מתואר הפרוטוקול לייצור ותפעול של התקני הרטבת שדה (Field-DW), כמו גם המחקרים הראשוניים של השפעות השדות החשמליים על תכולת הטיפות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניצול של אינטראקציה אגל-פני השטח מופחת למטב תחבורה של Bioanalytes במיקרופלואידיקה הדיגיטלי
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרופלואידיקה דיגיטלית (DMF), טכניקה למניפולציה של טיפות, היא אלטרנטיבה מבטיחה לפיתוח פלטפורמות "מעבדה על שבב". לעתים קרובות, תנועת טיפות מסתמכת על הרטבת משטח, הקשורה ישירות ליישום שדה חשמלי; אינטראקציות פני השטח, לעומת זאת, הופכות את התנועה לתלויה בתוכן הטיפות, ומגבילות את רוחב היישומים של הטכניקה.
הוצגו כמה חלופות כדי למזער את התלות הזו. עם זאת, הם מסתמכים על תוספת של מינים כימיים נוספים לטיפה או לסביבתה, שעלולים לקיים אינטראקציה עם חלקיקי טיפות. כדי להתמודד עם אתגר זה, הקבוצה שלנו פיתחה לאחרונה מכשירי Field-DW המאפשרים הובלה של תאים וחלבונים ב-DMF, ללא תוספים נוספים.
כאן, מסופק הפרוטוקול לייצור ותפעול המכשיר, כולל הממשק האלקטרוני לבקרת תנועה. אנו גם ממשיכים את המחקרים עם המכשירים, ומראים כי אורגניזמים רב-תאיים, גדולים יחסית, יכולים גם הם להיות מועברים, ללא השפעה מהשדות החשמליים הנדרשים להפעלת המכשיר.
מבוא
המזעור של מכשירים שעובדים עם נוזלים הוא בעלת חשיבות עליונה לפיתוח של פלטפורמות "מעבדה-על-שבב". בכיוון זה, בשני העשורים האחרונים היינו עדים להתקדמות משמעותית בתחום מיקרופלואידיקה, עם מגוון רחב של יישומים. 1-5 בניגוד גמור להובלת נוזלים בערוצים סגורים (מיקרופלואידיקה ערוץ), DMF מתפעל טיפות על מערכים של אלקטרודות. אחת הסגולות הכי האטרקטיביים של טכניקה זו הוא היעדר חלקים נעים להובלת נוזלים, והתנועה היא עצרה באופן מיידי על-ידי כיבוי אותות חשמליים.
עם זאת, תנועת טיפה תלויה בתוכן אגל, בהחלט אופיינית רצויה לפלטפורמה אוניברסלית "מעבדה-על-שבב". טיפות המכילות חלבונים וanalytes אחרות נדבקות למשטחי מכשיר, הופכות אינם ניתן להעברה. ניתן לטעון, זה היה המגבלה העיקרית להרחבת היקף יישומי DMF; 6-8חלופות כדי למזער את עכירות המשטח רצויה כרוכות בתוספת של מינים כימיים נוספים לטיפה או בסביבותיה, אשר עלול להשפיע על תוכן אגל.
בעבר, הקבוצה שלנו פיתחה מכשיר כדי לאפשר ההובלה של תאים וחלבונים בDMF, ללא תוספים מיותרים (מכשירי שדה-DW). 9 זו הושגה על ידי שילוב של פני השטח המבוסס על פיח נר, 10 עם גיאומטריה מכשיר שתומכת בגלגול אגל ומוביל לכוח כלפי מעלה על אגל, ירידת אינטראקציה אגל-פני השטח נוסף. בגישה זו, תנועת אגל אינה קשורה להרטבת משטח. 11
מטרת השיטה מפורטת המתוארת להלן היא לייצר מכשיר DMF מסוגל להעביר טיפות המכילות חלבונים, תאים, וכל יצורים, ללא תוספים נוספים. מכשירי שדה-DW לסלול את הדרך לפלטפורמות שליטה מלאה עבודה במידה רבה באופן עצמאי של כימאי אגלר"י.
