מאמר שיטה

Stereological וcytometry זרימת אפיון תת-אוכלוסיות יקוציט במודלים של חולף או קבוע מוחין איסכמיה

DOI:

10.3791/52031

⸱

28 בדצמבר 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unidad de Investigacón Neurovascular, Departmento de Farmacología, Falcultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid y Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Madrid

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון תאי מיאלואידית מוח לאחר שבץ יכול להתבצע על ידי stereology בשיטת fractionator האופטית, או על ידי ניתוח התזרים cytometric של מוח לויקוציטים השעיות. שניהם טכניקות שימושיות לבצע הבחנה phenotypical מדויקת של תת תא מיאלואידית העיקרי נמצאים במוח איסכמי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפעלת מיקרוגליה, כמו גם extravasation של מקרופאגים ונויטרופילים haematogenous, הוא האמין לשחק תפקיד מרכזי בפגיעה מוחית לאחר שבץ. תת-אוכלוסיות תא מיאלואידית אלה יכולים להציג פנוטיפים ופונקציות שונים וצריכים להיות מכובד ומאופיינות ללמוד תקנתם ותרומתם לנזק לרקמות. פרוטוקול זה מספק שתי שיטות שונות לאפיון תאים חיסוני במוח: גישת stereological מדויקת וניתוח התזרים cytometric. גישת stereological מבוססת על השיטה האופטית fractionator, המחשבת את המספר הכולל של תאים באזור של עניין (מוח infarcted) מוערכת על ידי דגימה מקרית שיטתית. גישת האפיון השנייה מספקת דרך פשוטה לבודד השעיות ויקוציטים המוח ולאפיין אותם על ידי cytometry זרימה, המאפשר לאפיון של מיקרוגליה, הסתנן מונוציטים ונויטרופילים של הרקמה איסכמית. בנוסף, הוא גם דetails מודל איסכמיה מוחית בעכברים שבאופן בלעדי משפיע קליפת מוח, יצירת אוטמי שחזור מאוד עם שיעור נמוך של תמותה, ואת ההליך לעיבוד היסטולוגית המוח לאפיין נפח אוטם בשיטת Cavalieri.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים מורפולוגיים, פנוטיפי וביטוי גנים של מיקרוגליה, כמו גם extravasation והפעלה של מקרופאגים ונויטרופילים haematogenous הם האמינו לשחק תפקיד מרכזי במפל pathophysiological בעקבות פציעת מוח 1-4. פרוטוקול זה מספק שתי גישות כדי להעריך את המספר של תת תא מיאלואידית שונה של מוח איסכמי ולבצע אפיון phenotypical. בנוסף, הוא גם מספק תיאור של מודל ניסיוני של איסכמיה המוחית בעכברים, אשר מורכב של קשירה החולפת או קבועה של שני עורק המוח התיכון דיסטלי (MCA) ועורק התרדמה המשותפת (CCA), כולל כיצד להעריך את האוטם בשיטה מדויקת Cavalieri באמצעות תוכנת stereological.

הגישה הראשונה לאפיין תת תא מיאלואידית של מוח איסכמי היא שיטה stereological מבוססת על גישת fractionator האופטית 5. זהו ביותרנפוץ בדיקה stereological בתחום מדעי חיים ומספק רמה גבוהה של דיוק עם מקדמים נמוכים של שגיאת 5-7. זה הוא הבחירה הטובה ביותר לכימות תא כאשר הרקמה היא לחתוך למקטעים, כפי שהוא ימנע את ההטיה בהערכת תא בגלל הפיצול של הרקמה למקטעים. שיטה זו היא דרך חזקה מאוד לאפיין מספרים, דינמיקה ושינויים פנוטיפי של תת-אוכלוסיות נויטרופילים הסתננו של הרקמה איסכמית 8.

גישת האפיון השנייה מבוססת על פרוטוקול שונה מקמפנלה ומשתפי פעולה 9 שמספק דרך פשוטה לבודד השעיות ויקוציטים מוח ולאפיין אותם על ידי cytometry זרימה. בניגוד לשיטות immunohistochemical קונבנציונליים, cytometry זרימת אפיון מאפשר הבחנה בין microglia (CD45 lo CD11b +) והסתננתי תאי מיאלואידית (CD45 היי CD11b +) המבוסס על ההבדל שלהםרמות ביטוי erent של CD45 9-13. בנוסף, מונוציטים פרו-דלקתיים (היי CD11b + Ly-6G CD45 - היי Ly-6C), נויטרופילים (היי CD11b + Ly-6G + CD45) ניתן להבחין ותת leukocytes אחרות של הרקמה איסכמית. גישה זו מספקת assay אמין והמהיר כדי להעריך neuroinflammation במודלים ניסיוניים של איסכמיה. עם זאת, עיבוד רקמות יכול להשפיע על מצב ההפעלה ומספרים של אוכלוסיות תאים השונות הנמצאות ברקמה איסכמית מתן אפיון חצי כמותית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל פרוטוקולי הניסוי דבקו בהנחיות ועדת צער בעלי החיים של Complutense Universidad (להלן הנחיות האיחוד האירופי 86/609 / CEE ו2003/65 / CE).

1. איסכמיה דגם מוחין

הערה: מודל איסכמיה המוחי במאמר זה כרוך בחסימה קבועה או זמנית של שני CCA (עורק התרדמה משותף) וMCA (עורק המוח אמצעי) על ידי קשירה עם תפר ניילון.

