שיטה חדשה של תרופות אמריקניות לדג הזברה מרובה ( Rerio Danio) וכימות של נסיגה

סיכום

מוסברת שיטה חדשה להפחתת השונות בעת חשיפת דגים לתרופות. דגים שנחשפו לדפוסים שונים של חשיפה לאתנול נמצאו כבעלי רמות חרדה שונות במהלך הגמילה במבחן סקוטוטקסי בהיר/כהה.

תקציר

בדיקת חרדה בדגי זברה נחקרת לעתים קרובות בשילוב עם יישום של חומרים פרמקולוגיים. במחקרים אלה, דגים נלכדים באופן שגרתי ומועברים בין אקווריומים ביתיים למיכלי מינון. על מנת לשפר את קלות מתן התרכובת, פותחה שיטה חדשה להעברת דגים בין מיכלים למתן תרופות. תוספות המיועדות להטלה שימשו להעברת קבוצות דגים לתמיסת התרופה, מה שמאפשר מינון מדויק של כל הדגים בקבוצה. זה מגביר את הדיוק והיעילות של המינון, מה שהופך להיות חשוב מאוד בלוחות זמנים ארוכים של מתן תרופות חוזר. יישמנו נוהל זה לשימוש במחקר שבחן את התנהגות דג הזברה במבחן אור/חושך לאחר מתן אתנול בלוחות זמנים שונים של 21 יום. בדגים שנחשפו לכמויות יומיות-מתונות של אלכוהול היה הבדל משמעותי בהעדפת המיקום לאחר יומיים של גמילה בהשוואה לקבוצת הביקורת. עם זאת, לא נצפה הבדל משמעותי בהעדפת המיקום בקבוצה שנחשפה למתן בולמוס שבועי.

ניתן להכליל פרוטוקול זה לשימוש עם כל סוגי התרכובות המסיסות במים וניתן להשתמש בו בכל מצב כאשר נבדקת התנהגות הדגים במהלך או אחרי לוחות זמנים ארוכים של מתן תרופות. מבחן האור/חושך הוא גם שיטה חשובה להערכת שינויים הנגרמים על ידי גמילה בחרדה.

מבוא

דג הזברה (Danio rerio) הוא בעלי חוליות קטנים שמקורו בהודו שהוא אורגניזם מודל שימושי עבור ^2,3 מחקר התנהגותי ¹ והרפואי. דג הזברה גם משמש בבדיקות של חומרים תרופתיים שונים על מנת לאפיין את השפעתן על התנהגות. מינונים ולוחות זמנים של מתן תרופה שונים שימשו כדי לחקור את ההתנהגות של דג הזברה לאחר מתן תרכובות הכימי כגון חומרים ממריצים ^4, anxiolytics ⁵ ואתנול ^6-8.

המעבדה שלנו חקרה את ההשפעות של שונה לוחות זמנים של ממשל אתנול על חרדה ותנועת דג הזברה באור / חושך assay תוקף היטב ^{9, 20,} גם המכונה גם assay scototaxic. שיטה חדשה של ממשל אתנול פותחה כדי להגביר את היעילות עבור ממשל חוזר ונשנה, מדי יום במשך תקופה ארוכה של זמן (21 ימים) ⁶ . שיטות ששמשו בעבר היו מעשיות, לעומת זאת, ביקשנו לפתח שיטה שצמצמה רשת, עם עלויות הזמן הקשורים אליו, ואפשרו ממשל בו זמנית, בעיתוי המדויק של התרופה של עניין למספרים גדולים של דגים. באתנול מחקר באמצעות מסורתי, דג הזברה הם נלכדו ברשת והועברה מטנק אחד למשנה המכיל את התערובת המתאימה של אתנול ומים ^10-12. למרות ששיטה זו היא מקובלת מאוד, רשתות דג הזברה עשויה להגדיל את השונות בזמן שנדרש כדי להציג ולהסיר את הדגים מהפתרון התרופתי. לכן, החשיפה המדויקת למתחם של עניין עשויה להשתנות במהלך ניסוי מעורב מינון חוזר ונשנה. שיטה שמפחיתה מקורות שגיאה הנובעת מהשתנות בזמני תחבורה לכן רצויה. בשיטה שלנו אנו מסוגלים להעביר את כל הדגים בו זמנית, וכתוצאה מכך זמן מינון זהה בכל דגים. בעקבות חשיפת אתנול (שתוארה כאן), דג הזברה יכולה להיבדק בכל number של מבחני התנהגות, כוללים אלה שלהעריך חרדה. יש מינון קבוצות של דגים בשיטה החדשה שימושים מעשיים מעבר ליכולת לשכפל במדויק ולתקן מינון בין נושאים ובין קבוצות של דגים. כניסתו של תוכנה חדשה המאפשרת למעקב של דגים מרובים בבת אחת יכול לראות חוקרים להשתמש בשיטות שלנו כדי להבטיח replicability ודיוק בניסויים שלהם. בהתחשב בשימוש הנרחב בדג הזברה כאורגניזם מודל למדעי מוח ההתנהגותיים, שיטה זו תגביר את היעילות ומעשיות במחקרים פרמקולוגיים עתיד.

