Method Article

ההדמיה confocal זמן הפקיעה הוא אמצעי יעיל להערכת Cytocompatibility מרוכבי שיניים

DOI:

10.3791/51949

⸱

November 9th, 2014

 ,  ,  , 
1Laboratoire des Multimatériaux et Interfaces, UMR CNRS 5615, Université Lyon1, 2UFR d'Odontologie, Université Lyon1; Service de Consultations et de Traitements Dentaires, Hospices Civils de Lyon, 3UFR d'Odontologie, Université Paris Diderot; Service d'Odontologie, APHP, Hôpital Rothschild

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההיבט הנחקר ביותר של ההתאמה הביולוגית של חומרים מרוכבים שיניים הוא ההדמיה שלהם הרעילה 3D CLSM זמן לשגות בשילוב עם כימות אות ניאון מאפשרת הערכה רגישה של גורל התא לאורך זמן. ניצול שיטה זו יכול להיות כלי יעיל להערכת cytocompatibility של חומרים מרוכבים שיניים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה מקובל כי אינטראקציה בחומר תא מבחנה הוא קריטריון שימושי בהערכת ההתאמה ביולוגית חומר שיניים. מטרת המחקר הייתה להשתמש בהדמית confocal זמן לשגות 3D CLSM להעריך את ההתאמה הביולוגית במבחנה של חומרים מרוכבים שיניים. שיטה זו מספקת אינדיקציה מדויקת ורגישה של שיעור תאי קיימא במגע עם תמציות מורכבות שיניים. הצטמקות נוספת הנמוכה ELS, מורכב שיניים המשמשים לשיקום ישיר, נלקחה כדוגמא. הערכה במבחנה בוצעה על תאים בתרבית ראשוניים אנושי חניכיים פיברובלסטים באמצעות מכתים חי / מת. תמונות התקבלו עם המערכת הביולוגית confocal FV10i ההפוכה וניתחו עם תוכנת FV10-ASW 3.1. ניתוח תמונה הראה רעיל מאוד קל בנוכחות מורכבת נבדק לאחר 5 שעות של הזמן לשגות. ירידה קלה של כדאיות תא הוצגה במגע עם compar התמציות המורכב נבדקעורך לשלוט תאים. הממצאים מדגישים את השימוש בהדמית הזמן לשגות 3D CLSM כשיטה רגישה איכותי וכמותית להעריך את ההתאמה הביולוגית ההתנהגות של חומרים מרוכבים שיניים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד מהסטנדרטים העיקריים צוטטו בהמלצות ISO להגדיר התאמה ביולוגית הוא ההיעדר של רעילות חומר לתאים. מרוכבים שיניים המבוסס על שרף עשויים לשחרר רכיבים ממטריצת השרף, אשר יכול להיות בהתחלה בשל פילמור החלקי, ו / או מאוחר יותר בשל תהליכי פירוק לאורך הזמן 1-4. רכיבים שוחררו אלה באים במגע עם רקמות פה וייתכן שיש לי חסרונות שונים כמו תגובות urticarial והריריות 5, פיתוח של תגובות אלרגיה ורגישות יתר בחולים 6, שינויי מורפולוגיה fibroblasts החניכיים וההפחתה בסוג אני קולגן חלבון 7, דיכוי חיסוני או המרצת מערכת חיסונית בmitogen -driven התפשטות של לימפוציטים מסוג T מטוהר ותאי טחול 8 ונזק ל- DNA בfibroblasts חניכיים האנושי הראשוני, המדגישה 9 פוטנציאל genotoxic. פרמטרים רבים יכולים להשפיע על רעילות מורכבת שיניים כגון צל גomposite, ריפוי האור, את ההרכב הכימי של מונומר השרף, מילוי ואת מידת ההמרה 10 13. מאז פוטנציאל רעיל במבחנה של חומרים ניתן לחזות במצבי vivo ויכול להיות בהשוואה למצבים קליניים על ידי המחקר של כמה נקודות קצה רלוונטיות. Cytotoxicity של חומרים מרוכבים שיניים והרכיבים שלהם נבדקה באופן נרחב באמצעות מערכות תרבית תאי 14- 16.

מערכות במבחנה אלו פותחו על מנת להעריך התאמה ביולוגי מרוכבים שיניים בטווח של: צמיחת תאים, ואפופטוזיס התא באמצעות THP-1monocytes כמו תאים 17, רעיל בfibroblasts חניכיים האנושי 18, פוטנציאל דלקתי בHaCaT קרטינוציטים כמו תאים 2, פונקציונלי תא odontoblast- כמו MDPC-23 תאים 19, ירידה של רמות RNA המוחלטת, וגידול משמעותי באינדוקציה של אפופטוזיס על חניכיים אנושיות קרטינוציטים 20 ונזק ל- DNA בתאי חניכיים ופיברובלסטים עיסה 21.