  1. הכנות טרום ניתוחיות
    1. לעקר את כל מכשירי הניתוח על ידי מעוקר או עם מעקר חרוז זכוכית. לחטא את אזור הניתוח עם אתנול 70% גם כן.
    2. הרדימי עכבר עם הרדמה מתאימה. להשיג אינדוקציה ב -2.5% isoflurane ולשמור על עם ידי isoflurane 1.5% בתערובת של 80% חמצן באוויר / 20% באמצעות אידוי. החל דמעות מלאכותיות לעיני עכברים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
    3. הנח את העכבר על כרית חימום המקושר לתשלוםמכשיר dback עם בדיקה טמפרטורה ממוקמת בפי הטבעת וטמפרטורה שנקבעה ברמות פיסיולוגיות (36.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס) במהלך ההליך הכירורגי.
  2. חסימת עורק התרדמה משותפת על ידי קשירה
    1. מניחים את העכבר שכיבה על גב ולשתק עם קלטת. לחטא את עור עם אתנול 70% או povidone-יודיד וחתך את השיער של חלק העליון הגחון.
    2. תחת מיקרוסקופ ניתוחי, לעשות חתך קו האמצע סנטימטר 1 סביב משטח הגחון של הצוואר.
    3. משוך רקמות מלבד כל רכות (רקמת בלוטות כוללים תת-לסתי, sublingual ובלוטות הפרוטיד) ולזהות את עורק התרדמה המשותפת שמאל (CCA), אשר מותאם לרוחב לקנה הנשימה. לחזור בו השרירים ולחשוף CCA שמאל. זהירות לנתח מעצב התועה.
    4. ברגע שגזור, לחסום את המרכז לאמנות עכשווית שהותיר מייתר באמצעות תפר 6/0 ניילון. ולקשור עם קשר קבוע או Slipknot (כדי לאפשר reperfusion אם מודל איסכמיה מוחי חולף הוא רצוי).
    5. הנח את רקמת הבלוטות למקומו המקורי ולסגור את החתך בעור הצוואר עם תפר 6/0 ניילון.
      הערה: בעלי חיים שאם הם כפופים לאותו הליך כירורגי כמו חיות MCAO אבל המרכז לאמנות העכשווית לא יחסום.
  3. חסימת דיסטלי אמצע מוחית עורק על ידי קשירה
    1. מקם את העכבר בצד הימני שלה ולשתק עם קלטת. לחטא את עור הראש עם 70% אתנול או povidone-יודיד וחתך את השיער של ראש העכבר (להסיר שיער לאחר החיתוך).
    2. תחת מיקרוסקופ ניתוחי, לעשות חתך בעור בין העין לאוזן. הזז את העור משם ומחזיק אותו עם קלטת.
    3. לעשות חתך אופקי על השרירים זמניים מימין לשמאל. ואז, לעשות חתך אנכי שני בצד ימין של השרירים זמניים (להיות זהיר, כדי למנוע וריד זמני חתך). לפרק את השריר הזמני מהגולגולת ולהחזיק אותו עם תפר כדי לשמור על פני גולגולת נקייה.
    4. נקה את משטח הגולגולתעם תמיסת מלח סטרילית קרה כדי לזהות את המיקום של העורקים עזבו התיכון מוחין (MCA) באמצעות שקיפות גולגולת המדויקת. בצע craniotomy עגול (1 מ"מ קוטר) עם בר נירוסטה באונה המצחית בין קשת הזיגומטית ועצם squamosal. מוציא בזהירות את הגולגולת ולחשוף את MCA.
    5. למרוח כמות קטנה של תמיסת מלח סטרילית קרה על פני השטח של המוח ולהסיר את קרומי המוח (דורה מאטר ונואיד) באמצעות מלקחיים.
    6. לבצע קשירה של MCA השאיר בתא מטען דיסטלי רק לפני הסתעפות בין הקדמי ואחוריים סניפי MCA. לחסום את MCA שהותיר מייתר באמצעות תפר 9/0 ניילון. ולקשור עם קשר קבוע או Slipknot (כדי לאפשר reperfusion אם מודל איסכמיה מוחי חולף הוא רצוי). פרק זמן שבין המרכז לאמנות עכשווית וחסימת MCA הוא בהתאם לניסיונו של המפעיל כ 10-20 דקות.
    7. הנח את השרירים זמניים למקומו המקורי ולסגור את incision על עור הצוואר עם תפר 6/0 ניילון.
    8. להחזיר את העכבר לכלוב להתאושש מההרדמה (בדרך כלל 5-10 דקות) ולהזריק את העכבר עם intraperitoneal עצירות (IP) (0.3 מ"ג / קילוגרם).
      1. לפקח על העכבר לכמה שעות כדי לזהות את אי נוחות (לא עוזב את העכבר ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על כיבה sternal). מאז משקל לאחר ניתוח איבד בדרך כלל נצפה, למקם מזון מרוסק בצלחת פטרי כדי להקל על אכילה.
    9. כאשר החיה התאוששה לחלוטין, לחזור לחברה של בעלי חיים אחרים.
    10. אם מודל MCAO חולף הוא רצוי, להרדים את העכבר שוב ולהסיר את Slipknot של המרכז לאמנות העכשווית וMCA לאפשר reperfusion (בדרך כלל בין 0.5-2 שעות (איור 1)).
      הערה: בעלי חיים שאם הם כפופים לאותו הליך כירורגי כמו חיות MCAO אבל MCA לא יחסום.

2. זלוף וsectioning של רקמת המוח

  1. 24 או 48 שעות לאחר MCAO, להקריב את העכבר עם מנה קטלנית של חומר הרדמה (למשל, pentobarbital נתרן, IP 86 מ"ג / קילוגרם או מנת יתר עם ​​isoflurane).
  2. Perfuse העכבר עם חיץ פוספט 0.1 M ואחריו paraformaldehyde 4% (PFA) בחיץ פוספט (pH 7.4).
  3. הסר את המוח באופן הבא:
    1. לערוף את החיה בדיוק מעל עמוד השדרה.
    2. ביצוע חתך אחורי-קדמי על העור של הראש כדי לחשוף את הגולגולת. שני חתכי רוחב בצומת של קירות הרוחב ובסיס הגולגולת ולהסיר את החתיכה הקטנה של עצם.
    3. ביצוע חתך דרך הגולגולת לאורך תפר sagittal.
    4. הסר את הגולגולת מעל כל חצי הכדור באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את המוח. השתמש במרית כדי להפריד את המוח מהגולגולת ולהעביר אותו ל -4% פתרון PFA.
  4. פוסט לתקן במשך 3 שעות ב 4% פתרון PFA ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. הסר פתרון PFA וincubatדואר המוח במשך 48 שעות ב -30% תמיסת סוכרוז לcryoprotect המוח.
  6. הסר פתרון סוכרוז ולהקפיא את המוח במהירות באיזופנטאן הקר (-40 מעלות צלזיוס). חנות קפוא מוח ב -80 ºC.
  7. להשיג חלקי העטרה מוח (30 מיקרומטר) עם microtome הקפאה. לאסוף עשרה סטים סידוריים בפתרון cryopreservative. כל סט סידורי מורכב מסביב 14-16 פרוסות העטרה עם מרחק interslice של 300 מיקרומטר שכראוי לדגום מוח העכבר בין 1.94 ו-2.46 האחוריים לגבחת.