הנה, אנחנו גם סימולציות הנוכחיות מראים כי, למרות המתח הגבוה הנדרש להפעלת מכשיר, ירידת המתח על פני רביב היא חלק קטן מהמתח להחיל, המצביעה על השפעות זניחות על bioanalytes בתוך הטיפה. למעשה, בדיקות ראשוניות עם elegans Caenorhabditis (סי אלגנס), נמטודות המשמשת למגוון רחב של מחקרים בתחום ביולוגיה, מראות כי תולעים לשחות ללא הפרעה כמתח מוחלים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: בהליכים המתוארים להלן, חייבות תמיד להיות אחרי הנחיות בטיחות במעבדה. חשיבות מיוחדת היא הבטיחות בעת התמודדות עם מתח גבוה (> 500 V) וכימיקלים לטיפול.
1. ציפוי של מצע מוליך עם נר פיח
- Cut מתכת נחושת למלבנים (75 x 43 מ"מ, 0.5 מ"מ עובי). נקה כל מצע נחושת על ידי טבילה בetchant נחושת לכ -30 שניות, לשטוף במים ברז למשך כ -20 שניות, ויבש עם נייר.
הערה: אם אתם משתמשים בשיטה 1 להלן, לשנות את הממדים 75 x 25 מ"מ כדי שיתאים למכונה. - לטאטא נר פרפין מואר תחת המצע נחושת עבור 30-45 שניות, כדי להשיג ציפוי פיח אחיד כ (כ -40 מיקרומטר עבה). שמור את המצע בסנטימטר ~ 1 בתוך הלהבה. אל תיגע במשטח הפיח השביר.
2. הגנה על שכבת הפיח עם ציפוי
הערה: שכבת הפיח היא מאוד שבירה, ויש לצפות להגנה. שתי חלופות פשוטות (שיטות 1 ו -2 להלן) הציעו כאן, אבל פרוטוקולים חזקים יותר נמצאים כעת בפיתוח.
- שיטת 1
- טען את המדגם לתוך מאייד המתכת או מערכת המקרטעת. בעקבות הליכי פעולתה של המערכת, לפנות את החדר, ולהתחיל בתצהיר מבוקר של זהב על גבי שכבת הפיח (150-200 ננומטר). בואו המכשיר להתקרר לטמפרטורת חדר.
- טבילת מעיל מצע metalized בפתרון 1-dodecanethiol (1% V / V, ב -95% אתנול, ACS כיתה USP /), במשך 10 דקות בתוך ברדס כימי. ואז, מחזיק את המכשיר בזווית קרובה ל -60 מעלות, לשטוף בעדינות את פני השטח עם כמה טיפות של אתנול בלבד. בואו המכשירים יבשים, לילה.
- שיטה 2
- במנדף כימי, מייד לאחר ציפוי המצע עם פיח ואילו המצע הוא עדיין חם מלהבת הנר, להפקיד כמה טיפות של נוזל פלואור בצד אחד שלמצע, ולהטות את המצע לזווית קרובה ל 90 מעלות. להפקיד יותר טיפות, ולתת להם להתגלגל על פני כל משטח הפיח.
הערה: כאשר הטיפה נופלת על מקום, פיח יישטף מאזור זה. בואו הטיפות של התפשטות נוזל פלואור ככל האפשר. - אופים את המצע על צלחת חמה (160 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות) בתוך מנדף כימי.
- בואו המצע לשבת לילה בטמפרטורת חדר לפני השימוש. אחסן ללא הגבלת זמן.