בפרדיגמה הנוכחית, לוח הזמנים של מינון חוזר ונשנה הועסקו כי כ משקף לוחות זמנים שתיית אדם. דגים חולקו באופן אקראי לאחת משלוש קבוצות: שליטה, יומי-מתונה, או שבועי בולמוס. לוח הזמנים של המינון היה 21 ימים בזמן, נבחר משום שהוא חרג באופן משמעותי זמני חשיפה במחקרים קודמים ^7. דגי בקרה קיבלו אפס Alcoחול, דגים מדי יום-מתונים קיבלו 0.2% אלכוהול פעם ביום, ודגים שבועי בולמוס קיבלו 1.4% אלכוהול פעם בשבוע. משימת האור / החושך שימשה להערכת חרדה אחרי 2 ימים של נסיגה. זוהי בדיקה פשוטה יחסית לניהול המשתמש בזירה מלבנית שבה הקירות בצד אחד הם לבנים ובצד האחר הם ⁹ כהים. דג הזברה מבוגרת וחסונה מעדיפה את הצד האפל של הזירה בתנאי שליטה ^6,9,13. חרדה מוגברת מוגדרת מבצעית כמו יותר זמן באופן משמעותי בילה באזור החשוך, וירידה בחרדה ניתן להניח כאשר הדגים מבלה את הזמן יחסית יותר בילה באזור האור. עם תוכנת תנועת מעקב, יכולים להיות גם לכמת משתנים אינפורמטיבי אחרים, כולל מהירות ממוצעת, חוסר תנועה, מתפתל, ואזור מעברים ^14.

שיטת המינון שפותחה במעבדה שלנו יכולה לחול על כל מחקר שבו תרכובות מסיסים במים מנוהלות לzebrafi אחד או יותרsh. סוכנים תרופתיים רבים אחרים אשר עשוי להפיק תועלת ממתודולוגיה זו כרגע נבחנו בדג זברה. תרכובות שנבדקו בדרך כלל כוללות ניקוטין, chlordiazepoxide, buspirone, וscopolamine, אשר מומס באופן דומה לאתנול; על ידי ערבוב את הכמות המתאימה של החומר הכימי לתוך מים. לכן, ההיקף הכללי של הליך זה הוא הרבה יותר רחב ולא מוגבל לאתנול. יתר על כן, לאחר מינון עם תרופות למספר ימים, משימת האור / חושך היא רק אחד ממבחנים התנהגותיים רבים שיכולים להיות מועסק. לאחר מתן תרופה או במהלך נסיגה, מבחני פופולריים אחרים שניתן לנצלם יכללו את בדיקת טנק רומן צלילת ¹⁵ ובדיקות של התנהגות חברתית כגון shoaling ^16. ההליך הבא מתאר שיטה יעילה להעברה שוב ושוב קבוצות של דגים או דגים בודדים לפתרונות המכילים תרכובת תרופתית של עניין. בנוסף, התהליך של חרדת בדיקה במבחן האור / החושךבקבוצות של דגים שנמצאים בנסיגה לאחר שנחשף ללוחות זמנים של ממשל אלכוהול ארוכים יתואר.

פרוטוקול

כל הנהלים והבדיקות התנהגותיות אושרו על ידי בעלי החיים מחקר האתיקה מועצת המנהלים של אוניברסיטת MacEwan תחת מספר פרוטוקול 06-11-12, אשר עומד במועצה הקנדית להנחיות של הטיפול בבעלי חיים לטיפול ולשימוש בחיות ניסוי.