הערכת נפח 3. Nissl מכתים ואוטם

  1. צביעת Nissl ידי סגול cresyl
    1. חלקים במוח הר לשקופיות מיקרוסקופ Superfrost. לקביעת נפח אוטם בשיטת Cavalieri בסעיפים מוכתמים-Nissl, להשתמש חלק 1/20 הפרוסה-דגימה (1/2 חלקיו של אחד מעשר קבוצות סדרתי שנאספו בשלב 2.7; כ, מספר כולל של 7-8 חלקים עם מרחק interslice של 600 μ; מ 'משמשים). להיות זהיר כדי לשמור על אורינטציה קדמית, אחורי ראויה (אזור infarcted ממוקם בצד ימין).
    2. לבצע מכתים Nissl קונבנציונלי כדלקמן:
      1. לאפשר סעיפים רכוב שקופיות לייבוש למשך מספר שעות.
      2. רעננותם סעיפים רכוב שקופיות ולהכתים עם 0.1% פתרון סגול cresyl במשך 5 דקות.
      3. ליבש עם סדרה מדורגת של EtOH (70%, 90%, ו -100%; 5 דקות לכל שינוי). נקה את החלקים רכוב שקופיות עם קסילן, להוסיף distrene-80 קסילן plasticizer (DPX) תקשורת הרכבה ולכסות עם coverslip זכוכית.
  2. שימוש בתוכנת stereological להעריך בשיטת Cavalieri בנפח אוטם Nissl מוכתם סעיפי סדרתי
    1. השתמש בפרמטרים שמוצגים בטבלה 1 לכמת נפח אוטם על ידי מערכת stereology, אשר מורכבת ממצוידים במצלמה, שלב מחשב XYZ ממונע מיקרוסקופ שיטת Cavalieri 14 ו, ותוכנת stereological (הראשיהוראות המפורטות להלן קשורות למחשבים אבל הכיוונים עשויים להיות שונים עבור מערכות הפעלה אחרות).
    2. הפעל את מחשב, מיקרוסקופ, בקר במה ומצלמה בצו המתאים. הפעל את תוכנת stereological.
    3. הזז את מטרת 10X למקום ובחר את 10X מהירידה האובייקטיבית בתפריט.
    4. לנוע הסעיף מוכתם Nissl הראשון ולמצוא נקודת התייחסות מתאימה. לחץ על העכבר כדי לקבוע את נקודת ההתייחסות (לנוע יש צורך פעיל לחץ חופשי השמחה).
    5. להעריך את "עובי הסעיף רכוב" (עובי הסעיף בפועל לוקח בחשבון את ההתכווצות). לחץ על כפתור "פוקוס מיקום מד" ולחשב את העובי מ התחתון לחלק העליון של הסעיף.
    6. צור כלי גובה לcontralesional ואזורי ipsilesional ואזור infarcted.
      1. לחץ על "התצוגה" בתפריט ובחר באפשרות "הגדרות תצוגה". זה פותח tהוא הצגת הגדרות דיאלוג.
      2. בחר בכרטיסייה "קווי המתאר" ולחץ על הכפתור "הוסף סוג קונטור".
      3. צור מתאר לכל איזור לכמת ולהפוך אותם לגלויים בגובה למטה בתפריט. לחץ על אישור.
    7. צור כלי מרקר לcontralesional וההמיספרות ipsilesional ואזור infarcted.
      1. לחץ על "התצוגה" בתפריט ובחר באפשרות "הגדרות תצוגה" כדי לפתוח את הדו-שיח הגדרות תצוגה.
      2. בחר בכרטיסייה "סמנים" ולשנות את הסמנים שם על ידי לחיצה כפולה על הסמנים הזמינים. הפוך אותם לגלויים בבר דה מרקר. לחץ על אישור.
    8. הפעל את מנהל הסעיף.
      1. לחץ על התפריט "כלים / מנהל מדור סידורי". הוסף מקטע חדש עם הכפתור "הסעיף החדש". כפתור זה מפותח את "הדו-שיח הגדרת סעיף סידורי".
      2. הגדר את "הבלוק מתקדם" 30 מיקרומטר. הגדר את"עובי רכוב סעיף" עם השווי המוערך בשלב 3.2.5.
      3. הגדר את "הערכת המרווח" כ20. השתמש בבר דגימה 1/20 פרוסה.
      4. להגדיר "מספר הסעיף מתחיל" כ1. הגדרה "ערך ציר Z לחלק העליון של החלק הראשון", כפי שאישור 0. לחץ.
    9. לצייר קווי המתאר להתוות את האונה הנגדית.
      1. בחר בכלי חצי הכדור Contralesional (שנוצר בעבר בצעד 3.2.6) מהגובה למטה בתפריט.
      2. לצייר קווי המתאר להתוות את האונה הנגדית.
      3. כדי לסיים התחקות חצי כדור contralesional, לחץ לחיצה ימנית בעכבר ובחר "קונטור הקרוב".
    10. להעריך את גובה חצי הכדור contralesional ידי Cavalieri.
      1. לחץ על התפריט "בדיקות" ובחר Cavalieri הערכת. להגדיר "רשת ריווח" 100 מיקרומטר. להגדיר "רשת רוטציה", כפי שהוגדר 0. "Bלנעול מתקדם "30 מיקרומטר. לחץ על אישור.
      2. בחר באפשרות "contralesional חצי הכדור" כפתור מהסמנים בר. לחץ לחיצה ימנית בתוך קווי המתאר חצי כדור Contralesional.
      3. בחר באפשרות "צבע Cavalieri סמני מצב". קליק ימני בתוך קווי המתאר חצי כדור contralesional שוב ובחר "סמני צבע לקונטור".
      4. בטל Cavalieri הערכת על ידי לחיצה על בדיקות וCavalieri הערכת ולהפסיק את לחצן סמן contralesional משורת הסמן.
    11. חזור על אותו התהליך בחצי כדור ipsilesional ואזור infarcted (צעדי 3.2.7 ו3.2.8). שמור את הנתונים לאחר ההערכה של השטח של כל קטע.
    12. לחשב את האזורים הנגדי, ipsilesional וinfarcted בשאר החלק הצבעוני Nissl.
      1. צור מקטע חדש כמו בשלב 3.2.6. אין לשנות את הערכים שהוזנו בהדו-שיח "סידורי הגדרות פרק". לחץ על אישור.
      2. חזור על שלבי 3.2.7-3.2.8 בקטע החדש.
    13. לייצא את התוצאות של כימות לקובץ גיליון אלקטרוני.
      1. לחץ על "בדיקות" בתפריט חוקר סטריאו. בחר באפשרות "תצוגת Probe הפעלת רשימה". הפעולה זו פותחת את "Stereological הקודם פועלת דיאלוג".
      2. בחר את כל החלקים על ידי לחיצה עליהם. לחץ על הכפתור "צג תוצאות". זה מפותח "הערכת Cavalieri תוצאות" שבו השטח המוערך והנפח לכל איזור מוצגים.
      3. כדי לייצא את התוצאות לקובץ גיליון אלקטרוני, לחץ על "העתק את כל התוצאות ללוח" ולהדביק לקובץ אקסל עם התוצאות העיקריות שהתקבלו מכל אזור (טבלה 2).
    14. Express נפח אוטם כמ"מ 3 או כ% מחצי הכדור שהוא infarcted (IH%) באמצעות IH 15% הנוסחה = InfVol / ContrVol * 100, שבו
"> InfVol (כרך Infarcted רקמות) ove_content = ΣInfArea i,
(כרך Contralesional חצי הכדור) ContrVol = ΣContrArea i