- במנדף כימי, מייד לאחר ציפוי המצע עם פיח ואילו המצע הוא עדיין חם מלהבת הנר, להפקיד כמה טיפות של נוזל פלואור בצד אחד שלמצע, ולהטות את המצע לזווית קרובה ל 90 מעלות. להפקיד יותר טיפות, ולתת להם להתגלגל על פני כל משטח הפיח.
3. ייצור של למעלה אלקטרודות (מעובד מתוך et al Abdelgawad. 12)
- צייר את האלקטרודות באמצעות תוכנת עיצוב גרפית. כל אלקטרודה היא 2 מ"מ, רוחבו 0.3 מ"מ, ואת הפער בין האלקטרודות הוא 0.3 מ"מ. הפער בין אנשי קשר (לייכנס לתוך המחבר, ראה להלן) הוא 2.3 מ"מ (איור 1).
- חתוך רבד נחושת גמיש (35 מיקרומטר העבה) לפורמט Monarch (3.87 x 7.5 אינץ '). השתמשו בגדלים אחרים iו תואם למדפסת. טענת את רבד במגש ההזנה הידני של מדפסת צבע.
- הקפד להשתמש ב" שחור עשיר ", או" רישום שחור ", בעת הדפסה על הגיליון נחושת (ראה Abdelgawad et al. 12 לפרטים נוספים) כדי לאפשר שכבה צפופה של דיו שחור על המצע נחושת, הגנה על הדפוס שנדפס בתחריט . בואו יבש מצע המודפס לגמרי, לילה.
- בתוך ברדס כימי, להתחמם (40 מעלות צלזיוס) כוס עם 50 מיליליטר של etchant נחושת. טובלים את רבד המודפס בכוס, ובעדינות לנער אותו בפתרון לכ -10 דקות. זמן תחריט תלוי בפתרון etchant הנחושת. בכל כמה דקות, לבדוק קורוזיה ולראות אם התבנית היא ללא פגע.
- לשטוף בזהירות את רבד במים, ולהסיר את הציפוי עם אצטון ואתנול במנדף כימי. לשטוף שוב, ובעדינות לייבש את רבד עם מגבת נייר.
- לצרף בזהירות רבד עם אלקטרודות לשטח בנוישקופית ss (75 x 25 מ"מ, ~ 1 מ"מ עובי), באמצעות קלטת דו צדדית. הימנע מכיסי אוויר.
- צרף סרט של PFA perfluoroalkoxy לאלקטרודות באמצעות קלטת. זה משמש כדי למנוע מגע מקרי של אלקטרודות עם הטיפה, נזקי אלקטרודות העליונים עקב קצר חשמלי ש.
4. אלקטרוני הממשק (המעגל באיור 2)
- הלחמה הממסרים וC הקבלים למעגל אוניברסלי.
- להרכיב את שאר 10 נהגי ממסר על קרש חיתוך solderless למעגלים אלקטרוניים.
- חוט הקלט של כל נהג ממסר לערוץ בשלט.
- הצמד בזהירות את האלקטרודות העליונה למחבר (איור 3). חוט הפלט של כל נהג ממסר לאלקטרודה עליונה, כפי שמוצג באיור. שים לב שיש קשר מחבר מעוגן בין זוג חוטים מממסרים, כדי למזער את הרעש חשמלי.
הערה: המחבר יושב על פלטפורמה מתכווננת לשלוט tהוא מרחק (0.1-.5 מ"מ) בין מצע העליון ותחתון (פיח מצופה). - השתמש בתכנית לשליטה עיתוי למתח גבוה יישום (HV) (כ -0.8 שניות) 4 אלקטרודות באותו הזמן, הסטת אלקטרודה 1 בכיוון התנועה (כלומר, 0.8 שניות, להניע 1234; אז 2345, 3456, וכו ' ., 0.8 שניות לכל קבוצה, ולאחר מכן לאחור, מהלכים כל כך טיפה בכיוון ההפוך גם כן).
