אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במערכת רדיו telemetric להקליט פרמטרים לב וכלי דם בחולדות חוט השדרה T4 transected שמונה שבועות לאחר תאי גזע עצביים בגזע מוח העוברי השתלה לאתר הנגע. טלמטריה היא טכניקה מתקדמת לאבחון תפקוד לב וכלי דם אצל חולדות שנפגעו נעו בחופשיות מודעת חוט השדרה באופן מדויק.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מערכת רדיו-telemetric לפקח פונקצית לב וכלי דם אצל חולדות עם חוט השדרה חיתוך רוחב ועוברי גזע עצבי שתלי סלולארי
במאמר זה
סיכום
תקציר
פגיעה גבוהה בבית חזה או בצוואר הרחם בחוט השדרה (SCI) יכולה להוביל לבעיות בתפקוד לב וכלי דם. כדי לפקח על פרמטרים לב וכלי דם, השתלנו קטטר מחובר למשדר רדיו לתוך עורק הירך של חולדות שעברו חיתוך רוחב חוט השדרה T4 עם או בלי השתלה של תאי גזע עצבי עובריים המופק מגזע המוח לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק. בהשוואה לשיטות אחרות, כגון החדרת צינורית או זנב שרוול, טלמטריה היא יתרון ברציפות לפקח על לחץ דם וקצב לב בבעלי חיים לנוע בחופשיות. הוא גם מסוגל רכישות נתונים מרובות לטווח ארוך. בחולדות חוט השדרה נפגע, נתוני לב וכלי דם בסיסיים בתנאי בלתי מרוסן ודיסרפלקסיה האוטונומי בתגובה להתנפחות מעי גס נרשמו בהצלחה. בנוסף, ניתן להשוות פרמטרים לב וכלי דם לפני ואחרי SCI באותו החולדה אם משדר הוא מושתל לפני חיתוך רוחב חוט השדרה. מגבלה אחת של telemet תארהליך ר"י הוא שההשתלה בעורק הירך עשויה להשפיע על אספקת הדם לhindlimb ipsilateral.
מבוא
תפקוד לקוי של לב וכלי דם מתרחש לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI) ברמות גבוהות. זה בא לידי ביטוי בלחץ דם והפרעות קצב לב במנוחה, ירידה בלחץ דם orthostatic, תת לחץ דם כתוצאה ממאמץ, ודיסרפלקסיה האוטונומי מאופיינים באפיזודות של יתר לחץ דם וקצב לב איטי בתיווך baroreflex בתגובה לגירויים חושיים מתחת לרמת פגיעת 1,2. תסמינים אלה מפריעים לחיים היום היום של חולי כבל נפגע בעמוד השדרה. לפיכך, חשוב לקבוע כלים יעילים לחקירה של שינויי לב וכלי דם בבעלי חיים עם SCI וטיפולים ניסיוניים.
לחקור פונקצית לב וכלי דם בבעלי חיים, כמה טכניקות שמשמשות לניטור לחץ דם וקצב לב. ניתן להקליט פרמטרים לב וכלי דם מרכזי על ידי החדרת צינורית וטלמטריה, ואילו יכולים להיות מועסקים זנב אזיקים לא פולשנית למדידת לחץ דם היקפי 3. בהשוואה לשיטות, טלה אחריש metry היתרון העיקרי שמאפשר הקלטה רציפה בבעלי חיים לנוע בחופשיות וניטור ארוך טווח של פונקצית לב וכלי דם 4. במודלים של בעלי החיים SCI, השינויים בלחץ דם היקפי לאחר גירוי ניסיוני עשויים שלא להיות גדולים מספיק כדי להיות מזוהה. בהתאם לכך, טכניקת ניטור לב מתאימה יש לבחור בעלי חיים עם SCI.
