באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי

סיכום

התחרות בסטרפטוקוקוס פנאומוניה מתווכת על ידי בקטריוצין, פפטידים אנטי-מיקרוביאליים קטנים עם פעילות מעכבת כלפי פנאומוקוק ומינים קשורים אחרים. כאן אנו מתארים בדיקת שכבת-על חיידקית אופטימלית המאפשרת אפיון של פעילות בקטריוצין וספקטרום מעכב, חסינות ספציפית לבקטריוצין וזיהוי פפטידים לחישת מניין מופרשים.

תקציר

Streptococcus pneumoniae מתיישב בקהילה הפולימיקרוביאלית המגוונת ביותר של הלוע האף, שם עליו להתחרות באורגניזמים תושבים. הראינו שפפטידים אנטי-מיקרוביאליים (בקטריוצינים המיוצרים על ידי חיידקים) מכתיבים את התוצאה של האינטראקציות התחרותיות האלה. כל זני הפנאומוקוק ברצף מלא מכילים לוקוס bacteriocin-l ike peptide (blp). לוקוס ה-blp מקודד למגוון של בקטריוצינים מגוונים ולכל הרכיבים השמורים ביותר הדרושים לוויסות שלהם, עיבודם והפרשתם. מגוון הבקטריוצינים המצויים באזור חסינות הבקטריוצין (BIR) של הלוקוס הוא תורם עיקרי לתחרות פנאומוקוקית. יחד עם הבקטריוצינים נמצאים גנים של חסינות ב-BIR והם נחוצים כדי להגן על התא המייצר מפני ההשפעות של הבקטריוצין שלו. בדיקת שכבת העל היא שיטה מהירה לבחינת מספר רב של זנים לאינטראקציות תחרותיות המתווכות על ידי בקטריוצינים. בדיקת שכבת העל מאפשרת גם אפיון של חסינות ספציפית לבקטריוצין, וזיהוי פפטידים לחישת מניין מופרשים. הבדיקה מתבצעת על ידי חיסון מקדים של צלחת אגר עם זן שייבדק לייצור בקטריוצין ואחריו מריחת שכבת אגר רכה המכילה זן שייבדק לרגישות לבקטריוצין. אזור פינוי המקיף את הדקירה מצביע על כך שזן הכיסוי רגיש לבקטריוצינים המיוצרים על ידי הזן שחוסן. אם לא נצפה אזור פינוי, או שזן הכיסוי חסין מפני הבקטריוצינים המיוצרים או שהזן שחוסן מראש אינו מייצר בקטריוצינים כדי לקבוע אם לוקוס ה-blp מתפקד בזן נתון, ניתן להתאים את בדיקת הכיסוי כדי להעריך הפרשת פרומון פפטיד על ידי הזן שחוסן. במקרה זה, נעשה שימוש בסדרה של ארבעה זני lacZ-reporter עם ספציפיות פרומון שונה בשכבת-העל.

מבוא

Streptococcus pneumoniae, קולוניאלי משותפת של קהילת polymicrobial של לוע האף, הוא מסוגל להתחרות עם pneumococci אחר ומינים קרובים באמצעות הייצור של פפטידים מיקרוביאלית מיוצרים bacterially (bacteriocins). כל זן דלקת ריאות באופן מלא רצף שנבחן עד היום מכיל גרסה של מוקד acteriocin- ב אייק l eptide עמ ', BLP. ייצור Bacteriocin ידי pneumococcus הודגם להיות חשוב בתוצאות הן במבחנה בתחרות vivo ^1-4. דינמיקה תחרותית מושפעת מהביטוי של bacteriocins המגוון יחד עם חלבוני חסינותו מקור בתגובה לפרומון פפטיד ספציפי. אינדוקציה של מוקד BLP נשלטת על ידי מערכת חישת מניין שבו פרומון פפטיד, BlpC, נקשר לקינאז החיישן, BlpH, ויוזם מפל איתות וכתוצאה מכךשעתוק של ^5,6 מוקד BLP. ישנם ארבע וריאציות allelic של BlpC שכל נקשרים לBlpH המקור שלה ^6. לתא כדי לשרוד את ההשפעות של bacteriocin משלו, הגנים המקודדים את חלבוני חסינותו מקור מתועתקים באותו אופרון ככל אחד מהגנים bacteriocin. הרג מתרחש אם זן מתחרה הוא לא מסוגל upregulate מוקד BLP בתגובה לפרומון אקסוגניים או, אם הזן חסר את גן החסינות הספציפי הנדרש להגנה. המורכב טרנספורטר, BlpAB נדרש להפרשה והעיבוד של פרומון פפטיד ופפטידים bacteriocin ^2,4. לאחרונה, הוכח שחלק משמעותי מזני דלקת ריאות הם "רמאים", כלומר יש להם מוטציה שמורה בגן blpA אשר הופך אותם מסוגל להפריש פרומונים וbacteriocins ^1,2. זנים אלה מסוגלים להגיב לBlpC אקסוגניים ² מופרש על ידי צהלהזנים משעממים המאפשרים הייצור של חלבוני חסינות.

