מאמר שיטה

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

DOI:

10.3791/51995

⸱

14 בספטמבר 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת קונפורמציות של אנטיגנים על פני השטח של הנגיף נדרשת כדי להעריך את נטרול הנוגדנים ולהדריך את התכנון של אימונוגנים יעילים לחיסון. כאן אנו מתארים בדיקת ELISA מבוססת תאים המאפשרת לחקור את הזיהוי של HIV-1 Env טרימרי המתבטא על פני תאים שעברו טרנספטציה על ידי נוגדנים ספציפיים נגד Env.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליקופרוטאינים מעטפת HIV-1 (Env) מתווכים כניסה ויראלית לתאי מטרה והם חיוניים למחזור הזיהום. הבנת האופן שבו גליקופרוטאינים אלה מסוגלים לתדלק את תהליך ההיתוך באמצעות השינויים הקונפורמטיביים שלהם יכולה להוביל לתכנון אימונוגנים טובים ויעילים יותר לאסטרטגיות חיסון. כאן אנו מתארים בדיקת ELISA מבוססת תאים המאפשרת לחקור את הזיהוי של HIV-1 Env טרימרי על ידי נוגדנים חד שבטיים. בעקבות ביטוי של HIV-1 trimeric Env על פני התאים שעברו טרנספטציה, נוגדנים ספציפיים נגד Env מודגרים עם התאים. לאחר מכן משתמשים בנוגדנים משניים מצומדים לחזרת פרוקסידאז ותגובת כימילומינסנציה פשוטה לאיתור נוגדנים קשורים. מערכת זו גמישה מאוד ויכולה לזהות שינויים קונפורמטיביים של Env הנגרמים על ידי CD4 מסיס או חלבונים תאיים. זה דורש כמות מינימלית של חומר וללא ציוד או ידע מיוחד במיוחד. לפיכך, ניתן לבסס טכניקה זו לבדיקת תפוקה בינונית עד גבוהה של אנטיגנים ונוגדנים, כגון נוגדנים שבודדו לאחרונה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סוג נגיף כשל חיסוני אנושי 1 כניסה (-1 HIV), בתיווכו של גליקופרוטאינים trimeric הנגיפיים המעטפה (מעטפה) הוא הצעד הראשון של המחזור המדבק. להיות אנטיגן רק נחשף הנגיפי מוצג על פני השטח של virions, trimer מעטפה מעורר נטרול ונוגדנים nonneutralizing. ככזה, הוא מייצג מועמד מעניין לעיצוב immunogen החיסון. עם זאת, ניסויי חיסון עם מעטפה בצורות מסיסה או רקומביננטי עוררו תגובות עם יעילות מינימאלית בלבד מול רוב HIV-1 העיקרי מבודד 1-3. עם זאת, יעילות חלקית נצפתה בעניין ניסוי בחיסון RV144 4 המחודש בנגיף HIV-1 מעטפה כמועמד immunogen. זה אושר על ידי מחקר שנערך לאחרונה מתאר כי נוגדנים נגד מעטפה-הושר חיסון היו מספיק כדי ליצור מידה מסוימת של הגנה מפני SIV ו HIV מאתגר 5.

לאחר שמסונתז בreticulum endoplasmic, glycoprote מעטפהבמבשר, gp160, עובר לאחר translational שינויים שונים שהם קריטיים ליכולתה כדי לתדלק את תהליך היתוך ויראלי. מבשר מעטפה חייב לקפל כראוי ושותף בtrimers לפני שהבקיע ליחידות משנת gp120 וgp41 הטרנסממברני במיוחד cytoplasmic 6-10, עם אינטראקציות noncovalent שמירה על קשר gp120-gp41. מכונות התא נגועות היא גם אחראיות לglycosylating כבדות מעטפה, הכולל כ -50% מהמסה הכוללת שלה 11,12. המבנה המורכב וכתוצאה מכך מאפשר מעטפה להיות conformationally גמישה 13,14, תוך מתן-חלקית, כי הוא חשב על מנת לאפשר מעטפה להסתגל ולהסתיר אפיטופים חיסוניים מאוד מסוימים שאחרת היה חשוף 15-19, המדגיש את החשיבות כדי להבין טוב יותר את התצורות השונות נדגמו על ידי trimer מעטפה הילידים.