4. Stereological כימות הסתננו נויטרופילים אחרי מוחין איסכמיה ידי Fractionator האופטי

  1. צביעה של החלקים במוח:
    1. להערכת המספר הכולל של נויטרופילים הסתננו לאחר MCAO ידי fractionator האופטי 16, להשתמש בבר דגימה 1/10 פרוסה. נויטרופילים Immunostain על ידי שימוש בטכניקות immunofluorescence קונבנציונליים עם הנוגדן אנטי-עכברוש Ly6G (1A8) ונוגדנים משני ממש על סעיפי ריחוף ללא. בנוסף, counterstaining עם יצרנית גרעינית כמו DAPI או TOPRO, למרות שזה לא הכרחי לזיהוי נויטרופילים, יכול לעשות יותר קל לזהות את אזור infarcted.
    2. חלקים במוח הר לשקופיות מיקרוסקופ Superfrost עם אזור infarcted ממוקם בצד ימין.
  2. Quantification של לויקוציטים הסתנן במוח איסכמי ידי fractionator האופטי
    1. פרמטרים שימוש שמוצגים בטבלה 3 לכמת leukocytes הסתננה במוח איסכמי על ידי גישת fractionator האופטית עם מערכת stereology. חזור על שלבי 3.2.1-3.2.5 מסעיף 3.
    2. צור כלי גובה לאזור infarcted כפי שתואר בשלב 3.2.6 של הסעיף 3.
    3. צור כלי סמן לנויטרופילים כפי שתואר בשלב 3.2.7 של הסעיף 3.
    4. הפעל את מנהל המדור וליצור קטע חדש כמו בשלב 3.2.8. במקרה זה, קבע את "הערכת המרווח" 10 (שבר דגימה 1/10 הפרוסה משמש לאמידת מספר נויטרופילים).
    5. בחר בכלי הגובה "שטח Infarcted" (שנוצר בעבר בצעד 4.2.1) מהגובה למטה בתפריט. לצייר קווי המתאר להתוות את אזור infarcted ב10X האובייקטיבי. לשנות את המטרה ל100X לבצע neutrophכימות il (אל תשכחו לבחור את 100X מהירידה האובייקטיבית בתפריט).
    6. לחץ על "בדיקות" תפריט ובחר "Fractionator האופטי". הגדר את "XY המיקום של ספירת מסגרות", כפי 230 לשניהם X וגודל Y רשת. הגדר "Grid סיבוב" כ0. Set "הבלוק מתקדם" 30 מיקרומטר. לחץ על אישור.
    7. בחר בלחצן "נויטרופילים" מבר דה מרקר. מארק מוכתם נויטרופילים באזור infarcted. לאחר סיום, לבטל את הבדיקה Fractionator אופטית על ידי לחיצה על "בדיקות" ו- "Fractionator האופטי". לבטל את כפתור נויטרופילים משורת הסמן.
    8. חזור על אותו ההליך לכל קטע (4.2.4-4.2.9).
    9. לייצא את התוצאות של כימות לקובץ גיליון אלקטרוני.
      1. לחץ על "בדיקות" בתפריט חוקר סטריאו. בחר באפשרות "תצוגת Probe הפעלת רשימה" כדי לפתוח את "פועל Stereological הקודם"הדו-שיח.
      2. בחר את כל החלקים על ידי לחיצה עליהם. לחץ על "צג תוצאות" לחצן כדי לפתוח "תוצאות Fractionator אופטיות" שבו המספר המשוער של נויטרופילים מוצג.
      3. לייצא את התוצאות לקובץ גיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על "העתק את כל התוצאות ללוח" ולהדביק לקובץ גיליון אלקטרוני.

ניתוח 5. המוח דיסוציאציה וcytometry הזרימה

הערה: אפיון תת-אוכלוסיית מיאלואידית על ידי זרימת cytometry על רקמת מוח טרי יכולה לשמש כתחליף לאפיון נויטרופילים הקודם שבוצע על חלקים במוח קבועים immunostained.

  1. ניתוק מוח והכנת השעיה תא בודדת
    1. הפוך 10 מיליליטר / חיה של (בינוני Roswell Park זיכרון מכון) RPMI פתרון -Percoll המכיל 8 מיליליטר של RPMI, 1 מיליליטר של 30% Percoll ו 1 מיליליטר של (נאגר מלוח פוספט) 10x PBS.
    2. Rמוח emove עכבר לאחר MCAO כפי שמתוארים בשלב 2.3.
    3. תחת מיקרוסקופ, לנתח את תחומי ליבה ופרי אוטם של קליפת מוח ipsilateral מעכבר איסכמי במוח (או אזור דומה לאחיזת עיניים ובעלי חיים נאיביים) מהמוח. משקל רקמת המוח ולמקם אותו לתוך 5 מיליליטר של קר כקרח RPMI-Percoll (צעד המשקל יכול להתבצע לנורמליזציה בין קבוצות ניסוי).
    4. לנתק את הרקמה בהשעית תא בודדת באמצעות מטחנת רקמה פוטר-Elvehjem סוג עם עלי טפלון.
    5. העבר את מתלי תא צינור ultracentrifuge 50 מ"ל ולהוסיף 5 מיליליטר יותר של פתרון RPMI-Percoll לדגימות.
    6. צנטריפוגה השעיות התא ב7,800 XG למשך 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להבטיח שכבה בצבע לבנה המתאימה למיאלין מופיעה בחלק העליון של הפתרון.
    7. להסיר את שכבת המיאלין בזהירות ולסנן את השעיות תא כולו, כוללים תאי הטבליות, דרך straine רשת ניילון 40 מיקרומטרr.
    8. הוסף 10 מיליליטר של RPMI על המסננת כדי להבטיח שכל התאים מסוננים ולמקם את הפתרון בשפופרת 50 מיליליטר. הוסף 30 מיליליטר של RPMI ו צנטריפוגות 50 מיליליטר של השעיה תא ב 600 XG במשך 10 דקות ב RT.
    9. בטל supernatant ו resuspend גלולה לויקוציטים עם 1 מיליליטר של PBS. הוסף 4 מיליליטר של חיץ תמוגה (150 מ"מ NH 4 Cl, 10 מ"מ NaHCO 3 ו 0.1 mM EDTA) דגירה התאים במשך 2-3 דקות ב RT לlyse אריתרוציטים מהשעית התא. צנטריפוגה הפתרון ב 600 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. ומכתים תא cytometry זרימה
    1. הכן קוקטייל תיוג לזרימה cytometry, המכיל 200 μl של PBS-BSA (1%) 1: 100 Fc-בלוק, 01:40 עכברוש-PerCP אנטי CD45, 01:40 עכברוש אנטי-Ly6G-APC, אנטי 01:40 עכברוש CD11b-FITC ו01:40 אנטי-Ly-6C-PE חולדה לדגימה.
    2. Resuspend תאי קוקטייל תיוג דגירה הדגימות במשך 45 דקות בקרח.
    3. שטוף את קוקטייל התיוגעם 1 מיליליטר של PBS הקר ו צנטריפוגות התאים ב 600 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. Resuspend גלולה עם FACS של זרימת 100 μl ולרכוש את כל ההשעיה התא על ידי הזרימה cytometry.
    4. השתמש בזרימה cytometry תוכנת ניתוח לאפיין ולכמת אוכלוסיות תאים.
      1. ניתן לאפיין תת ויקוציטים עיקריים המתאים לקוקטייל התיוג מוכן בפרוטוקול זה באופן הבא: + CD45 lo CD11b: תאי microglial תושב; CD11b CD45 היי + Ly-6G +: נויטרופילים; - CD11b היי CD45 + Ly-6G היי Ly-6C: מונוציטים פרו-דלקתיים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל איסכמיה המוחי המוצג כאן מייצר אוטמים ראו אך ורק בקליפה מבלי להשפיע על רקמת striatal מאז סניפי lenticulostriatal של MCA שלהשקות סטריאטום לא יחסמו (איור 1). על ידי צביעת Nissl, האזור הפגוע יכול להיות מזוהה כאזור hypochromic קליפת המוח (איור 2). מודל זה מאופיין במחזורי אוטם לשחזור מאוד ב 24 שעות לאחר MCAO (IH% 15.89 ± 0.28) מוערך על ידי שיטת Cavalieri בסעיפים מוכתמים-Nissl (איור 2). הערכה של נפח infarcted בשיטת Cavalieri היא גישה מדויקת עם שגיאה נמוכה שבאה לידי ביטוי במקדם של השגיאה (CE) של Gundersen בההמיספרות contralesional וipsilesional כמו גם באזור infarcted (הטבלה 2). נפגע נפח רקמה יכול לבוא לידי ביטוי במ"מ 3, אלא גם כIH% באמצעות הנוסחא בסעיף 3.2.13. בנוסף, להערכתמהנפח הכולל של אזורי ipsilesional וcontralesional מאפשר לחישוב מדד בצקת לתקן את נפח infarcted ולהימנע מהערכת יתר של הרקמות הפגועות (טבלה 2).