1. הכינו טנקים מינון, פתרונות, ולוח זמני מנהל

1. הכן לוח זמנים של נטילה כך שבעלי החיים במינון באותה הסביבה ובאותה השעה ביום, כדי למנוע כל בלבול של זמן או הטיית לגירויים חזותיים.
2. להשיג כמה שיותר, 1.5 ליטר, מיכלי ברור זהה השרצה פוליפרופילן כפי שיידרש למספר גדלי קבוצה. קבוצות שימוש של 8 דגים במכל, המאפשר לקבוצות של 2 דגים להיבדק ליום מאוחר יותר בהליך (ראה שלב 3). השתמש בטנק מחזיק אחד וטנק אחד מינון לכל קבוצה (2x מספר כולל של קבוצות).
   1. הנח 400 מיקרומטר מוסיף השרצה בכל הטנקים מחזיקים. Fחולה הטנקים עם מים בסביבה או להפוך מים אוסמוזה בטמפרטורה הנכונה (לדג זברה, 25-28 ° C) שעולה בקנה אחד עם דגי הטמפרטורה בדרך כלל שוכנים ב.
      הערה: לא יכולה להיות אינטראקציות כימיות לא רצויות בין תרופות מסוימות והמרכיבים הכימיים של מים בסביבה שנאגרו. במצב זה, להשתמש במי אוסמוזה הפוכים שנאגרו עם מלחי האקווריום מינימאליים או ללא למתן תרופה, כמו גם לקבוצות ביקורת.
   2. ודא שהטנקים הם בסביבה ניטראלית, כדי למנוע דגי אוויר לגירויים חזותיים חיצוניים במהלך מינון.
3. הכן את פתרון הסמים. מערבבים את הכמות המתאימה של התרופה עם מים בסביבה בטנקי ההשרצה. הכן את פתרון אתנול 0.2% על ידי שילוב של 3 מיליליטר של אתנול בדרגה גבוהה (95% אתנול שאינו מפוגל) עם 1,497 מיליליטר מים. הכן את פתרון אתנול 1.4% על ידי שילוב של 21 מיליליטר של אתנול עם 1,479 מיליליטר של מים.

2. בנוטינג דגים וEthanol מנהל סדר דין

1. דגים נקי בזהירות ממיכלי הגידול שלהם והעברה למכל האחזקה המתאים המכיל את תוסף ההשרצה. באופן אידיאלי, בית הדגים בכנס ההשרצה לחסל קיזוז לגמרי.
2. עם כל הדגים במכלי האחסון שלהם, בעדינות להרים את ההשרצה להכניס מתוך הטנק מחזיק ולמקם אותו לתוך מיכל המתאים הפתרון תרופתי (איור 1 א).
   1. רשום את זמן המינון כנדרש. השתמש 30 דקות בתמיסת אתנול להליך המתוארים כאן.
   2. במידת האפשר, יש עוזרים לעזור עם ההעברה של כל קבוצות הניסוי לפתרון התרופה בו זמנית כדי להבטיח זמן מינון מדויק. לחלופין, להעביר את הקבוצה אחת בכל פעם ולעקוב אחר הזמנים (איור 1 א) המינון של קבוצות בודדות.
3. בתום תקופת המינון הנדרשת, להסיר את הדגים מפתרון אתנול על ידי ההרמה להכניס השרצה בזהירותמתוך פתרון הסמים והצבה בעדינות בחזרה לתוך הטנק מחזיק.
4. בעדינות הנקי הדגים במכלי האחסון ומניח אותם בחזרה לבתי הגידול שלהם עד לפעם הבאה שנקבעה למינון, או הנח את ההשרצה להכניס בחזרה לתוך טנק ההחזקה לחסל רשת.
5. כאמור, במידת האפשר במסגרת הפרמטרים של ציוד לבעלי חיים דיור, בית החיות באותו הטנק ולהוסיף השרצה המשמשת כמכל האחזקה. זה יהיה לבטל קיזוז לגמרי במהלך הליך הממשל.

3. בדיקות התנהגותיות

1. להשיג אור / חושך זירה רחבה 9.5 סנטימטר על סנטימטר 55 ארוך ו9.5 סנטימטר עמוק עם רצפה עמיד למים לבן (איור 1). להדביק נייר שאינו רעיוני עמיד למים לבנים ושחור לקירות הפנימיים של הזירה באמצעות ולקרו, עם מחצית מהזירה מכוסה בלבן וחצי מכוסה בשחור. מלא את הזירה עד לעומק של 5 סנטימטרים עם מים בסביבה בטמפרטורה של 25-28 מעלות צלזיוס. שימורעין טמפרטורה זו בכל בדיקה.
2. פחות על גירויים חזותיים חיצוניים על ידי בניית מתחם שלושה-צדדי לבן לזירה כדי להיות ממוקמת ב. ודא אזור הבדיקות יש לפזר תאורה עילית שאינו גורמת להשתקפויות על פני המים, עדיין הוא מספיק בהיר לתוכנת מעקב תנועה, או פוסט כימות מדריך ל-hoc מתמונות וידאו.
3. הנח את הזירה במתחם ולהגדיר את הפרמטרים הקלטה וניתוח תנועה של תוכנת מעקב התנהגות. הגדר את משך זמן המשפט ל5-15 דקות, בהתאם לשאלת המחקר.
   הערה: כאן, היינו 5 דקות.
4. הובלת הקבוצה של דגים להיבדק לאזור המחקר במכל הגידול ולמקם אותם מחוץ למתחם הזירה. להסתגל הדגים למשך 10 דקות.
5. בעדינות נטו דגים מהקבוצה המתאימה והמקום במרכז האור / הזירה החשוכה, להיות בטוח כדי לשחרר את הדגים כשהוא ממוקם במקביל לצייר של הזירה הארוך לAVOid הטיית הדגים לאור או האזור חשוך.
6. בגין התנהגות הקלטה מייד לאחר החיה הוא שוחרר. צפו לבעיות בתוכנה כל עם מעקב הדגים או לקפיצת דגים או הקפאה. סובב את הזירה 180 מעלות אחרי חצי מהנבדקים נבדקו כדי למנוע כל בלבול כתוצאה מהטיות הנובעות מאשר בסופו של הזירה מכוון לקראת הסוף הפתוח של המתחם.
7. לאחר המשפט הסתיים, בעדינות נטו ולהסיר את הדגים מהזירה לתא מעצר או טנק בית גידול.