5. ויזואליזציה וטיפול אגל
- כדי להקליט תנועת אגל, להשתמש במערכת להדמיה, שמורכבת מ24X - ההרכבה הגדלת 96X בשילוב עם מצלמת CCD. חבר את מצלמת וידאו למצלמה באמצעות S-video.
- פיפטה טיפת 4 μl המכילה ג elegans בתקשורת על החלק התחתון של המצע מצופה הפיח.
- להביא את האלקטרודות העליונה ל~ 0.3 מ"מ מעל הטיפה. הטיפה צריכה להיות קרובה לאמצע, ממש מתחת לאלקטרודה החמישית, לניתוח קל.
- הפעל את הממשק האלקטרוני ומתח גבוה (500 V RMS), ולהתאים את מרחק אלקטרודה העליון לטיפה עד שהוא מתחיל לזוז. אל תתנו לאלקטרודות העליונים לגעת בטיפה.
- איסוף נתונים על ידי הקלטת מספר העברות אגל מוצלחות במכשיר בתגובה לפולסים חשמליים. ניסוי מוצלח מאופיין בלפחות 700 העברות טיפה, כלומר, העברה אחת לאחר כל פעימה חשמלית.
- לאסוף נתונים באופן רציף, עד הטיפה לא לזוז יותר בתגובה ל5 עד 10 פעימות.
הערה: כאשר פני השטח מתחיל להשפיל, תנועה יכולה להיות משוחזרת על ידי הבאת אלקטרודות העליונה קרובה יותר לטיפה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעבר, השתמשנו במכשירי שדה-DW כדי לאפשר התנועה של חלבונים בDMF. בפרט, טיפות עם אלבומין בסרום שור (BSA) ניתן היו להעביר בריכוז 2,000 פעמים גבוה יותר מאשר דווח בעבר על ידי מחברים אחרים (ללא תוספים). זה היה בשל האינטראקציה המופחתת בין אגל ופני שטח; איור 4 מראה טיפה מכילה BSA fluorescently- מתויג (ראה פריירה ואח '9 למידע נוסף על הניסויים.). התמונה הראשונה מהשמאל מראה את הטיפה יושבת על פני השטח מצופה פיח; אחד באמצע, את ההשפעה של שדה חשמלי, א...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא ההגנה על שכבת הפיח, ישירות הקשורות להצלחה בהעברת טיפות. Metallizing שכבת הפיח (שיטת 1 לעיל) מאפשר קרוב להצלחת ייצור 100%. עם זאת, זמן פעולה המרבי היא כ -10 דקות; אולי, שברי טיפה הם מרטיבים את הפיח דרך חורים בשכבת המתכת. ציפוי שכבת הפיח עם נוזל פלואור הוא החלופה הקלה והמהירה ביותר, ודורש משאבים מינימליים, אלא רק 40-50% מ( מקסימום 20 דקות) עבודת מצעים המפוברקת - והציפוי אינו אחיד. למעשה, שכבת הפיח היא מאוד שבירה, ואת נוזל בקלות נזקי פלואור צמיג זה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים לקרן Lindback לתמיכה כספית, וד"ר אלכסנדר Sidorenko ואלזה צ 'לדיונים פוריים וסיוע טכני, והפרופסור רוברט סמית' לקבלת סיוע בג מבחני elegans.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פרפין | כל נר פרפין | ||
| מערכת מקרטעת | Denton Vacuum, Moorestown, NJ | Sputter coater Desk V HP מצויד ביעד Au. | |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364 | |
| טפלון | Dupont | AF-1600 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma-Aldrich | F9755 | נוזל פלואור: הכן שרף טפלון-AF בפלואורינרט FC-40, 1:100 (w/w), ליצירת הציפוי ההידרופובי. |
| תוכנת עיצוב גרפי -Adobe Illustrator | Adobe Systems | ניתן להשתמש גם בתוכנות אחרות. | |
| למינציה נחושת | Dupont | LF9110 | |
| Xerox | Phaser 6360 או דומה | בדוק את התאימות ל"שחור עשיר" או "שחור רישום" (ראה טקסט). | |
| תחריט נחושת | טרנסן | CE-100 | |
| Perfluoroalkoxy (PFA) סרט | McMaster-Carr | 84955K22 | |