בהתחשב בעיבוד חתך הסידורי של רקמת המוח, זה יכול להיות מנוצל כדי לבצע הערכה מדויקת של המספר הכולל של תת-אוכלוסיות של תאים, כמו נויטרופילים הסתננו, באזור איסכמי, באמצעות גישת Fractionator האופטי (איור 3 ולוח 4) עם פרמטרים שמוצגים בטבלה 3. פרוטוקול זה אומד מספר כולל של נויטרופילים (תאי Ly6G-חיוביים) באזור infarcted של 23328 ± 3,623 ב 24 שעות ו± 82856 8143 בשעה 48 בעכברים לאחר pMCAO (איור 3D). בהסכם עם מחקרים קודמים, חדירת נויטרופילים מתואמת ישירות עם גודל האוטם (איור 3E). הערכה של tהוא מספר הנויטרופילים בשיטת Fractionator האופטי הוא גישה מדויקת עם שגיאה נמוכה שבאו לידי ביטוי בספירה של Gundersen (לוח 4).

הבידוד לויקוציטים וזרימת cytometry פרוטוקול אפיון מאפשר בידוד של 47922 ± 23174 תאי מיאלואידית מהקליפה של חצי הכדור ipsilesional של עכברי איסכמי. זה כולל 10-30% מהאירועים הכולל שנמצאו בהשעית התא. רובם המכריע של אירועים שנתפסו באמצעות פרוטוקול זה הווה פרמטר FSC נמוך, הקשורים לפסולת תאית (איור 4). הכתמת CD11b מראה כי התאים CD11b + ערך FSC גבוה יותר (איור 4), המצביעים על כך פסולת תא אינה מסומנת בסמן זה, וכפי שצוין בעבר, שזה יכול להיות מחוץ ניתוח נוסף על ידי קביעת סף FSC ב 200 9. הכמות המשתנה של פסולת תא שהושגה עם שיטה זו מצביעה על כך שהבדלים בתהליך הדגימהing (עיתוי, שימור רקמות, טמפרטורת מדגם, הסרת המיאלין יעילה, וכו ') יכול להסביר את זה. בנוסף, השימוש במסננות תא נחוץ גם כדי למנוע את נוכחותו של מהדק סלולארי בדגימות; צעד זה צריך להיעשות לפני מכתים תא. שימוש באסטרטגית gating שמוצגת באיור 5 המבוסס על CD11b וביטוי CD45, אנו יכולים להבחין בין התושב ותאי מיאלואידית הסתננו ברקמה איסכמית. עליות אוכלוסיית CD11b + זה בחץ כדור איסכמי בהשוואה לנאיבית ועם קבוצת הדמה, שבו תאים אלה בעיקר קשורים לביטוי נמוך של CD45 המצביעים על כך מיקרוגליה הוא מתרבים לאחר איסכמיה (איור 4, איור 5 ולוח 5) . הבדל זה הוא כנראה עקב חדירת תא מהפריפריה, כפי שמעיד על ידי הופעתו של תת-אוכלוסייה של תאים היי CD11b + CD45 במוח איסכמי (איור 4 , איור 5 ולוח 5) שהוא מספר נמוך בנאיבי ובמוח של העמדת פנים. התרומה של מחלחל לאוכלוסיית תא CD11b + באיסכמיה היא תהליך דינמי מאוד 4. במודל MCAO על ידי קשירה, זה יכול להשתנות מ -30% ל -60% מCD11b + התאים הכולל תלוי בגודל של הנגע ושל הזמן שבו האפיון שנעשה. נויטרופילים, מאופיינים כתאי Ly-6G +, הם אוכלוסיית התא הסתנן הרבות ביותר נמצאת ב 24 שעות לאחר MCAO במוח עכבר איסכמי באמצעות מודל זה של איסכמיה המוחית, כפי שהם מהווים 70-80% מCD11b + CD45 היי. שאר התאים הם בעיקר תת-אוכלוסייה של CD11b + CD45 היי Ly-6G - מונוציטים Ly-6C היי פרו-דלקתיים. במודל זה, אוכלוסייה זו תגדל במספר באזורים במוח איסכמי 24-48 שעות לאחר MCAO.