מתודולוגיות שונות הציעו לחקור את ההתאמה הביולוגית של חומרים מרוכבים שיניים. מבחני Colorimetric, אשר יש בם צבעי מסוים ומדידות ספיחת אור, להישאר הנפוץ ביותר, בשל הפשטות היחסית שלהם בעלות הנמוכה 22 -26. ניתוח מיקרוסקופית לעומת זאת אור בתדירות גבוהה צורך יותר זמן וכרוך בעלויות גבוהות יותר. עם זאת, יש לי שיטות מיקרוסקופיה אלה כמה יתרונות חשובים. התצפית של מבנה תא נותנת מידע מורחב על השפעות רעילות חוו, ובכך לספק נתונים יותר רלוונטיים ורגישים. בפרט, את ההקדמה של מיקרוסקופיה confocal 27 אפשרה לתצפית של מבנים ביולוגיים עם שיפור רזולוציה צירית בהשוואה למיקרוסקופי הקרינה הדמיה רחב בתחום מסורתי. לפיכך, ההדמיה confocal הפכה לכלי מחקר רב עוצמה בתחומים שונים שלמחקרים רפואיים ומדעיים. בניגוד לשיטות מיקרוסקופיה אלקטרוניות, מיקרוסקופיה confocal הסריקה מציעה את היכולת לחזות מרכיבים שונים של תאים על ידי שילוב של סמני ניאון ספציפיים. רוב קליעים נותבים הספציפיים אלה הם יציבים בסביבה מימית, באופן הגיוני למדידה, זולים ולא רעילים 28, המאפשרים את השימוש בם בקליני, כמו גם מחקרי מעבדה. יתר על כן, ייבוש הדגימה והקיבוע נדרש לניתוח מיקרוסקופי אלקטרוני קונבנציונלי אין צורך להדמית confocal זמן לשגות, רכישה ובכך תלוי זמן אפשר גם על דגימות. בהשוואה להדמיה דו-ממדית, עיקרון ההדמיה confocal מאפשר הדמיה מתחת לפני הקרקע דגימה ושחזור מבנה תלת-ממדים מתמונות העומק שהתקבלו השונות; פרטים אשר תוצאה, יותר מדויקים ומבניים יותר 29, 30. המחקר הנוכחי וידאו הוא דוגמא לשימוש בשלושה ממדי זמן לשגות Confocal סריקת לייזר מיקרוסקופית (3D-CLSM) בשילוב עם תיוג Live / Dead ניאון וכימות אות כשיטת חדשנית. יש הטכניקה שהוצגה במאמר זה יש את היתרון של מה שמאפשר הדמיה הערכה והזמן לשגות רגישה של תאי חיים מבלי לשנות את מבנה התא העריך. אין שלבי הכנה נדרשים לפני ניתוח confocal. בעבר, באותו הצביעה שימשה להערכת הכדאיות של ליבות רקמת עצם ספוגיות בתרבית ביום 31 באך ללא זמן לשגות confocal הבאה. באופן דומה את אותו הליך confocal הזמן לשגות שימש להערכת פעילות בזמן להרוג אריתרומיצין בחיידקים של בוצה משופעלת על פי טיבם גרם 32 באמצעות חיידקים מסוימים לחיות / הכתמה המתה. שיטות אלה הותאמו לאחרונה ומשמשות להשוואת הרעילות של חומרים מרוכבים שיניים בהסתמך על מונומרים methacrylate 11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים: השלב הראשון כולל הכנת התמצית מורכבת בתקשורת ובתרבות; החששות השני הראשי פיברובלסטים חניכיים אדם תרבית תאים, הקשר של תאים עם התמציות מורכבות ומכתים תא (HGF); השלב השלישי מורכב מהדמית confocal וניתוח אות הניאון. לרקמות חניכיים לוקחת, הפרוטוקול אושר בעמידה בחקיקה צרפתית, הסכמה מדעת ועדה אתית מקומית.

1. Composite תמציות הכנה

השתמש בינוני השתנה Dulbecco נשר (DMEM) כמדיום elution. להבטיח כי היחס בין שטח הפנים של הדגימות והנפח בינוני חילוץ הוא ברמה הנמוכה ביותר של ISO 10993/12 דרישות. ההליך תאר לאחרונה 11 והתווה בקצרה להלן:

  1. טופס דגימות כדוריות של מרוכבים שיניים הדפוקים באמצעות אחיזה העידואה. גודל המחזיק 2 מ"מ ברדיוס, שהוא על פי עומק ריפוי מומלץ בדרך כלל בטיפול הקליני בעל פה.
  2. הכן בארות צלחת, כל 1 מיליליטר מכיל של מדיום התרבות (DMEM), עם שילוב של 5% פניצילין / סטרפטומיצין ו 1% מamphotericin אך ללא סרום שור עוברי (FBS).
  3. דגימות תרופה בתוך מדיום DMEM המכיל גם באמצעות מנורת אור LED עם סנטימטר -2 עוצמת 1,070 mW (λ = 465-475 ננומטר) עבור 40 שניות. ודא שהמרחק בין קצה הריפוי והדגימות הוא בטווח של 0.5 מ"מ. השתמש במצב ריפוי זה כדי לדמות את הקשר הזמני בין שיניים ובמורכבות שיניים הדפוקות. במצב קליני, הקשר מתרחש כאשר המורכב המבריאים ממוקם בחלל הפה.
  4. דגירה דגימות (דגימות מרוכבים DMEM בינוניים) בשעה 37 מעלות צלזיוס מתחת אווירת humidified של 5% CO 2 באוויר. דגירה DMEM בינוני (ללא דגימות מרוכבים) לתאי שליטה באותם תנאים.