במחקר הנוכחי, מערכת רדיו telemetric הוצגה לפקח פונקצית לב וכלי דם בחולדות מבוגרות לאחר חיתוך רוחב חוט השדרה מלא. חולדות קיבלו שתלים של עכברוש syngeneic יום עוברי 14 (E14) תאי גזע עצביים שמקורם בגזע המוח (BS-NSCs) באתר הנגע. חולדות עם פציעה ולא השתלה וחולדות נאיביות, ללא פגע שימשו כבקרה. ההליך של טלמטריה כולל עיקור משדר והשתלה (איור 1), הקלטה של פרמטר לב וכלי דם בסיסי, תגובות מושרה התנפחות מעי גס, וניקוי משדר ואחסון.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC). הנחיות NIH לטיפול בבעלי חיים במעבדה ובטיחות ורק אחריו. בעלי חיים עם ניתוחים טופלו כראוי למזעור כאב ואי נוחות.
1 חוט השדרה Curgery והארכה נייד
- מכשירי ניתוח החיטוי לפני כל הניתוחים. השתמש חם ביד מעקר (כלי מדע פיין) כדי להסיר פתוגנים ומזהמי חיידקים ממכשירים בין נהלים על בעלי חיים שונים. השתמש בכפפות סטריליות כירורגיות, שמלה, ווילאות במהלך הניתוח. להעסיק טכניקה ניתוחית ספטית לכל הליך כירורגי.
- הרדימי נקבת פישר 344 חולדות עם שילוב (2 מ"ל / קילוגרם) של קטמין (25 מ"ג / מ"ל), xylazine (1.3 מ"ג / מ"ל), וacepromazine (0.25 מ"ג / מ"ל) מנוהלות באמצעות זריקת intraperitoneal (IP).
- לגלח את אזור הגב ולנקות את העור שוב ושוב עם פולידין ואתנול.
- חותך את העור באמצעות מס '10 להב ובוטות לנתח שכבות שרירים. השתמש באזמל כדי לבודד את החוליות, לחשוף את החוליה T3, ולבצע laminectomy גב באמצעות rongeurs דק שקצהו.
- לחתוך את הדורה אורכים או תחצה את חוט השדרה ברמת T4 באמצעות שילוב של המספריים ומייקרו אספירציות iridectomy ליצור פער rostrocaudal כ 1 מ"מ בין גדמי חוט השדרה.
- המתן כ 1 - 2 דקות עד שהדימום באופן מלא מפסיק, אז שרירי תפר עם 3-0 Vycril ולסגור את העור עם קליפים פצע.
- הזרק Lactated Ringer של (5 מ"ל), עצירות (0.035 מ"ג / קילוגרם), ואמפיצילין (33 מ"ג / קילוגרם) תת עורי מייד לאחר הניתוח ולשמור על חולדות בחממה חמה עד ער.
- הזרק רינגר ופתרון אמפיצילין פעם ביום עד 10 ימים, ועצירות פעמיים ביום למשך 3 ימים או עד שסימנים של כאב ומצוקה ייעלמו. אל תחזרו בעלי חיים לחברתם של בעלי חיים אחרים, עד fully התאושש.
- באופן ידני לרוקן את שלפוחית השתן פעמיים ביום במשך כשבועיים, עד להקמת שלפוחית השתן רפלקס התרוקנות, ולאחר מכן רוקן את שלפוחית השתן פעם ביום בכל רחבי ההישרדות במידת צורך.
- שבועיים לאחר מכן, שוב להרדים חולדות SCI כפי שתואר לעיל ומחדש לחשוף את אתר נגע חוט השדרה. שמור את הדורה סגורה כדי לשמור על תאים מושתלים באתר הנגע.
- הזרק 10 μl של פתרון תא (3.5 × 10 5 μl), שנאסף מעוברי עכברים מהונדסים GFP בכל מקום E14 והמשובץ בפיברינוגן וטרומבין 5,6, למוקד של חלל הנגע והממשק מקורי ואת הזנב של נגע עם הזרקה מרובה אתרים, באמצעות micropipette זכוכית משך עם קוטר פנימי של 40 מיקרומטר, מחובר למזרק המילטון.
