושוב בפרצים קצרים ולא בקצב קבוע.
  6. לקבוע המקסימאלי שנגרם מהירות ריצה של כל עכבר (בדרך כלל 14 - 17 מ '/ דקה לעכברי C57BL / 6) על ידי התאמת המהירות וצופה בעכבר. שיא מהירות זה.
    הערה: המיקום של בעלי החיים על ההליכון מקלות החוקר כלנכונותם של בעלי החיים לרוץ במהירות גבוהה יותר. אם העכבר הוא בסופו של הדבר בהרבה (עלייה) ועל לרוץ לתוך הקיר, הוא מוכן לרוץ במהירות גבוהה יותר. אם העכבר פועל בקצב קבוע באמצע הליכון זה יכול להיות במהירות המרבית שלה, או ייתכן שיהיה צורך בכיוון נוסף, תלוי באיכות של הריצה.

.4 נקודתי קצה ועכברים שStop

  1. השתמש בכפיס העץ להקיש או להרים את אחוריהם של בעלי החיים שיפסיקו, כדי לעודד את חידוש פועל בעדינות (ראה באור 3.2). אל תפסיק את שעון העצר להפרעות זמניות בריצה.
  2. לזהות וremovעכברי דואר שמסרבים לרוץ. הערה זו בגיליון נתונים. בהתאם לעיצוב ניסיוני שלך, עכברים שמסרבים ניתן להערכה מחדש ביום אחר
    הערה: עכברים מסוימים יסרבו לחלוטין לרוץ. עכברים מסוג זה יפעלו בפרצים קצרים, ואז להפסיק חתן או "דוושה", כלומר, לשבת על הפלטפורמה ולהשתמש ברגליים הקדמיות שלהם על החגורה. היציבה של עכברים אלה היא כפופה, עם כל ארבע הרגליים נטועות מתחת לבעלי החיים כדי שלא נדחף בחזרה להליכון בכפיס עץ. לפעמים עכבר הופך תוקפני כלפי הכפיס כאשר אינו מוכן להפעלה, נושך את הלשון או מטפס עליו כדרך של בריחה. ברור בתוך 5 דקות הראשונות של המשפט אם העכבר, או לא יהיה, לרוץ. הסר עכברים שמסרבים לרוץ מהניתוח, אבל לא לספור אותם כעכברים "פעילים".
  3. לזהות עכברים מותשים ולעצור את שעון העצר.
    הערה: תשישות מוגדרת על ידי שלוש תחנות וסירוב מחדש רצופותsume פועל למרות עידוד עדין, בתוספת סימנים פיזיים של תשישות כגון נשימה מאומצת ויציבת פשוקות. עכברים להתאושש מתשישות בתוך 30 עד 60 דקות.
  4. רשום את הסכום הכולל של הזמן בילה פועל בכל המהירויות.
  5. בהתאם לעיצוב ניסיוני, או להחזיר את העכבר הוא לכלוב שלה, או לנהל הליכי postexercise מיידיים כגון דם או אוסף רקמות לפי הנחיות מוסדיות.
  6. נגב את החגורה נקייה עם towelette קוטל חידקים לאחר הבדיקה של כל עכבר בודד, כך שהריח של העכבר הקודם אינו משפיע על התנהגותם של עכברים שלאחר מכן נבדקו.
  7. בדוק את העכבר הבא. השתמש בלשון צח depressor לכל עכבר. עכברים שמתגוררים באותו הכלוב, ניתן לבדוק ברצף באותו היום ללא הסתגלות נוספת לחדר הניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הליך זה למדידת סיבולת תרגיל משקף במדויק את הפרופיל המולקולרי וחילוף חומרים של זנים שונים של C57BL עכברים / 6 שנבדלים בביטוי של ציטוקינים IL-15 16,17. עכברים מהונדסים שביטוי יתר של IL-15 תערוכה (עכברי TG IL-15) גדלו באופן משמעותי לרוץ לתשישות פעמים השוואה לקבוצת ביקורת littermate, ואילו עכברים שחסרו-15 IL תערוכה (IL-15 KO עכברים) צמצמו באופן משמעותי לרוץ פעמים לפני שהגעתי תשישות (איור 1 א). מחקרים שפורסמו הראו כי שרירים הוסטו לעבר פנוטיפ חמצוני יותר בIL-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שתואר כאן הוא שיטה להערכת סיבולת ריצה מרצון בעכברי מעבדה באמצעות הליכון ממונע ללא שימוש ברשת הלם. שיטה זו יכולה לחשוף הבדלים בין תתי ענפים של C57BL עכברים / 6 שנבדלים בביטוי של ציטוקינים IL-15, אשר בתורו גורם להבדלים בביטוי של גורמים העומדים בבסיס 16,17 סיבולת תרגיל. בקנה אחד עם העקרונות של "שלוש בדירה האחת R" במדע בעלי חיים במעבדה, בשיטה זו יכולה לשמש כחלופה הומנית יותר, או עידון, לפרוטוקולי תרגיל נאלצו לנצל רשת הלם 8-11. תרגיל בכפייה יכול גם להציג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אי לנו ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