2. תרבית תאי HGF, Composite תמציות בדיקה ותאי מכתים

  1. צמיחה ותחזוקה של תרביות תאים
    לבודד fibroblasts חניכיים אנושי מביופסיות רקמת חניכיים בריאה של חולים שצולמו במהלך עקירות אורתודונטי שגרה.
    1. לטפח fibroblasts חניכיים האנושי בDMEM בנוכחות 10% FBS, 5% פניצילין / סטרפטומיצין ו -1% ב Amphotericin שמרו על תאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה במסגרת אווירת humidified של 5% CO 2 באוויר.
    2. תאים בינוניים מוחלף מדי 3 ימים, ומעבר לכל 5 ימים. לאחר שהגיע confluency, תאי קציר על ידי trypsinization.
    3. צנטריפוגה תאים ב -90 XG למשך 5 דקות מחדש להשעות אותם במדיום התרבות. ספירת תאים עם דלפק תא כף יד שרביט אוטומטי.
    4. השעיה תא זרע בצפיפות תאים של 2.5 x 10 4 תאים / מיליליטר במערכת קאמרי שקופיות. לאפשר הדגירה של תאי הלילה בשעה 37 ° C באווירה של 5%.
  2. תוספת של תמציות מורכבות לתאים בתרבית
    1. החלף את המדיה של שתי בארות של חדר שקופיות על ידי 1 מיליליטר של התמציות מורכבות נבדקו (לאחר 24 שעות של דגירה).
    2. לשמור על שתי בארות הנותרות (תאי בקרה) באותם תנאים.
    3. דגירה השקופיות קאמריות המכילות ארבע בארות על 37 מעלות צלזיוס בחממה, תחת אווירת humidified של 5% CO 2 באוויר.
  3. כתמי ניאון
    השתמש בכתם הרעיל בשידור חי / המת לתאים אוקריוטים על פי הוראות היצרן.
    הערה: הערכה מספקת assay ניאון שני צבעים מהיר כדי לקבוע יכולת קיום של תאים באוכלוסייה מבוססת על שלמות קרום פלזמה ופעילות אסטראז. הכתם להבחין חי מהתאים שניזוקו זמנית על ידי סימון בירוק-ניאון Calcein-AM ללהצביע על אובדן homodimer-1 (EthD-1) כדי לציין פעילות אסטראז תאית ואדום-ניאון Ethidium של membranשלמות דואר.
    1. הכן פתרון עבודה של שני חומרים כימיים כתם המכילים 2 מיקרומטר של Calcein AM ו -4 מיקרומטר EthD-1 (ריכוז סופי דיווח להיות מתאים לצביעת פיברובלסטים). הוסף את הכתם לתאים חסיד התרבית בנוכחותו או היעדריו של התמציות מורכבות נבחרו.
    2. שים לב לאוכלוסיות התאים המוכתמים ישירות ובמהירות ב15 דקות לפחות לאחר מכתים ובאמצעות ההדמיה הזמן לשגות. האם לא צנטריפוגות ולא במחיר המנה עיקרי התאים המוכתמים.

3. Confocal זמן פקיעת הדמיה ואיתותי ניתוח

המערכת המשמשת מצוידת בארבע יחידות לייזר דיודה ותמונה מוכתמות רב עבור עד ארבעה צבעי ניאון לכל דגימה. המערכת יכולה לבצע תמונת מיפוי (הגדלה 10X) שנותנת סקירה כללית של מדגם הבדיקה על איזה מהם יכולים לנוע להתבונן אזור של עניין (הגדלה 600X).