| Breadboard | Allied Electronics | 70012450 או דומה | גדול מספיק כדי לאפשר הרכבה של 10 דרייברים. |
| לוח מעגלים אוניברסלי | Allied Electronics | 70219535 או מחבר דומה | |
| Allied Electronics | 5145154-8 או לוח בקרה ותוכנית בקרה דומה | ||
| (תוכנת LabView) | National Instruments | NI-6229 או מגבר מתח גבוה דומה | |
| Trek | PZD700 | ||
| קבלים C ו-C1, 100 nF, 60 V | Allied | ||
| טרנזיסטור T, NPN | בעלי ברית | ||
| דיודה D, 1N4007 | בעלות הברית | ||
| 2660007 שליחים | בעלי ברית | ||
| 8862527 מערכת הדמיה | Edmund Optics | VZM 200i או דומה | הגדלת מערכת 24X & #8211; 96X. הוא משולב עם היטאצ'י KP-D20B 1/2 במצלמה צבעונית CCD. |
| מקליט | Sony | GV-D1000 NTSC או דומה | הוא מחובר למצלמה באמצעות כבל S-video. |
| סימולציות | COMSOL Multiphysics | V. 4.4 |
מקורות
- Fair, R. B. Digital microfluidics: is a true lab-on-a-chip possible. Microfluid Nanofluid. 3 (3), 245-281 (2007).
- Gupta, S., Alargova, R. G., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. On-Chip Dielectrophoretic Coassembly of Live Cells and Particles into Responsive Biomaterials. Langmuir. 26 (5), 3441-3452 (2009).
- Shih, S. C., et al. Dried blood spot analysis by digital microfluidics coupled to nanoelectrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 84 (8), 3731-3738 (2012).
- Gorbatsova, J., Borissova, M., Kaljurand, M. Electrowetting-on-dielectric actuation of droplets with capillary electrophoretic zones for off-line mass spectrometric analysis. J Chromatogr. 1234 (0), 9-15 (2012).
- Qin, J., Wheeler, A. R. Maze exploration and learning in C. elegans. Lab Chip. 7 (2), 186-192 (2007).
- Koc, Y., de Mello, A. J., McHale, G., Newton, M. I., Roach, P., Shirtcliffe, N. J. Nano-scale superhydrophobicity: suppression of protein adsorption and promotion of flow-induced detachment. Lab Chip. 8 (4), 582-586 (2008).
- Perry, G., Thomy, V., Das, M. R., Coffinier, Y., Boukherroub, R. Inhibiting protein biofouling using graphene oxide in droplet-based microfluidic microsystems. Lab Chip. 12 (9), 1601-1604 (2012).
- Kumari, N., Garimella, S. V. Electrowetting-Induced Dewetting Transitions on Superhydrophobic Surfaces. Langmuir. 27 (17), 10342-10346 (2011).
- Freire, S. L. S., Tanner, B. Additive-Free Digital Microfluidics. Langmuir. 29 (28), 9024-9030 (2013).
- Deng, X., Mammen, L., Butt, H. -J., Vollmer, D. Candle Soot as a Template for a Transparent Robust Superamphiphobic Coating. Science. 335, 67-70 (2011).
- Kang, K. H. How Electrostatic Fields Change Contact Angle in Electrowetting. Langmuir. 18 (26), 10318-10322 (2002).
- Abdelgawad, M., Watson, M. W. L., Young, E. W. K., Mudrik, J. M., Ungrin, M. D., Wheeler, A. R. Soft lithography: masters on demand. Lab Chip. 8 (8), 1379-1385 (2008).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8 (4), 519-526 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