אמנם, הכנות גולמי של bacteriocins מsupernatants ניתן להכין מזני מפיק באמצעות צעדי שיטות ביוכימיות להשגת טוהר, גישה זו אינה שימושית לסינון אוסף גדולה של בידודים ואם רמת ביטוי bacteriocin היא נמוכה בתרבויות מרק גדל ^{2,7- 9.} Assay הכיסוי משמש כדרך מהירה כדי לחקור את הדינמיקה התחרותית בין זנים שעלולים להתקיים במבחנה. לשם כך, מתח דלקת ריאות הוא על צלחת אגר ואפשרו לגדול כדי להשיג ריכוזי חיידקים מקומיים מספיקים לאינדוקציה של מוקד BLP-מחוסן מראש. זן שני הוא מחוסן אז לפתרון אגר רך מותך אשר לאחר מכן מיושם על זן מחוסן מראש לבדיקת רגישות. כדי להעריך את הפעילות של מוקד BLP (עצמאית של פעילות מעכבת), יכולים להיות מעולף זנים בסדרה של הרי זני כתב BlpC שתוארו קודם לכן. זנים אלו נבנו כדי להכיל אחד משלושה אללים blpH שונים שמגיבים לשלושה פרומונים BlpC הנפוצים ביותר מופרשים על ידי pneumococci. יש לי זני כתב גן lacZ משולב שנמצא תחת השליטה של אמרגן תלוי BlpH ולבצע מחיקה בגן blpC המונע גירוי עצמי ^10,11.

פרוטוקול

.1 הכנת הזנים מפיק

1. Streak זן דלקת ריאות להיבדק לייצור bacteriocin על 5% צלחת אגר סויה tryptic דם כבשים ממניות מקפיא -80 מעלות צלזיוס.
   הערה: השימוש בצלחות דם לצמיחה ראשונית של הזן להיבדק לעיכוב מגדיל מאוד את שחזור של assay. בנוסף, זנים שאינן דלקת ריאות אחרות המייצרים bacteriocins ניתן להשתמש למרות שתנאי גידול, ייתכן שיצטרכו להיות שונה לאורגניזם ספציפי. יש לנו להשתמש mitis Streptococcus וקטיס Lactococcus בassay הכיסוי בהצלחה.
2. דגירה את הצלחת למשך הלילה (O / N) על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
3. לאחר הדגירה של זן המפיק, להכין הצלחת אגר סויה tryptic (TSA) על ידי pipetting 3,000 4,000 יחידות של קטלאז על צלחות המכילות 25 מ"ל של TSA ולהפיץ את פתרון קטלאז באמצעות חרוזים זכוכית סטרילית. בואו יבש הצלחת במשך כ10 דקות תחתארון בטיחות ביולוגי.
4. לאסוף כמות נראית לעין של חיידקים על קצה פיפטה. לדקור את קצה פיפטה לתוך צלחת TSA המיובש.
   הערה: יותר מ מתח מפיק אחד יכולה להיות נדקרת לתוך צלחת TSA יחידה. חשוב חלל את הדקירות, כך שהילות וכתוצאה מכך אינן חופפות.
   1. במידת האפשר, כולל ידוע bacteriocin מפיק כביקורת חיובית ולהתאמץ כדי לשמש בשכבה כביקורת שלילית.
      הערה: בקרות חיוביות ושליליות הן כבר פורסמו בעבר, והם זמינים לפי בקשה ^10.
5. דגירה צלחת TSA מכיל דקירות מרובות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ למשך 6 שעות.

2 מניות גליצרול ביצוע של הזנים הכיסוי

1. הכן מניות גליצרול (תרבויות גדלו שלב אמצע מעריכי ואז מאוחסנות ב-80 מעלות צלזיוס לאחר התוספת של גליצרול) לפני היום של assay הכיסוי. לחסן 5-10 מושבות של str דלקת הריאותעין להיבדק לרגישות או הפרשת פרומון במדיום טוד יואיט עם שמרי 0.5% תמצית (THY).
   הערה: בנייה של כתבים מושרה BlpC כבר תוארה בעבר ² וזנים זמינים לפי בקשה.
2. דגירה 5-10 מושבות בצינורות זכוכית עם 5 מ"ל של THY עם מכסים סגורים היטב באמבט מים 37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד.
3. דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים OD ₆₂₀ של 0.3-0.5.
   הערה: זה ייקח כ 4-5 שעות בהתאם לזן המשמש.
   1. בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים לפני מדידת OD.
4. אם הניסוי לא ניתן לבצע באותו היום או הזן ישמש פעמים רבות בעתיד, להפוך את מניות גליצרול ולחדש את הניסוי במועד מאוחר יותר. עבור מניות גליצרול, להוסיף גליצרול לתרבויות לריכוז סופי של 20%. תרבויות Aliquot לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. הערה: דוגמאות יכולות להיות שלהנמצאת בבמשך חודשים ב-80 מעלות צלזיוס. אם לא עושה מניות גליצרול, להשתמש דגימות ישירות לassay כיסוי.