  1. הדמיה זמן לשגות
    1. הנח את יםpecimens (קאמרי השקופית המכילה את הדגימות המוכתמות) בחדר החשוך של החממה המשולבת confocal (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ואווירה לחה).
    2. בחר הלייזרים המתאימים. השתמש במקורות הלייזר שני 473 ננומטר (15 mW) ו559 ננומטר (18 mW) לרגש Calcein וEthD-1.
    3. השתמש במצב רציף שני לרכוש תמונות באמצעות רצפי קו ללא crosstalk בהדמיה עם שני צבעי הקרינה בשימוש.
    4. השתמש בגלאי עם ספקטרום חדש שפותח כדי להגדיר באופן אוטומטי תנאים בהתאם לצבע פלואורסצנטי ביחידת סריקה.
    5. לייעל את רוחבי הפס של הקרינה התגלתה לכל ערוץ למקסימום. השיא של כל הרכישות ברצף כדי להימנע מלדבר צולב פוטנציאלי.
    6. בחר את תנאי ההדמיה המתאימים ביותר לפי בחירת צבע פלואורסצנטי באמצעות תוכנת הרכישה.
    7. לרכוש תמונת מפה שנוצרה באופן אוטומטי מהמרכז בדפוס ספירלה,עם השטח של עניין להיבחר בקלות לבדיקה יסודית יותר.
    8. מצב תצפית בחר. בחר עד חמישה סוגים של מצבי תצפית כוללים זמן לשגות, Z-ערימה, ורב-אזור בהתאם לצורך. השתמש בשילוב של Z-ערימה ומצבי הזמן לשגות במחקר הנוכחי ולהשלים במהירות לכידת התמונה,
    9. לשנות ולהחליף את צבע פלואורסצנטי. לחלופין, כיסוי הניאון ותמונות עם ניגודיות אור אחד עם השני. שים לב תמונה בשידור חי באמצעות הנקודה שנבחרה על מסך המפה השמאלי התחתון.
    10. לקבוע את אזור ההדמיה באמצעות המסגור והתקרבות פונקציות. לחלופין, לעבור בין התצוגות לכל סוג של צבע פלואורסצנטי.
      הערה: יש מיקרוסקופ שימוש בפרוטוקול זה את אותה פונקציונלי כמו confocal קונבנציונלית גבוהה בעיצוב קומפקטי. מיקרוסקופ מצויד ביעדי מים טבילה הפוכים שבצורה אופטימלית מתאימים להדמית הזמן לשגות יציבה של תאי חיים עם פשוטה חממה מובנה.
  2. ניתוח אותות וכימות
    1. השתמש בתוכנת ההדמיה כדי לכמת את אותות הקרינה. השג חמש תמונות המפה במטרה 10X עבור שניהם מדגם ותא השליטה נבדקה.
    2. השיג 1,024 תמונות רגילות × 1,024 פיקסל, עם גודל פיקסל מיקרומטר 0.231 מיקרומטר × 0.231. אחסון תמונות בפורמט תמונת אולימפוס (OIF) לניתוח אותות. פורמט זה מאפשר לשמור את הגדרות פרמטר שונות ותמונות יחד. השתמש בכלים שונים ניתוח (מדידת פרופיל עוצמה, יחס עוצמה בין שני הערוצים בשימוש).
    3. אחסן תמונות הקרנה מקסימליים כקובצי TIFF 12 סיביות / פיקסל.
    4. Preform ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנת מפקד R. ניתוח הבדלים באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) עם מבחן חזרה. לדווח על תוצאות סטייה ממוצעת כסטנדרט (± סטיית תקן) ומובהקות בp <0.05.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 הראה סקירה של תאי חיים / המתים המוכתמים בתמונות שהושגו מיפוי (אובייקטיבי 10X) לשליטה ותאים שנחשפו לתמציות נבדקו מרוכבים (הצטמקות נוספת נמוכה ELS). המבנה התל ממדים של התאים יכול להיות דמיין ב600X ההגדלה. ויזואליזציה של תאים שנאספו בחדר הבקרה ושל תאים שנאספו בתא בנוכחות התמציות מורכבות נבדקו מוצגת באיור 2. ההקרנה המקסימלי (60x האובייקטיבי) מציגה את גורלו של אוכלוסיות תאים שנבחרו בתחילת הזמן לשגות (ב 15 דקות) ובסיומה של תקופת הזמן לשגות (5 שעות). חמישים ושבע ערימות של תמונות (סריקת mod xyzt, 39 תמונות לערימות, voxel מעמיק 1.00 מיקרומטר) התקבלו בתקופה זו. ירידה קלה באות הניאון הירוקה ווריאציה קלה מאוד בניאון האדום התקבלו בתאים שנחשפו. אין שונה משמעותי נצפה לשליטהתאים. תאי תמציות נחשפו Composite להניח מורפולוגיה ציר דומה לשליטה בתאים; מורפולוגיה לא שונה בתנאי ניסוי אלה (על אף הירידה הירוקה אות ועליית האות האדומה בנוכחות מורכבת נבדק). ניתוח תמונה בוצע על חמש ערימות תמונה שונות שנבחרו המתאימות לאוכלוסיות תאים שונות מהתמונות שהתקבלו עבור מרוכבים נבדקו בהשוואה לתאי ביקורת שליליות לאות הן ירוקה ואדום. פרופיל העצמה של תאים צבעוניים מתואר באיור 3; האבולוציה האות הירוקה ואדומה של התאים במגע עם מרוכבים נבדקו הייתה דומה לאלה של תאי שליטה. עוצמות פליטת הקרינה calcein וEthD-1 נמדדו על תאי בקרה ועל תאים שנחשפו מורכבים. המדידה נעשתה במרווחי שעה אחת עד חמש שעות. היחס הירוק / אדום הקרינה (המבוסס על עוצמות משולבות של ננומטר 495-515 הירוק ואותות ננומטר אדומים 620-650) חושב בתקופת הזמן לשגות. יחסי הכדאיות לבקרה ותאים שנחשפו לתמציות הצטמקות נוספת נמוכה ELS מוצגים בT מסוגל 1. בנוכחות מורכבת נבדק, אחוז התאים חיים נמצא ירידה קלה מ -100% ל 93.9% לאחר שעה 1 של ליצירת קשר. נצפה הבדל משמעותי בין מרוכבים נבדק והבקרה השלילית (תאים ללא כל תמציות מורכבות) לאחר 5 שעות של תקופת הזמן לשגות המצוינת.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של תמונת מיפוי הראה מוכתמת תאים ב10X האובייקטיבי, (א) בתאי בקרה ותאים (ב ') בנוכחות של תמציות מורכבות (הצטמקות נוספת נמוכה ELS) בתחילת תקופת הזמן לשגות (t = 15 דקות). שטחים ירוקים הם תאי חיים ואזורים אדומים הם תאים פגומים. בזה תנאי ניסוי, אין שונה (לשניהם הקרינה הירוקה ואדום) נצפו לתאי חומרים מרוכבים נחשפו בהשוואה לתאי ביקורת שליליות.