נכון להיום, כמה טכניקות פותחו ומשמשות בהצלחה ללמוד ch קונפורמציה מעטפהAnges. עם זאת, הם משתנים במגבלות שלהם, שלעתים קרובות מוגבלים להקשרי מעטפה ספציפיים. לדוגמא, תהודת plasmon פני השטח או מבחני immunoprecipitation באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים קונפורמציה (בז), להסתמך גם על מולקולות מסיסה או solubilized monomeric מעטפה אשר ידוע להיות שונה immunogenetically מצורות trimeric 20,21. מחקרים שנעשה לאחרונה מראים גם כי מחשוף משפיע תצורות מעטפה וכתוצאה מכך החשיפה של אפיטופים מוכרים בעיקר על ידי nonneutralizing נוגדנים 14,22,23.

כאן אנו מתארים בפירוט שיטה המאפשרת לקביעה מהירה וקלה של קונפורמציה של trimers מעטפה הביעה cellularly 18,24-26. בעקבות transfection החולף של מעטפה בשורת תאים חסיד אנושית המחייב של נוגדני מעטפה ספציפיים מזוהה באמצעות תגובת chemiluminescence פשוטה. גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לאפיין את העדפת קונפורמציה של קונפורמציה-depenנוגדני שקע. לפיכך, assay זה מספק שיטה לגילוי חזקה וגמישה מאוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 יום 1 - תרבית תאים

  1. הצלחת 2 x 10 4 אוסטאוסרקומה אנושית (HOS) תאים לכל גם בצלחת אטומה, 96 גם תרבית התאים מתאימה לקריאת הארה. השתמש בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו100 U / פניצילין, סטרפטומיצין מ"ל. דגירה עד למחרת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.

Transfection Polyethylenimine (PEI) - 2 יום 2

  1. הכן תערובת transfection פי השלבים הבאים. התאם ריאגנטים וכמויות DNA על פי מספר הבארות שיש transfected עם אותו מעטפה.
  2. Tube: הוסף 10 פלסמיד ng תאת הקידוד (כגון pTat-III 27) ו150 ng פלסמיד מעטפה הקידוד לDMEM 5 μl בתוספת 25 HEPES מ"מ.
  3. פלסמיד תאת הקידוד נדרש רק בעת השימוש בפלסמידים מעטפה קידוד תאת תלויה כגון pSVIII.
  4. צינור B: הוסף 450 ng PEI (מ1מיקרוגרם פתרון / μl) עד 5 μl DMEM.
  5. הוסף תוכן של צינור ב 'לצינור א מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 10 שניות ודגירת תערובת transfection 10 דקות בטמפרטורת חדר (22 מעלות צלזיוס).
  6. הוסף 10 μl של תמהיל transfection לכל טוב של 96 גם הצלחת. דגירה של 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.

3 יום 4 - ELISA

  1. לבצע את כל הניסויים בטמפרטורת חדר כדי למזער אנדוציטוזה האפשרית של מתחמים / נוגדני מעטפה.
  2. הכן 250 מ"ל של הצפת כביסה לכל צלחת בשימוש באותו הזמן. חיץ כביסה הוא שנאגר מלוח טריס 1x pH (TBS) 7.5 (50 מ"מ טריס-Cl, pH 7.5; 150 mM NaCl), בתוספת 1 ​​מ"מ MgCl 2 ו1.8 מ"מ CaCl 2.
  3. הכן 125 מ"ל חיץ חסימה לכל צלחת על ידי הוספת חלב יבש ללא שומן 1% ו5 מ"מ טריס pH 8.0 לכביסת הצפת.
  4. הסר תקשורת תרבית תאים ובתמהיל transfection (supernatant) מצלחת 96 היטב.
  5. הוסף 100 μ; L של חיץ חסימה לכל טוב ודגירת 20 דקות ב RT.
  6. הסר supernatant ולהוסיף 50 μl של נוגדן (או סרום) לכל טוב, בדילול מלא לריכוז מתאים בחסימת המאגר. בדרך כלל, להשתמש בריכוז של 1 מיקרוגרם / מ"ל. דגירה שעה 1 בRT.
  7. 3x לשטוף עם 100 μl חיץ חסימה ולאחר מכן לחזור 3x תהליך כביסה עם כביסה 100 μl הצפת.
  8. הסר supernatant, להוסיף 100 μl חיץ חסימה, ודגירה 5 דקות ב RT.
  9. הסר supernatant ולהוסיף 50 μl של נוגדנים משני, בדילול 1 / 3,000 בחסימת המאגר. להשתנות דילול נוגדן אופטימלי בהתאם להבדלי יצרן. דגירה 40 דקות ב RT.
  10. 3x לשטוף עם 100 μl חיץ חסימה ולאחר מכן לחזור 3x תהליך כביסה עם כביסה 100 μl הצפת.