3 הכיסוי Assay

1. רק לפני כיסוי יישום, לערבב את מרכיבי הכיסוי. בצינור חרוטי 15 מ"ל, להוסיף 5 מ"ל שלך, 3,000-4,000 U של קטלאז, ו200 μl של תרבות מרק מתח כיסוי שגם גדלה באותו יום או מניית גליצרול של התרבות שהיה מופשר בטמפרטורת חדר. אם אתם משתמשים בזן הכתב, להוסיף 50 μl של X-gal (40 מ"ג / מ"ל) לתערובת הכיסוי. השתמש בצינור חרוטי אחד לכל צלחת.
2. לאזן תערובת כיסוי בטמפרטורת חדר לפני תוספת של TSA המותך.
3. הסר את צלחת TSA עם מתח נדקר מחממה. ממסים TSA המוצק במיקרוגל ולשמור על 55 ° C אמבט מים עד מוכן לשימוש. הוסף 3 מ"ל של TSA המותך עם אגר 1.5% מקורר 55 ° C כדי כיסוי תערובת.
   1. מכין את תערובת הכיסוי מייד לפני pipetting, התערובת תתחיל לחזק מאודבמהירות. הערה: אם השכבה מתחילה לבסס לפני הציפוי, התוצאות תהיה uninterpretable.
4. מערבבים את תערובת הכיסוי על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים עם 5 מ"ל pipet נזהר שלא להכניס בועות לתוך התערובת. לאט לאט פיפטה תערובת כיסוי ישירות על צלחת TSA נדקרה. שמור את הצלחת על המעבדתיים למאפשרות אגר להקשיח כמה דקות.
   1. אל תסובב את הצלחת כדי לפזר את תערובת הכיסוי, זה ימשוך צמיחה מהתרבות נדקרה לכיסוי.
5. בזהירות להניח צלחת TSA עם כיסוי ל37 חממת ° C המכילה 5% CO ₂ O / N (כ 16-18 לשעה).
6. שים לב ללוחות לאחר צמיחת הלילה. הצלחות צריכה להראות אטום מצמיחה של זן הכיסוי למעט באזורים שבם איתות עיכוב או פרומון התרחשה. אלה יופיעו כאזורי או ברורים או כחולים סביב המתח נדקר, בהתאמה.
   שים לב: למרות measurements של הקוטר של קרחת יער כחול או יכול להיות שנקבע להערכה כמותית, הבדלים בקוטר יכולים גם משתנים בהתאם לכמות חיידקים שנדקרה לתוך הצלחת. Assay הכיסוי הוא assay איכותי, כל הערכה כמותית יש לפרש בזהירות. כל סליקה גלויה בהשוואה לביקורת השלילית נחשבת כפעילות.

תוצאות

ישנן שתי תוצאות אפשריות בassay הכיסוי. זה צריך להיות אפשרי לראות צמיחה של הזן נדקר לאחר דגירה הלילה. באיור 1 א, מתח הכיסוי רגיש לbacteriocins שיופקו. אזור של פינוי יכול להיות דמיין המקיף את המתח נדקר. בנוסף, מתערבל של המתח נדקר לתוך תערובת הכיסוי אפשרי ושניתן לראות באיור 1 א. באיור 1 ב, מתח הכיסוי אינו חסין מפני bacteriocins שמופרש כאמור על ידי היעדר הילה המקיפה את הדקירה. אפשר גם שהמתח נדקר לא מפריש bacteriocins. עבור assay האיתות, שתי תוצאות שונ...

דיון

assay הכיסוי זוהי דרך מהירה כדי לקבוע את הטווח של פעילות עבור יצרני bacteriocin ולהפגין אינטראקציות תחרותיות שעלולות להתרחש בין זני דלקת ריאות. Assay הכיסוי יכול להיות מותאם לשימוש עבור הקרנת זנים מרובים לייצור bacteriocin על צלחת אחת. יש לנו הוקרנו בהצלחה אוספי מתח גדולים עם assay זה על ידי שימוש במשכפל 48 פינים לחסן צלחות SBA ממחצית מצלחת 96 היטב. לאחר דגירה הלילה, צמיחה מועברת לצלחת TSA באמצעות המשכפל ופירסינג המשטח אגר של הצלחת עם הסיכות של המשכפל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגר סויה טריפטיקז עם 5% דם כבשים	פישר	B21261X	לגידול מתרביות מקפיא
קטלאז	סיגמא	C100-500 מ"ג	4,741 יחידות לצלחת
מרק טוד יואיט + תמצית שמרים (THY)	פישר	DF0492-17-6	30 גרם THB, 5 גרם תמצית שמרים, 1 ליטר ddH2O אוטוקלאב
מרק סויה טריפטיקז + צלחות אגר (TSA)	פישר	B11768	30 גרם TS, 15 גרם אגר, 1 ליטר ddH2O אוטוקלאב
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal)	Sigma	B4252-50MG	מתמוסס בצלחות פטרי דימתילפורממיד
ספקטרופומטר			מודד את ה-OD620 של תרביות
אמבט
37 מעלות; אינקובטור C עם צינור
15 מ"ל

פישר FB0875712 37 °מים C חרוטי 5% CO2