4. ניתוח

1. לבחון את משך זמן באור לעומת אזורים כהים. לכל קבוצה וכל דגים, להשיג את הזמן היחסי בילה באזורים הבהיר וכהים ולנתח באמצעות דגימה אחת -test t (או המבחן Wilcoxon rank test לנתונים פרמטרית; הבדל מ( מחצית מכלל זמן המשפט) 150 שניות) כדי לקבוע אם קבוצות מעדיפות תחום אחד על פנים השני באופן משמעותי.
2. כדי להשוות את העדפות, לחשב prefeמדד לורנס על ידי הפחתת המשך הזמן באזור האור מהזמן בילה באזור החשוך ולהשוות הבדלים בין קבוצות. בדיקות טריקו ניתן להשתמש כדי להשוות בין שתי קבוצות. השוואה בין קבוצות מרובות עם ניתוח חד-כיווני של שונות ניצול מבחן פוסט הוק HSD של Tukey שם (מבחן או קרוסקל-וואליס בהשוואה של דאן מרובה מבחן פוסט הוק לנתונים פרמטרית) הכרחי.
3. שקלו את המהירות, מספר מעברי אזור, מתפתלים, וחוסר תנועה על פני קבוצות. משתמש בניתוח חד-כיווני של שונות ניצול מבחן פוסט הוק HSD של Tukey שם (מבחן או קרוסקל-וואליס בהשוואה של דאן מרובה מבחן פוסט הוק לנתונים פרמטרית) הכרחי.

תוצאות

כדי לשמור על דיוק ושליטה במחקרים פרמקולוגיים עם דג הזברה חשוב לעת את משך הזמן של ממשל אתנול באופן עקבי ומדויק כפי שתוארו לעיל. ההליך שלנו יכול להגדיל את קלות ותפוקה של הליך המינון. הממשל של אתנול על לוח זמנים או שבועי בולמוס או יומי-מתון הביא לרמות חרדה השתנו, שנמדדו באמצעות האור / בדיקה כהה, בהשוואה לקבוצת ביקורת. כאשר נבדקו יומיים לאחר המינון האחרון, דג הזברה בקבוצת הביקורת (שלא קיבלה כל אלכוהול, אך עדיין הועברו למכלי מינון) מוצג הדפוס הצפוי של התנהגות, עם ההוצאות של דגי שליטה ב...

דיון

מחקרים קודמים הכוללים מתן תרופה בדג זברה פשוט הסתמכו על קיזוז דגים להעביר אותם מהטנק בביתם לפתרון התרופתי ^12,16. בנוטינג לא תמיד עולה בקנה אחד ולעתים לוקח יותר זמן מהצפוי עקב תגובת הבריחה של דג הזברה, שבו יש השתנות אישית משמעותית. שיטות העברה מסורתיות, בעוד שימושי, ניתן לשפר על ידי הפחתת כמות הזמן כולל הדגים לבלות מחוץ למים, כמו גם להקטין את הכמות של השתנות בזמן העברה בין בעלי החיים. בנוסף לשיפור מעשיות, שיטה זו מאפשרת לחוקרים למינון קבוצות גדולות של דגים בו זמנית בפתרו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מערכת בית למדף עם שלושה מדפים	Aquatic Habitats	N/A
מיכל השבחה של 1.5 L עם מחיצה של 400 μm	Aquatic Habitats	N/A
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A
תוכנת מעקב תנועה Ethovision XT	Noldus Information Technology
פיפטה	Eppendorf Canada
זירת אור/חושך	התאמה אישית		לבנות בהתאם לתיאור הפרוטוקול. רוחב 9.5 cm, עומק 9.5 cm, אורך 55 cm.