figure-results-2
איור 2: תמונות CLSM ב60x האובייקטיבי של אוכלוסיית תאים מ() חדר בקרה וחדר תמציות מורכבות (ב) בתחילה ובתום תקופת הזמן לשגות חשיפה (אני: 15 דקות ושניות: שעה 5, בהתאמה ). שטחים ירוקים הם תאי חיים ואזורים אדומים הם תאים פגומים. הפנל של התמונות הראה שינוי קל באות העצמה (ירידה קלה באות הירוקה ועלייה קלה מאוד באדום אחד). אין שינויי מורפולוגיה של תאים נצפו בנוכחות של תמציות מורכבות; חושף את התאים נשמרו מורפולוגיה הציר בצורה וfibroblastic כתאי שליטה.

gether.within עמודים = "תמיד"> figure-results-3
איור 3: פרופיל קו של תאים שנצפו במיקרוסקופיה זמן לשגות תאי בקרה (א) (ב) תאי תמציות Composite חשופים, (אני) ב 15 דקות ו( II) בשעה 5 שעות.. אין שונה נראה לעין באבולוציה האות הירוקה בנוכחות מורכבת נבדק קשר זמן המגע. עם זאת, עלייה קלה של האות האדומה נצפתה בנוכחות מורכבת לאחר 5 שעות של מגע.

זמן מגע (שעה) כדאיויות תא (%)
1 2 3 4 5
תאי בקרה 100 100 100 100 100
הצטמקות נוספת נמוכה ELS ® 93.9 ± 7 91.3 ± 5 * 89.5 ± 3 * 87.6 ± 2 * 87.7 ± 3 *

טבלה 1:. קצב אבולוצית תאי HGF החי לאחר 1, 2, 3, 4 ו -5 שעות של מגע עם תמציות מורכבות כדאיות תא הייתה assayed על ידי צביעה באמצעות ערכת cytotoxicity Live / Dead. הנתונים מראים ערכים ממוצעים ± SD של חמש תמונות ערימות ניתוח. ערכים הם שונים באופן משמעותי מתאי שליטה בp <0.05.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומר Biocompatibility התנהגות היא פרמטר התנאי ביותר כדי להיות מוערך לפני שימוש רפואי. סטנדרטים בינלאומיים לכסות ISO מכשור הרפואית 10993 33 ובמיוחד חומרים דנטליים ISO 7405 34. היעדר ההשפעות הרעילות לתאים הסמוכים הוא הנורמה המרכזית בהערכת ההתאמה הביולוגית של חומרים אלו. זו הסיבה שהבדיקות רעילות יש חשיבות כה רבה בהערכת ההתאמה ביולוגית חומר שיניים 35-37. ISO הציעה שיטות בדיקה יכולות להיות מבוססות על פעילות חילוף חומרים או שלמות קרום. נקודות קצה שנבחר צריכה לעקוב תנאים ספציפיים לדירוג תופעות לוואי שנגרמו על ידי חומר למבחן על מנת לצמצם את הזמן והעלות של מבחני ההערכה. השיטה הנוכחית של חקירה (ההדמיה הזמן לשגות confocal 3D) היא שלמות קרום מבוססת. נראה ההערכה הרעילה באמצעות נקודת קצה זו להיות סמן חשוב של biocompa התאtibility עם חומרים שנבדקו והיא גם ISO אישרה נקודת סיום. במבחנה בדיקות נועדו לקבוע כיצד מדגם חומרי משפיע על סוג תא מסוים. Assay MTT colorimetric תואר לראשונה על ידי Mossman (1983) כשיטת שימושית למדידה רעילה במבחנה וחלוקה של תאים. מבחן MTT מבוסס על המרה של מלח tetrazolium לגבישי formazan על ידי תאים פעילים, הקובעת את פעילות של המיטוכונדריה. זה יכול להיות מתורגם על ידי שיעור כדאיות 38. גופטה ומשתפי פעולה דיווחו כי מבחן MTT הוא השיטה הנפוצה ביותר למדידה רעילה של רפי מרוכבים. dehydrogenase Succinic ותגובות phosphatase אלקליין יש גם שימשו לאותה המטרה 39. עם זאת, לא יכולים להיות אחרי תאי הגורל עד, מאז assay MTT דורש הריגת התאים בכל נקודת זמן מדידה. על מנת לפקח באופן הדוק יותר את התנהגותם של התאים המוכתמים במחקר הנוכחי, דיתצפית rect של תאי חיים בוצעה, הודות להדמית CLSM זמן לשגות בשילוב עם צביעה קצרה פרוטוקול, ניתוח תמונה אוטומטי וכימות אות ניאון.