נתמך על ידי BX001026 סקירת הצטיינות # מהמחלקה לענייני יוצאי צבא (LSQ), ושימוש במשאבים ומתקנים במערכת VA Puget Sound בריאות, המהונדסים המשאבים Core באוניברסיטת מרכז ההלם נתן וושינגטון למצוינות בביולוגיה בסיסית של הזדקנות (NIA # 5P30AG-013,280), ואוניברסיטת וושינגטון סוכרת אנדוקרינולוגיה מרכז מחקר (# P30 NIH DK-17,047). אנו מודים לסינתיה Pekow DVM וקארי ל 'Koszdin DVM, VA Puget Sound, סיפקו הערות מועילות על כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
הליכון מכרסמים פתוח Exer-3/6קולומבוס אינסטרומנטס, קולומבוס OH1050RMמספר קטלוגי זה מיועד לדגמים ללא רשת זעזועים. ניתן להסיר רשתות זעזועים באופן ידני מדגמים ישנים יותר (Eco 3/6)
Sani Cloth Germicidal TowlettesPDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NYבדרך כלל מוזמן דרך מתקן מקומימכיל 10% אלכוהול איזופרופיל; ניתן להשתמש בכל מוצר שווה ערך.
מדכאי לשוןכל ספק
טיימר מעבדהכל ספק
IL-15 עכברי TG *JAX, Bar Harbor, ME011002עכברי IL-15 טרנסגן המתבטא ממקדם אקטין אלפא-שלד אנושי שונה עם רצף אותות שונה כדי להקל על ההפרשה.
עכברי C57BL/6J (סוג פראי)*JAX, Bar Harbor, ME000664עכברי בקרה לעכברי IL-15 TG
IL-15 KO*Taconic Farms, Germantown, NY4269-Mעכברי "נוק-אאוט" הומוזיגוטיים IL-15 על רקע C57BL/6 C57BL
/6NTac (סוג פראי)*Taconic Farms, Germantown, NYB6-Mעכברי בקרה עבור IL-15 KO
*אופציונלי; קווי עכבר וטיפולים יכולים להיות ספציפיים לניסוי פרוטוקול.
מקומי