.4 Data Acquisition

  1. הסר supernatant מהצלחת ולהוסיף 30 μl 1x chemiluminescence המשופרות מצע (ECL) לכל טוב.
  2. לרכוש כימיהאות iluminescence לשניית 1 / גם בצלחת קורא מתאים בהתאם להוראות יצרן. זמן קריאה עשויה להיות שונה בהתאם להבדלי חומרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש בנוהל הכללי שתואר לעיל, אנו מותאמים הפרוטוקול לassay ההשפעה של CD4 המסיס (sCD4) וCD4 הסלולרי coexpressed על החשיפה של אפיטופים CD4i משני wild-type (WT) או מעטפה שעברו מוטציה, כפי שתואר לעיל 18,24, 25,28. איור 1 סכמטי מייצג את ההליך באופן כללי וחשיפה של אפיטופים CD4i בעקבות הטיפול בsCD4 או על ידי coexpression של CD4 הסלולרי 18. באיור 2, שנהגנו sCD4 לגרום שינויי קונפורמציה מעטפה החושפים 17b CD4i מהבז ו48d אפיטופים שחופפים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

assay זה הוא מותאם כדי לזהות את האינטראקציה של בז ספציפי עם HIV-1 מעטפה trimeric הביעה על פני התא. ברגע שהפרוטוקול כבר נקבע, ניתן להשתמש בו במדיום לתפוקה גבוהה עם עלויות נמוכות הכוללות חומר וכמויות קטנות של נוגדנים. מאז assay זה הוא מבוסס transfection, זה יכול בקלות להיות מותאם לcoexpression של חלבונים תאיים כגון CD4 כדי ללמוד את ההשפעות שלהם במבנה גוף מעטפה.

עם זאת, בסיס transfection של פרוטוקול זה גם מרמז שזה א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שום ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר ג'יימס רובינסון למתנתו הנדיבה של A32, 17b, 48d, וC11 מהבז. PGT 121 הושג באמצעות התכנית מגיב NIH האיידס, החטיבה של איידס, NIAID, NIH (חתול # 12343). עבודה זו נתמכה על ידי קרן קנדה לחדשנות תכנית המנהיג # 29,866, על ידי ההפעלה CIHR # 257,792, על ידי הקמת FRQS של מדען צעיר להעניק # 24,639 לAF ועל ידי מענק רצף CRCHUM כמו גם על ידי מענק # זרז CIHR 126,630 לAF וMR. AF הוא הנמען של # 24,639 אחוות 1 FRSQ Chercheur Boursier Junior. MV נתמכה על ידי # CIHR דוקטורט פרס מחקר 291,485.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי HOSATCCCRL-1543
צלחת תרבית רקמות אטומה לבנה, 96 בארות, תחתיתשטוחה BD353296
פוליאתילנימין, ליניארית, 25,000 מגה-וואטPolysciences23966מוכן בתמיסה של 1 מ"ג/מ"ל
מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)Invitrogen11995
IgG אנטי אנושי עיזים, מצומד פרוקסידאזפירס31413
מצע כימילומינסנציה משופרPerkinElmerNEL105001EA
TriStar LB 941, קורא צלחותBerthold Technologies

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
  2. Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
  3. Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
  4. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  5. Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
  6. Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
  7. Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
  8. Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
  9. Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
  10. Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
  11. Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
  12. Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
  13. Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
  14. Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
  15. Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
  16. Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
  17. Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
  18. Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
  19. Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
  20. Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
  21. Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
  22. Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
  23. Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
  24. Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
  25. Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
  26. Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
  27. Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
  28. Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
  29. Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
  30. Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
  31. Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
  32. Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
  33. Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
  34. Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
  35. Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
  36. Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
  37. Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
  38. Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
  39. Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HIV 1CD4Horseradish Peroxidase

מאמרים קשורים