מרוכבים שיניים באים במגע קרוב עם רקמות פה, ובעיקר תאי חניכיים וpulpal. Fibroblasts יהיה היעד של רכיבים שוחררו מחומרים מרוכבים המשקמים אלה 40-41. יתר על כן, מספר מחקרים דיווחו כי ייתכן שיש לי תאים הונצחו ותאים ראשוניים תגובות תאיות שונות במגע עם ביו-חומרים. תאים ראשוניים נמצאו מתאים יותר כדי להעריך השפעות בביו-חומרי 42. זה מסביר את השימוש בתאי פיברובלסטים חניכיים אנושיים ראשוניים כמודל תא להערכה רעילה של מורכב שיניים שנבדק במחקר הנוכחי. פוטנציאל הרעילות של חומרים מרוכבים שוחררו משיניים נחקר באופן נרחב 43-44. על מנת להעריך tהוא רעיל לתאי פוטנציאל של חומרים, שני תאי מודל קשר יכולים להתבצע. במערכת מודל מגע הישירה החומר המונח ישירות עם תאי מטרה ואילו במערכת הקשר העקיפה, לתקוף תאים נמצאים בקשר עם elutes מתקשורת ביולוגית. ביישומים קליניים ולהליכי שיקום, המורכב דנטאליים במגע עקיף עם רקמות חניכיים. מסיבה זו, פרוטוקול הניסוי הנוכחי התמקד בקשר העקיפה עם המערכת fibroblasts חניכיים האנושית (תאים בנוכחות של התמציות מורכבות נבדקו). כפי שדווח בעבר על ידי דאל ומשתפי פעולה, תגובות רעילות דורגו כחמור (<30%), בינוני (30-60%), קל (60-90%) או שאינם רעיל לתאים (> 90%) המבוססים על הפעילות ביחס ל ערכים שהתקבלו עבור הפקדים 45. לכן, על פי דירוג זה ולאור התוצאות שהושגו (טבלת 1), הצטמקות נוספת נמוכה ELS מורכב יכולה להיות מדורגת כVery מעט ציטוטוקסיות והראה התנהגות דומה לשלוט תאים בתקופת הזמן לשגות כל. שימוש בדיוק באותה שיטת החקירה, התוצאות של מחקר זה יכול להיות בהשוואה לאלו של מחקר שפורסם לאחרונה. מורכב ההתכווצות נמוכה נוספת ELS הפגין התאמה ביולוגית טובה יותר בהשוואה לשני רוכבים שנבדקו בעבר המשמשים לאותה יישום קליני שהוא השיקום הישיר 11. מחקרים נוספים עדיין נדרשים להקמת השוואה מלאה יותר.