מקורות

  1. Hill, J. A., Wyatt, H. R., Reed, G. W., Peters, J. C. Obesity and the environment: where do we go from here? Science. 299 (5608), 853-855 (2003).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (7121), 875-880 (2006).
  4. Pischon, T., Nothlings, U., Boeing, H. Obesity and cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 67 (2), 128-145 (2008).
  5. Benton, C. R., Wright, D. C., Bonen, A. PGC-1α-mediated regulation of gene expression and metabolism: Implications for nutrition and exercise prescriptions. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 33 (5), 843-862 (2008).
  6. Handschin, C., Spiegelman, B. M. The role of exercise and PGC1alpha in inflammation and chronic disease. Nature. 454 (7203), 463-469 (2008).
  7. Vasunilashorn, S., et al. Use of the Short Physical Performance Battery score to predict loss of ability to walk 400 meters: analysis from the InCHIANTI study. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (2), 223-229 (2009).
  8. Wang, Y. X., et al. Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPARδ. PLoS Bio. 2 (10), e294(2004).
  9. LeBrasseur, N. K., et al. Myostatin inhibition enhances the effects of exercise on performance and metabolic outcomes in aged mice. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (9), 940-948 (2009).
  10. Burch, N., et al. Electric pulse stimulation of cultured murine muscle cells reproduces gene expression changes of trained mouse muscle. PLoS ONE. 5 (6), e10970(2010).
  11. Li, L., et al. Mitochondrial biogenesis and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) deacetylation by physical activity. Diabetes. 60 (1), 157-167 (2011).
  12. Knab, A. M., et al. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol. & Behavior. 98 (4), 433-440 (2009).
  13. He, Y., et al. IL-15 Receptor deletion results in circadian changes of locomotor and metabolic behavior. J. Mol. Neurosci. 41 (2), 315-321 (2010).
  14. Wu, X., Hsuchou, H., Kastin, A. J., Rood, J. C., Pan, W. Essential role of interleukin-15 receptor in normal anxiety behavior. Brain Behav. Immun. 24 (8), 1340-1346 (2010).
  15. Pistilli, E. E., et al. Loss of IL-15 receptor α alters the endurance, fatigability, and metabolic characteristics of mouse fast skeletal muscles. J. Clin. Invest. 121 (8), 3120-3132 (2011).
  16. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T. W. IL-15 overexpression promotes endurance, oxidative energy metabolism, and muscle PPARδ, SIRT1, PGC-1α, and PGC-1β expression in male mice. Endocrinology. 154 (1), 232-245 (2013).
  17. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T., Marcell, T. J. IL-15 is required for post-exercise induction of the pro-oxidative mediators PPARdelta and SIRT1. Endocrinology. , (2013).
  18. Ward, J. M., Anver, M. R., Mahler, J. F., Devor-Henneman, D. E. Chapter 13, Pathology of mice commonly used in genetic engineering (C57BL/6; 129; B6,129; and FVB/N). The Pathology of Genetically Engineered Mice. Ward, J. M., Mahler, J. F., Maronpot, R. R., Sundberg, J. P. , Iowa State University Press. Ames, IA, Chapter. 161-179 (2000).
  19. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debate, K. A., Kleeberger, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med. Sci. Sports Exerc. 33 (12), 2053-2057 (2001).
  20. Turner, M. J., Kleeberger, S. R., Lightfoot, J. T. Influence of genetic background on daily running-wheel activity differs with aging. Physiol. Genomics. 22 (1), 76-85 (2005).
  21. Haight, T. J., van der Laan, M. J., Manini, T., Tager, I. B. Direct effects of leisure-time physical activity on walking speed. J. Nutr. Health Aging. 17 (8), 666-673 (2013).
  22. Studenski, S. Gait speed and survival in older adults. JAMA. 305 (1), 50-58 (2011).
  23. Jacobsen, K. R., Kalliokoski, O., Teilmann, A. C., Hau, J., Abelson, K. S. The effect of isoflurane anaesthesia and vasectomy on circulating corticosterone and ACTH in BALB/c mice. Gen. Comp. Endocrinol. 179 (3), 406-413 (2012).
  24. Sellers, T. L., Jaussi, A. W., Yang, H. T., Heninger, R. W., Winder, W. W. Effect of the exercise-induced increase in glucocorticoids on endurance in the rat. J. Appl. Physiol. 65 (1), 173-178 (1988).
  25. Cook, M. D., et al. Forced treadmill exercise training exacerbates inflammation and causes mortality while voluntary wheel training is protective in a mouse model of colitis. Brain Behav. Immun. 33, 46-56 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IL 15

מאמרים קשורים