- תפר את שכבות שרירים ולסגור את העור עם קליפים פצע.
- לבצע הזרקת ניתוח הודעה וטיפול בשלפוחית השתן, כמתואר בצעדים 1.6-1.8.
- שבוע יהיהזלוף הקדמי, להזריק 0.5% Fluorogold (FG, 0.4 מ"ל במים מזוקקים) intraperitoneally לנוירונים preganglionic אוהדים תווית retrogradely בחוט השדרה 7.
2 משדר השרשה
- משרים transmittersin 2% פתרון glutaraldehyde (4 מ"ל של glutaraldhyde 50% ב96 מ"ל מים מזוקקים) לפחות 1 - 2 שעה (עד 10 hr) בטמפרטורת חדר למשך העיקור.
- לשטוף ביסודיות עם משדרים מלוחים 0.9% סטרילי 3 פעמים ולאחסן אותם במלח עד לשימוש (לא יותר מ 1 שעה).
- שמונה שבועות לאחר השתלת E14 תא (לאחר פציעת 10 שבועות), reanesthetize החולדות שעברו SCI עם או בלי השתלת תא וחולדות שליטה נאיביות.
- לגלח את האזור וhindlimbs בטן. נקה את העור עם פולידין. מניחים את החולדה על שולחן הניתוחים במצב שכיבה.
- לחתוך את העור על ירך בטן והפנימית הגחון בצד ימין באמצעות סכין # 15.
- לחתוך דרך יםרקמות חיבור ubcutaneous לחשוף החבילה של כלי הירך ועצב באמצעות מספריים קטנים.
- הפרד את עורק הירך מהווריד והעצב באמצעות מלקחיים בסדר עם טיפים מעוגלים.
- שים שלושה תפרי משי מתחת לעורק ולהפוך את קשר רופף בכל תפר.
- החל 0.1 מ"ל לידוקאין (2%) על פני השטח של העורק לעורר התרחבות לצנתור שלאחר מכן.
- אבטח את ספינת distally עם קשר משי קבוע ובלוק זמני proximally על ידי מתיחת תפר משי רופף.
- לנקב את העורק באמצעות מחט מעוקלת 20 מד והכנס את קצה צנתר telemeter (באורך של 8 סנטימטר) באמצעות כלי הוספת קטטר.
- הכנס קטטר rostrally עד 4 סנטימטר ובכך למקם את הקצה באב העורקים החזי.
- לעגן את הצנתר בתוך כלי על ידי קשירת שלושה תפרי משי סביב עורק הירך.
- הפוך כיס תת עורי לאורך האגף בין קצה הזנב של בית חזה ולאהוא הארכת הגולגולת ביותר של הטווח של הברך עם מספריים קהים.
- הכנס את גוף משדר לכיס והתפר לרקמות חיבור המקיפות את המשדר, כדי למנוע תנועה מוגזמת.
- לתפור את העור עם מס '6 חוט משי.
- הזרק Lactated Ringer של (5 מ"ל), עצירות (0.035 מ"ג / קילוגרם), ואמפיצילין (33 מ"ג / קילוגרם) תת עורי מייד לאחר הניתוח ולשמור על חולדות בחממה חמה עד ער.
.3 בסל ממוצע עורקים לחץ (MAP) ודופק הקלטה (HR)
- כבר ביום אחד לאחר השתלת משדר, לשים את חיה אחת על משטח המקלט ולהפוך את המשדר ב. חכה לי סביב 10 - 15 דקות להרגיל את בעל החיים ולייצב את הפרמטרים לב וכלי דם.
- MAP הרשומה מנוחה ומשאבי אנוש, אשר נגזרים מלחץ דם דופק עם נתוני מערכת רכישה ממוחשבת לשעה לפחות 1. לאסוף נתונים כל 5 שניות.