ithin-page = "תמיד"> figure-results-1
איור 1:. הליך כירורגי לקשירת MCA () לאחר הנסיגה של השרירים זמניים, פתיחת גולגולת קטנה מתבצעת בגולגולת העכבר. MCA גבעול על ידי קשר או Slipknot באמצעות תפר 9/0. (ב) נציג תמונות של הנגע בקליפת המוח שנוצר על ידי מודל MCAO. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2: כימות אוטם על ידי Cavalieri נפח. (א) נציג תמונות של חלקים במוח צבעוניים Nissl 24 שעות לאחר קשירת MCA קבועה. ההגדלה הגבוהה מציגה את אזור hipocromatic לאחר צביעת Nissl שמזהה את האזור הפגוע (ליבה) לאחר MCAO. פרי-אוטם האזור (PI) מוצג גם. (ב) כימות של האוטם מיוצג כ% Infarcted חצי הכדור (IH%) על ידי שימוש בשיטת Cavalieri בסעיפים מוכתמים-Nissl סדרתי, 24 שעות לאחר MCAO (n = 50 עכברי הנפח ).

figure-results-3
איור 3: כימות Stereological של נויטרופילים באזור infarcted 24 ו -48 שעות לאחר קשירה, תוך שימוש בשיטת Fractionator אופטית. תמונה () נציג של נויטרופילים הסתננו (תאי Ly6G-חיוביים) באזור איסכמי ב 24 שעות לאחר MCAO. תיחום מציג את אזור infarcted. (B, C) ​​דוגמאות למבתר אופטי לכימות נויטרופילים ידי fractionator האופטי. (ד) כימות של נויטרופילים הכולל באזור infarcted ב 24 ו- 48 שעות (n = 4 עכברים). (E)מתאם של מספר הנויטרופילים עם גודל האוטם ב 24 ו -48 שעות לאחר קשירת MCA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4:. ניתוח פיזור dot-עלילת נציג של לויקוציטים המוח המתקבל מנאיבי, זיוף ואיסכמי (24 שעות לאחר MCAO) ההמיספרות על בסיס פרמטרים פיזיים (SSC וFSC) אוכלוסייה של אירועים המבטאות CD11b (אדום) זוהתה בכל הקבוצות. אוכלוסייה זו מגודרת ומאופיינת על פי הביטוי של CD45. תאים המבטאים רמות נמוכות של CD45 (ירוק) היו נוכחים בקליפת מוח איסכמי ולא-איסכמי ותואמים את תאי microglial. בניגוד לכך, תאים המבטאים רמות גבוהות של CD45 (צהובים) היו רקמצא בחצי כדור איסכמי ובקבוצת דמה מידה פחותה. ניתוח נוסף של האוכלוסייה היי CD11b + CD45 מצביע על כך שמונוציטים נויטרופילים (Ly-6G + תאים, כחולים) ופרו-דלקתיים (תאים היי Ly-6C, כתומים) הם תת-אוכלוסיות התאים העיקריות שנמצאו במוח מחלחל 24 שעות לאחר שבץ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
איור 5:. Gating אסטרטגיות כדי לבדל את התושב מתאי מיאלואידית הסתננו ברקמה איסכמית תא CD11b + היה מגודר ראשון לפי עוצמת הקרינה אלוטיפ (). עלילת נקודת נציג של מתלי תא של מוח איסכמי מוצגת בפינה עד-ימנית של הלוח. בבנוסף, ערכים אופייניים למספר הכולל של אירועים ולמספר CD11b + האירועים שנרכשו באמצעות טכניקה זו מוצגים (לא של תאים / חצי הכדור המוח איסכמי;. (א) ניתוח עוצמת CD45 הקרינה של התאים + CD11b מוצג בלוח ב ניתוח עלילת נקודת נציג ביטוי CD45 וCD11b של תת-אוכלוסיית CD11b + מגודר מוצג בפינה עד-ימנית של הלוח. בנוסף, המספר האופייני לתאים היי CD45 lo CD45 רכשו לאונת מוח איסכמי באמצעות טכניקה זו מוצג (B).

פרמטרים המשמשים לשיטת Cavalieri
עובי סעיף (t) 30 מיקרומטר
מטרה 10X
חלק Slice דגימה (SSF) 1/ 20
מרחק בין חלקים 600 מיקרומטר
מרווחי רשת 100 מיקרומטר

טבלה 1: פרמטרים המשמשים לכימות stereological של רקמת infarcted.

תוצאות Contralesional Ipsilesional אוֹטֵם לֵב
אזור (μm²) 151460000 155060000 22600000
נפח (μm³) 90876000000 93036000000 13560000000
נפח מתוקן ל
במהלך הקרנה (μm³) 		89957100000 92046300000 13416600000
מקדם של שגיאה (Gundersen),
מ = 0 		.068 0.077 0.067
מקדם של שגיאה (Gundersen),
מ '= 1 		0.015 0.017 0.015
מקדם של שגיאה (Gundersen),
אלפא (q) 		.068 0.077 0.067
% Infarcted חצי כדור 14.90
המוח יתכן בצקת (כרך שב"ס כרך / המשך) 1.02

טבלה 2: דוגמאות מייצגות של כרכי contralesional, ipsilesional ואוטם בשיטת Cavalieri שימוש בתוכנת חוקר סטריאו.

= "2" פרמטרים> משמשים לfractionator האופטי תוחלת
עובי סעיף (TSF) 30 מיקרומטר
מטרה 100X
חלק Slice דגימה (SSF) 1/10
ספירת גובה מסגרת 40 מיקרומטר
ספירת רוחב מסגרת 40 מיקרומטר
גודל רשת X 230 מיקרומטר
גודל רשת X 230 מיקרומטר
משמר בטוח 2 מיקרומטר
גובה Disector אופטי 14 מיקרומטר

טבלה 3: פרמטרים המשמשים לכימות stereological של נויטרופילים הסתננו לאחר איסכמיה עם חללית fractionator האופטית על ידי שימוש בתוכנת חוקר סטריאו.

הערכה של נויטרופילים ידי Fractionator האופטי
מספר דגימת האתרים 430
לעצב את פקטור 6.24
סה"כ סמני ספרה 166
נויטרופילים הוערכו על ידי Fractionator האופטי 117,608.03
מקדם של שגיאה (Gundersen), מ '= 0 0.22
מקדם של שגיאה (Gundersen), מ '= 1 0.09
cing = "0">

לוח 4: דוגמא נציג של אומדן נויטרופילים הסתננו לאחר איסכמיה עם חללית Fractionator אופטית על ידי שימוש בתוכנת חוקר סטריאו.