כאשר מחליטים שcytotoxicity assay לאשר להערכת נקודות קצה ספציפית, חשוב להבין את היתרונות והמגבלות של כל assay. מטרתה העיקרית של ההדמיה confocal היא להשיג ארכיטקטורת 3-D של תאים ואיברים. הטכניקה היא מסוגלת לחשוף לא רק את פני השטח של דגימה, אבל גם מתחת לפני הקרקע שלה. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מדגיש את השימוש בהדמית confocal זמן לשגות 3D CLSM, כSensiשיטה מופרזת להעריך במבחנה biocompatibility התנהגות מורכבת שיניים. עם זאת, על מנת להימנע מהמגבלות נתקלו בעבודה זו, תחנות עבודה נגד רעידות יכולות לשמש כדי לאפשר הדמיה זמן לשגות יותר יציבה ויותר; השולחן יכול לבודד את מערכת confocal משמשת מההשפעות המזיקות שתנודות במעבדה עלולות לגרום. יתר על כן, חומרים לשימוש בחלל הפה אידיאלי צריכה להיות לא מזיק לרקמות חניכיים וצריכים להכיל לא חומרים שעלולים לגרום לרעילות מערכתית. בהתאם למתודולוגיה ששמשה והתוצאות שהתקבלו מהמחקר הנוכחי ניתן להסיק שמורכב נבדק (הצטמקות נוספת נמוכה ELS) אינו רעיל לתאים בתנאי הניסוי הנוכחיים. כשיטת CLSM רגישות יכולה לתת שיעוריו הראשוניים של תאי קיימא, אפשר היו לחזות את אפשרויות אחרות כדי להעריך יותר נקודות קצה. בפרט, כפי שכבר דיווחו לאחרונה כי מונומרים מורכבים משפיעים על תאי through מיני חמצן מגיבים (ROS) 46 48, יש צורך בחקירה נוספת על מנת להעריך מתאמים אם בכלל בין cytotoxicity איתות רשתות וייצור ROS. פרוטוקול העתיד יכול להיות שנועד להעריך את ייצור ROS בו זמנית (H 2 O 2 ו / או O 2 - כתמים) ויחס רעיל (מכתים חי / מת) באמצעות ההדמיה CLSM זמן לשגות.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים, אין להם מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Saremco Dental Switzerland ו-Olympus Microsystems France חברות זוכות להכרת תודה על תמיכתן הכספית. Saremco Dental זוכה להכרה גם על התרומה הנדיבה של חומרים מרוכבים דנטליים ELS הצטמקות נמוכה במיוחד. המחברים מבקשים גם להביע את הערכתם לד"ר סיימון בנקס מהמחלקה לכימיה (יוניברסיטי קולג' לונדון) על עזרתו בתיקון האנגלית.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אולימפוס פלואו-וויו FV10i מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוס
O2/CO2Incubator PnasonicMCO 5MCell
Incubation Live/Dead KitInvitrogen MP 03224כתם 
הצטמקות נמוכה במיוחד של ELS  סרמקו מרוכב דנטלי
SigmaD 6046מדיום תרבית
טריפסיןסיגמאT1426תאי קציר
תא שקופיות מערכת   PAA14220040Xתא תרבית
פניצילין/סטרפטומיצין PAAP11-010תרבית תאים
אמפוטריצין BPAAP11-001תרבית תאים
סרום בקר עוברי PAAA11-101תרבית תאים
מונה תאיםMerck Millipore00110230TP1ספירת תאים 
מדיום DMEM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Landuyt, K. L., et al. How much do resin-based dental materials release? A meta-analytical approach. Dent. Mater. 27 (8), 723-747 (2011).
  2. Moharamzadeh, K., Van Noort, R., Brook, I. M., Scutt, A. M. Cytotoxicity of resin monomers on human gingival fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Dent. Mater. 23 (1), 40-44 (2007).
  3. Santerre, J. P., Shajii, L., Leung, B. W. Relation of dental composite formulations to their degradation and the release of hydrolyzed polymeric-resin-derived products. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 12 (2), 136-151 (2001).
  4. Geurtsen, W. Biocompatibility of resin-modified filling materials. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11 (3), 333-355 (2000).
  5. Hensten-Pettersen, A. Skin and mucosal reactions associated with dental materials. Eur. J. Oral Sci. 106 (2), 707-712 (1998).
  6. Paranjpe, A., Sung, E. C., Cacalano, N. A., Hume, W. R., Jewett, A. N-acetyl cysteine protects pulp cells from resin toxins in vivo. J. Dent. Res. 87 (6), 537-541 (2008).
  7. Falconi, M., Teti, G., Zago, M., Pelotti, S., Breschi, L., Mazzotti, G. Effects of HEMA on type I collagen protein in human gingival fibroblasts. Cell. Biol. Toxicol. 23 (5), 313-322 (2007).
  8. Jontell, M., Hanks, C. T., Bratel, J., Bergenholtz, G. Effects of unpolymerized resin components on the function of accessory cells derived from the rat incisor. 74 (5), 1162-1167 (1995).
  9. Urcan, E., Scherthan, H., Styllou, M., Haertel, U., Hickel, R., Reichl, F. -X. Induction of DNA double-strand breaks in primary gingival fibroblasts by exposure to dental resin composites. Biomaterials. 31 (8), 2010-2014 (2010).
  10. Sigusch, B. W., et al. Resin-composite cytotoxicity varies with shade and irradiance. 28 (3), 312-319 (2012).
  11. Attik, G. N., Pradelle-Plasse, N., Campos, D., Colon, P., Grosgogeat, B. Toxicity Evaluation of Two Dental Composites: Three-Dimensional Confocal Laser Scanning Microscopy Time-Lapse Imaging of Cell Behavior. Microsc. Microanal. 19, 596-607 (2013).
  12. Ausiello, P., et al. Cytotoxicity of dental resin composites: an in vitro evaluation. J. Appl. Toxicol. 33 (6), 451-457 (2011).
  13. Durner, D., Obermaier, J., Draenert, M., Ilie, N. Correlation of the degree of conversion with the amount of elutable substances in nano-hybrid dental composites. Dent. Mat. 28 (11), 1146-1153 (2013).
  14. Sigusch, B. W., Völpel, A., Braun, I., Uhl, A., Jandt, K. D. Influence of different light curing units on the cytotoxicity of various dental composites. Dent. Mater. 23 (11), 1342-1348 (2007).
  15. Knezevic, A., Zeljezic, D., Kopjar, N., Tarle, Z. Influence of curing mode intensities on cell culture cytotoxicity/genotoxicity. Am. J. Dent. 22 (1), 43-48 (2009).
  16. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. -A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  17. Harorli, O. -T., Bayindir, Y. -Z., Altunkaynak, Z., Tatar, A. Cytotoxic effects of TEGDMA on THP-1 cells in vitro. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 14 (9), 489-493 (2009).
  18. Reichl, F. X., et al. Cytotoxicity of dental composite (co)monomers and the amalgam component Hg(2+) in human gingival fibroblasts. Arch. Toxicol. 80 (8), 465-472 (2006).