- לפקח עלimals ברציפות ולהסיר נקודות נתונים במהלך המופע של התכווצויות נראות לעין. לכל בעל חיים, נקודות נתונים ממוצעת לקבלת ערכים ממוצעים.
.4 מעי גס התנפחות-induced האוטונומי דיסרפלקסיה
- לרסן את החולדות מורכבים NSC או שליטת SCI במגבת מסופקת עם כדורי מזון בתוך על מקלט משדר. בדרך כלל חולדות יכולות להישאר בשיתוף פעולה במהלך ההליך.
- הכנס קטטר שקצהו בלון לטקס לתוך פי הטבעת למשך כ 2 סנטימטר ולאבטח אותו לזנב עם קלטת 8.
- הפעל את המשדר והמתן ל10 - 15 דקות מאפשרות לחץ הדם לחזור לנקודת התחלת preinsertion.
- לגרום להתנפחות מעי גס על ידי אינפלציה של הכדור הפורח מעל 10 שניות עם 1.4 מ"ל של אוויר 1 דקות לאט, כדי ליצור לחץ של כ 30 מ"מ כספית.
- הרשומה MAP ודקות HR 1 לפני, 1 דקות במהלך, ו1 דקות לאחר התנפחות מעי גס; נתונים לדוגמה בכל 3 שניות במהלך הליך 3 דקות.
- בצע 2 - 3 ניסויים לכל בעל חיים עם לפחות 15 התאוששות מרווח דק בין שני ניסויים.
- בעלי חיים מנת יתר (IP) עם שילוב הרדמה במינון כפול שתואר לעיל, אם אין הערכה נוספת. Perfuse בעלי חיים עם מי מלח ואחריו paraformaldehyde 4%.
- לכל בעל חיים, בממוצע הערכים לפני ובמהלך התנפחות מעי גס בהתאמה; לחשב את ההפרש בין נקודת התחלה ומושרה התנפחות MAP ומשאבי אנוש שינויים עבור כל משפט; ממוצע מעל 2 - 3 ניסויים להשגת ערכים ממוצעים.
.5 משדר ניקוי
- הסר את המשדר מהגוף של בעלי החיים לאחר הרדמה אבל לפני זלוף. משרים מייד בכוס מלאה במים מזוקקים עד ניקוי; להימנע מייבוש של מכשיר telemeter.
- העבר את telemeter עד 1% פתרון Terg-A-Zyme ניקוי אנזימטי (מים L / 10 ז) ל24 שעות בטמפרטורת חדר.
- Regel קצה צנתר משדר עם מחט 30 מד בוטהמחובר למזרק Regel.
- לייבש היטב את המשדר באמצעות רקמות רכות מקופלות ולאחסן אותו במגש הפלסטיק המקורי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש בטכניקת טלמטריה שתוארה לעיל, הקלטנו בהצלחה פרמטרים לב וכלי דם בבעלי חיים כבל נפצע בעמוד השדרה. בבעלי חיים עם SCI לבד, MAP הופחת באופן משמעותי ואילו HR גדל לעומת בעלי חיים תמימים, עולים בקנה אחד עם דיווחים קודמים 9. בבעלי חיים עם BS-NSC השתלה, MAP ומשאבי אנוש פנה רמות שנמדדו בבעלי חיים תמימים (איור 2). במהלך התנפחות מעי גס, עכברוש נחשב dysreflexic אם הגירוי המזיק גרם לעליה בMAP וירידה ב3,8 HR. יתר לחץ דם אפיזודי וברדיקרדיה בתיווך baroref...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
באופן מסורתי, צינורית נוזל מילא מוכנסת לתוך העורק ומחוברת למתמר לחץ להקליט פרמטרים לב וכלי דם כתמונת מצב סופני בכל חיה 11. ברציפות לפקח על ביצועי לב וכלי דם במשך זמן רב, מערכות רדיו telemetric מועסקות במעבדות רבות. כלי מעודן יותר זה יכול להקליט את לחץ דם במודע, נע בחופשיות בעלי חיים. בהשוואה לצנתרי נוזל מילא, טלמטריה נחשבת טכניקה מתקדמת יותר על מנת להעריך במדויק את תפקוד לב וכלי דם בבעלי החיים SCI. למרות שבמחקר הנוכחי משדר הושתל רק 1 יום לפני ההקלטה, זה יכול להיות מושתל...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לי המחברים אין לחשוף.