CD11b + נויטרופילים מונוציטים Microglia
נאיבי 25863 ± 4,575.8 473 ± 75.8 525 ± 191.4 19012 ± 1,523
hr 24 Sham 24563 ± 5263 873 ± 192.5 1,124 ± 391.5 23734 ± 2,910
hr pMCAO 24 47922 ± 23174 4874 ± 748.7 4826 ± 1,345 35395 ± 10833

לוח 5: תוצאות נציג של תאי מיאלואידית נאמדים לאחר איסכמיה עם זרימת גישת cytometry.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל איסכמיה המוחי הציג כאן נותן כרכי אוטם מאוד לשחזור נקבעו 24-48 שעות ו -7 ימים לאחר MCA קשירה ידי גישות שונות 8,15,17. יש מודל MCAO זה שיעור נמוך תמותה (פחות מ -1%) בהשוואה לאחרים, צמצום מספר בעלי החיים המשמשים במחקרים. שלב קריטי כדי להשיג את השיעור הנמוך הזה של תמותה הוא לשמור על תנאים אספטיים נאותים כדי למנוע זיהומים שעלולים לפגוע בהישרדות לאחר אינדוקציה שבץ. מודל MCAO זה יכול לא רק לשמש כמודל MCAO קבע, שנחשב למודל רלוונטי קליני למחקר translational 18, אלא גם כמודל חולף ידי קשירה זמנית של המרכז לאמנות העכשווית וMCA עם Slipknot וreperfusion האחורי בזמן הרצוי 19. שיטה זו שמשה בהצלחה בעכברים וחולדות 17,20. כל ראיות מצביעות על כך שזה MCAO על ידי קשירה הוא מודל רב-תכליתי גבוה של איסכמיה המוחית עם יישומים מרובים. Critiצעד cal של טכניקה זו הוא שהיא דורשת ניתוח פולשני תחת סטראו; craniotomy צריכה להתבצע בזהירות רבה כדי לא לפגוע בעצם הלחי, כמו גם את MCA. עם זאת, השימוש בבעלי חי דמה (אשר נתון להליך כירורגי אבל קשירת CCA וMCA לא מתבצע) מספק כלי שימושי להפלות השפעות הליך תלוי כירורגית. הבאות בטכניקה זו המידה של פגיעה מוחית ניתן לכמת על ידי מספר שיטות. הפרוטוקול של חתך מוח, מכתים Nissl וההערכה הבאה של אמצעי האחסון על ידי Cavalieri שלנו מאפשר לכימות מדויק של האזור הפגוע וממזער את מספר העכברים המשמשים בסוג זה של מחקרים מאז חלקים במוח הסידורי יכולים לשמש גם לניתוח immunohistochemical שונה. לביצועים טובים יותר של מתודולוגיה זו, זה קריטי לבחור את הפרמטרים המתאימים בשימוש בתוכנת stereology (טבלה 1) שיהיה צורך להערכת הדואר נפח של האזורים השונים על ידי הנוסחא: V = 1 / SSF * * f * t ΣP i (SSF הוא שבר דגימת פרוסה, t הוא העובי הממוצע של הסעיפים, f היא האזור של ריווח הרשת ו ΣP את מספר הנקודות שפגע במבנה).

MCAO דיסטלי על ידי קשירה יכול להיות שימושי כדי לאפיין את ויקוציטים הסתננו ותת-אוכלוסיות של תאים חיסוניים 8,13 המשתתפים בתהליך הדלקתי בעקבות פציעת מוח 1-4. כאן, אנו מציעים שתי שיטות שונות לאפיון תאים חיסוניים במוח, גישת stereological מדויקת וניתוח הזרימה cytometric לטוב האפיון תת-אוכלוסיות leukocytes מרובה.

מנצלת את חתך מוח סדרתי, כימות של המספר הכולל של נויטרופילים יכולה להיות מושגת על ידי השיטה האופטית fractionator 16, האומדת את המספר הכולל של תאים ממספר התאים שנדגמו שנינותחה סט שיטתי נדגמים מקריים (SRS) של חללים משוחדות וירטואליים ספירה מכסים את האזור כולו של עניין, במקרה שלנו באזור האוטם, עם מרחק אחיד בין חללי ספירה וירטואליים משוחדות בX כיוונים, Y ו- Z. שיטה זו מספק כלי מדויק ל להעריך מספרי נויטרופילים הכולל במוח איסכמי בזמנים שונים לאחר קשירה. למרות שזה לא הוכח במחקר זה, פרוטוקול זה יכול לשמש גם להערכה של תת-האוכלוסיות השונות נויטרופילים לאחר איסכמיה 21 ולכימות מדויק של כל אוכלוסיית תאים אחרת הנמצאת במוח איסכמי כמו כדוריות דם לבנות הסתננו אחרים (מונוציטים / מקרופאגים) וגם להערכת הנוירונים ששרדו או אפילו לכימות neurogenesis לאחר שבץ. הצעד החשוב ביותר להערכה מדויקת באזור הרצוי הוא הבחירה של הפרמטרים המתאימים, כמו אלה שמוצגים בטבלה 3 לכימות נויטרופילים באזור איסכמי.פרמטרים אלה ישמשו לתוכנת stereology כדי לחשב את מספר התאים החיוביים הכולל (N) על ידי שימוש במשוואה N = ΣQ- x 1 / SSF x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- הוא המספר הכולל של תאים נספרו ב fractionator, SSF הוא שבר דגימת הסעיף, ASF הוא אזור שבר הדגימה, וTSF הוא עובי בר דגימה) 5. למרות שמתודולוגיה זו היא איטית יותר מאשר טכניקות כימות אחרות (לדוגמא, ניתוח של סמני נויטרופילים ידי מ"ג של רקמה, צפיפות של תמונות או מספר הנויטרופילים לכל שדה נציג), יש לו את היתרון להיות משוחד וטכניקה מוצקה המספקת מדויק כימות של מספרים סלולריים.

גישת בידוד ויקוציטים המוח מאפשרת זיהוי בו זמני וכימות של כמה תת תא חיסון ללא הצורך בהטית המערכת על ידי צביעת in vivo או מניפולציות גנטיות. תא לאחר מיון מp מיאלואידית המאופייןopulations או הפרדת immunomagnetic יכול לשמש ליישומים במורד הזרם מרובים, כגון מחקרים נוספים על גן או ביטוי חלבון. האפיון מדויק של נויטרופילים, מונוציטים ומיקרוגליה מתקבלים בשיטה זו מספק סגוליות גבוהה ביחס לשיטות קיימות, כגון מחקרי immunohistochemical, יתרון המאפשר הקצאת פונקציות ספציפיות לתאי מיאלואידית השונים אשר מתווכים תגובה חיסונית מולדת במוח. בנוסף, ניתן להאריך עוד יותר לאפיין אוכלוסיות אחרות במוח עם התווית המתאימה, כמו מקרופאגים דם נולד (CD11b + היי CD45 CD68 +), וזה יכול להיות מיושם לחקר פתולוגיות אחרות במערכת העצבים המרכזית או פציעות. לכן טכניקה זו מספקת כלי חיוני כדי לחקור את ההטרוגניות של התגובה הדלקתית במוח. מגבלה העיקרית של טכניקה זו מתגוררת בהכנת השעיות ויקוציטים מרקמת המוח טרי, אשר יכולה לשנות אתמצב הפעלה של התאים או שינוי אנטיגן. למרות שטכניקה זו מאפשרת אפיון איכותי יותר מפורט בהשוואה למחקרי immunohistochemical, היא מספקת כימות פחות מדויק המבוסס על בידוד תא. למרות זאת, את היעילות של פרוטוקול בידוד תא שלנו היא דומה לשיטות אחרות שפורסמו 9 וניתן להשתמש בו ביעילות כדי לזהות הבדלים במספר התאים חיסוניים במוח בין שליטה וקבוצות MCAO או אפילו בין קבוצות MCAO נתון לטיפולים שונים 8.