  19. Aranha, A. M. F., Giro, E. M. A., Hebling, J., Lessa, F. C. R., Costa, C. A. deS. Effects of light-curing time on the cytotoxicity of a restorative composite resin on odontoblast-like cells. J. Appl. Oral Sci. 18 (5), 461-466 (2010).
  20. Schulz, S. D., König, A., Steinberg, T., Tomakidi, P., Hellwig, E., Polydorou, O. Human gingival keratinocyte response to substances eluted from Silorane composite material reveal impact on cell behavior reflected by RNA levels and induction of apoptosis. Dent. Mater. 28 (8), 135-142 (2012).
  21. Tadin, A., Marovic, D., Galic, N., Kovacic, I., Zeljezic, D. Composite-induced toxicity in human gingival and pulp fibroblast cells. Acta Odontol. Scand. 72 (4), 304-311 (2014).
  22. Schweikl, H., Schmalz, G. Toxicity parameters for cytotoxicity testing of dental materials in two different mammalian cell lines. Eur. J. Oral Sci. 104 (3), 292-299 (1996).
  23. Issa, Y., Watts, D. C., Brunton, P. A., Waters, C. M., Duxbury, A. J. Resin composite monomers alter MTT and LDH activity of human gingival fibroblasts in. 20 (1), 12-20 (2004).
  24. Brambilla, E., Gagliani, M., Ionescu, A., Fadini, L., García-Godoy, F. The influence of light-curing time on the bacterial colonization of resin composite surfaces. 25, 1067-1072 (2009).
  25. Modareszadeh, M. R., et al. Cytotoxicity of set polymer nanocomposite resin root-end filling materials. Int. Endod. J. 44, 154-161 (2011).
  26. Tamilselvam, S., Divyanand, M. J., Neelakantan, P. Biocompatibility of a conventional glass ionomer, ceramic reinforced glass ionomer, giomer and resin composite to fibroblasts: in vitro study. J. Clin Pediatr. Dent. 37 (4), 403-406 (2013).
  27. White, J. G., Amos, W. B., Fordham, M. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. J. Cell Biol. 105 (1), 41-48 (1987).
  28. Alpino, P. H. P., Pereira, J. C., Svizero, N. R., Rueggeberg, F. A., Pashley, D. H. Use of fluorescent compounds in assessing bonded resin-based restorations: a literature review. J. Dent. 34 (9), 623-634 (2006).
  29. Chen, Y., Liang, C. -P., Liu, Y., Fischer, A. H., Parwani, A. V., Pantanowitz, L. Review of advanced imaging techniques. J. Pathol. Inform. 3, 22(2012).
  30. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques—FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  31. Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A., Davies, C. M., Richards, R. G. A comparison of non-radioactive methods for assessing viability in ex vivo cultured cancellous bone: technical note. Eur. Cell Mater. 12, 16-25 (2006).
  32. Louvet, J. N., Attik, G., Dumas, D., Potier, O., Pons, M. N. Simultaneous Gram and viability staining on activated sludge exposed to erythromycin: 3D CLSM time-lapse imaging of bacterial disintegration. Int. J. Hyg. Environ. Health. 214 (6), 470-477 (2011).
  33. Dentistry - Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry - Test methods for dental materials. International Standards Organization. , (2009).
  34. Biological evaluation of dental devices. International Standards Organization. , (2009).
  35. Elshahawy, W. M., Watanabe, I., Kramer, P. In vitro cytotoxicity evaluation of elemental ions released from different prosthodontic material. Dent. Mater. 25 (12), 1551-1556 (2009).
  36. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  37. Illeperuma, R. P., et al. Immortalized gingival fibroblasts as a cytotoxicity test model for dental materials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 23 (3), 753-762 (2012).
  38. Wataha, J. C., Lockwood, P. E., Bouillaguet, S., Noda, M. In vitro biological response to core and flowable dental restorative materials. Dent. Mater. 19 (1), 25-31 (2003).
  39. Ergun, G., Egilmez, F., Yilmaz, S. Effect of reduced exposure times on the cytotoxicity of resin luting cements cured by high-power led. J. Appl. Oral Sci. 19 (3), 286-292 (2011).
  40. Yap, A. U., Han, V. T., Soh, M. S., Siow, K. S. Elution of leachable components from composites after LED and halogen light irradiation. Operative Dentistry. 29 (4), 448-453 (2004).
  41. Lee, S. Y., Greener, E. H., Menis, D. L. Detection of leached moieties from dental composites in fluids stimulating food and. 11 (6), 348-353 (1995).
  42. Anselme, K., Davidson, P., Popa, A. M., Giazzon, M., Liley, M., Ploux, L. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomateriala Journa. 6 (10), 3824-3846 (2010).
  43. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  44. Gupta, S. K., Saxena, P., Pant, V. A., Pant, A. B. Release and toxicity of dental resin composite. Toxicol. Int. 19 (3), 225-234 (2012).
  45. Dahl, J. E., Frangou-Polyzois, M. J., Polyzois, G. L. In vitro biocompatibility of denture relining materials. Gerodontology. 23 (1), 17-22 (2006).
  46. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  47. Krifka, S., Spagnuolo, G., Schmalz, G., Schweikl, H. A review of adaptive mechanisms in cell responses towards oxidative stress caused by dental resin monomers. Biomaterials. 34 (19), 4555-4563 (2013).
  48. Chang, M. C., et al. The role of reactive oxygen species and hemeoxygenase-1 expression in the cytotoxicity, cell cycle alteration and apoptosis of dental pulp cells induced by BisGMA. Biomaterials. 31, 8164-8171 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Time Lapse ImagingDental Composite BiocompatibilityHuman Gingival FibroblastsLive Dead Staining3D CLSM ImagingCytotoxicity AssessmentFluorescent Signal AnalysisCell Viability MeasurementComposite Extract PreparationMaximal Projection Images

Related Articles