תודות
העבודה נתמכה על ידי מענקים מ-NIH/NINDS (NS054883), קרן קרייג ה. נילסן (280072), ומינהל החיילים המשוחררים והארגון הקנדי לחקר עמוד השדרה. אנו מודים למרכז המשאבים והמחקר של חולדות, אוניברסיטת מיזורי, קולומביה, מיזורי, על אספקת חולדות GFP.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פיברינוגן (חולדה) | Sigma | F6755-25MG | שעתיים ב-37 oC לפירוק |
| תרומבין (חולדה) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle ב-10 מ"מ CaCl2 |
| 1% Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | תמיסה אנזימטית לניקוי טלמטר |
| פלואורוגולד | פלואורוכרום | Dissovle במים מזוקקים והימנעות מאור | |
| טלמטר (PA-C40) | מערכת | ||
| של מדעי הנתונים | ממריץ אותות בינלאומי, מטריצת חילופי נתונים, מקלטים, מוניטור ייחוס לחץ סביבתי | ||
מקורות
- Krassioukov, A. V., Furlan, J. C., Fehlings, M. G. Autonomic dysreflexia in acute spinal cord injury: an under-recognized clinical entity. J Neurotrauma. 20, 707-716 (2003).
- Lindan, R., Joiner, E., Freehafer, A. A., Hazel, C. Incidence and clinical features of autonomic dysreflexia in patients with spinal cord injury. Paraplegia. 18, 285-292 (1980).
- Inskip, J. A., Ramer, L. M., Ramer, M. S., Krassioukov, A. V. Autonomic assessment of animals with spinal cord injury: tools, techniques and translation. Spinal Cord. 47, 2-35 (2009).
- Mayorov, D. N., Adams, M. A., Krassioukov, A. V. Telemetric blood pressure monitoring in conscious rats before and after compression injury of spinal cord. J Neurotrauma. 18, 727-736 (2001).
- Hou, S., Tom, V. J., Graham, L., Lu, P., Blesch, A. Partial restoration of cardiovascular function by embryonic neural stem cell grafts after complete spinal cord transection. J Neurosci. 33, 17138-17149 (2013).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Akhavan, M., Hoang, T. X., Havton, L. A. Improved detection of fluorogold-labeled neurons in long-term studies. J Neurosci Methods. 152, 156-162 (2006).
- Maiorov, D. N., Fehlings, M. G., Krassioukov, A. V. Relationship between severity of spinal cord injury and abnormalities in neurogenic cardiovascular control in conscious rats. J Neurotrauma. 15, 365-374 (1998).
- Laird, A. S., Carrive, P., Waite, P. M. Cardiovascular and temperature changes in spinal cord injured rats at rest and during autonomic dysreflexia. J Physiol. 577, 539-548 (2006).
- Phillips, A. A., Krassioukov, A. V., Ainslie, P. N., Warburton, D. E. Baroreflex function after spinal cord injury. J Neurotrauma. 29, 2431-2445 (2012).
- Osborn, J. W., Taylor, R. F., Schramm, L. P. Determinants of arterial pressure after chronic spinal transection in rats. Am J Physiol. 256, 666-673 (1989).
- Rabchevsky, A. G., et al. Effects of gabapentin on muscle spasticity and both induced as well as spontaneous autonomic dysreflexia after complete spinal cord injury. Front Physiol. 3, 329(2012).
- Hou, S., Lu, P., Blesch, A. Characterization of supraspinal vasomotor pathways and autonomic dysreflexia after spinal cord injury in F344 rats. Auton Neurosci. 176, 54-63 (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