שלבים קריטיים של פרוטוקול זה הם לנתיחה הרקמה, הליך שיבוש רקמות, והסרת המיאלין. בנוגע לאיסוף הרקמות, ניתן לכלול צעד נורמליזציה (בהתחשב ברקמה שנאספו), כדי למנוע השתנות בשל הופעות נתיחה שונות. בנוסף, נורמליזציה בין קבוצות MCAO השונות יכולה להתרחש גם דרך נפח אוטם (שנקבע בעבר על ידי R המגנטיesonance). דרך נוספת לפתור את הבעיה הזו היא להשתמש בכל חצי הכדור ipsilateral של שני קבוצות איסכמי ושליטה, או אפילו להשתמש באונה הנגדית של עכבר איסכמי כביקורת כדי למזער את מספר בעלי החיים המשמשים. בעוד גישה זו נמנעת הבדלים בין כל נתיחה, יש לו חסרון עיקרי; גורם לדילול נוסף על ידי הגדלת המספר הכולל של תאים אך לא את מספר תאי מיאלואידית אשר ממוקמים באופן בלעדי בתחומי הליבה ופרי אוטם של קליפת המוח ipsilateral. לגבי שיבוש רקמות, פרוטוקול זה מדגים את השלבים להפרעה המכנית של תאי מוח, הימנעות טיפולים האנזימטית ומניעת שינוי פני השטח אנטיגן 9,22, נושא חיוני לניתוח איכותי וכמותית נוסף של תת-האוכלוסיות של תאים דלקתיים. בנוסף להכנת ההשעיה התא של עניין, הסרת המיאלין מדגימות המוח הוא צעד מומלץ מאוד להימנע מהפרעה לdownstיישומים לקדד, כגון הפרדת תאי immunomagnetic או cytometry זרימת 23,24. זה יכול להיות מושלם תוך שימוש בשיטות שונות, כגון סוכרוז או הדרגתיים Percoll, או חרוזים נגד המיאלין. כאן, ועל סמך מחקרים קודמים שהשוו שיטות שונות לבידוד השעיה תא המוח, הפרעה מכאנית בשילוב עם שימוש Percoll להסיר המיאלין משמש לשיפור תשואות תא ואת כדאיות 25.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד הכלכלה והתחרותיות הספרדי CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) ו-RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), ומהשלטון המקומי של מדריד S2010/BMD-2336 (MAM) ו-S2010/BMD-2349 (IL). IB ו-MIC הם עמיתים במשרד הכלכלה והתחרותיות הספרדי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פוטוני LED F1WPI571329-8
בקר טמפרטורת ציוד פאנלאב HB 101/2ציוד
Volvere GXNSKNe22Lציוד
מיקרוסקופWPIPZMIII-BSציוד
נירוסטה קוציםFST19007-14חומר כירורגי
מלקחיים דומונט #5/45 FST11251-35חומר כירורגי
מלקחיים Dumont #5SFFST11252-30חומר כירורגי
תפר 6/0LorcaMarin55108חומר כירורגי
תפר 9/0LorcaMarin61966חומר כירורגי
Nikon Eclipse NikonTE300ציוד
IsofluraneEsteve571329-8כימי
נתרן פנטוברביטלVetoquinol570681הקפאה כימית
מיקרוטוםLeica Microsystems GmbHציוד
SM2000R שקופיות Superfrost ThermoScientific 2014-07חומר מעבדה
קרזיל סגול אצטטסיגמאC5042מיקרוסקופ כימי
 ניקוןניקון Eclipse TE300ציוד
XYZ מחשב ממונע שלב ובקרLudl אלקטרוניקה מוצריםציוד
מערכת חוקר סטריאוMicrobrightfieldגרסה 7.003 תוכנה
תוכנה 5 מ"ל מטחנת רקמות, Potter-Elv עם עלי טפלוןתומאס סיינטיפיק0913X70חומר מעבדה
פוליפרופילן 50 מ"ל Oak Ridge צינור צנטריפוגהNalgene3119-0050 חומר מעבדה
PercollSigmap1644-100כימי
RPMI 1640LonzaBE12-702Fכימי
בקמן אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר ציודבקמן קולטר
רוטור אולטרה-צנטריפוגה 45 Tiבקמן קולטרציוד
BD מסננת תאים סטרילית, 40 מיקרוןBDBD 352340חומר
מעבדהסרום בקר אלבומיןסיגמאA3733-500GReagment
FcR חוסם ריאגנט, עכברMiltenyi130-092-575נוגדן
CD11b-FITC, אדם ועכברMiltenyi130-098-085נוגדן
CD45-PE, עכברMiltenyi130-102-596נוגדן
Anti-Ly-6G-APC, עכברMiltenyi130-102-936נוגדן
PerCP/Cy5.5 נגד עכבר Ly-6CBiolegend128012נוגדן
BD FACS FlowBD342003Reagment
BD FACSCalibur;ציוד342975 BD
BD Cell Quest Pro SoftwareBDSoftware
FlowJo softwareTreestar inc.תוכנה
4 צבעים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chamorro, A., et al. The immunology of acute stroke. Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).
  2. Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat Med. 17, 796-808 (2011).
  3. Ramlackhansingh, A. F., et al. Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury. Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).
  4. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
  5. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).
  6. Charleston, J. S. Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator. Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).
  7. Begega, A., et al. Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans. Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).
  8. Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a. Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).
  9. Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain. Stroke. 33, 586-592 (2002).
  10. Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22, 72-85 (1998).
  11. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174(2011).
  12. Denker, S. P., et al. Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke. Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).
  13. Ballesteros, I., et al. Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways. Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).
  14. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. J Microsc. 150, 117-136 (1988).
  15. Hernández-Jiménez, M., et al. Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage. Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).
  16. Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96, 857-881 (1988).
  17. Godino, M. E. C., et al. Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis. J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).
  18. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).
  19. García-Yébenes, I., et al. Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion. Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).
  20. Sobrado, M., et al. Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke. J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).
  21. Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARγ Agonist Rosiglitazone. Stroke. 44, 3498-3508 (2013).
  22. Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).
  25. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Optical FractionatorMCA

מאמרים קשורים