המטרה של מצגת זו היא להוכיח in vivo ובטכניקות מבחנה לגידול של נמטודות entomopathogenic. בvivo שיטות לשקול הגידול של נמטודות אלה עם מארח חרק, ואילו השיטות במבחנה לנצל מדיה אגר עשירה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
In vivo ו במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae וHeterorhabditidae)
במאמר זה
סיכום
תקציר
נמטודות Entomopathogenic (EPN) (Steinernematidae וHeterorhabditidae) יש שותפות mutualistic עם Gamma-Proteobacteria גראם שלילי במשפחת חיידקי Enterobacteriaceae. Xenorhabdus קשורים לנמטודות steinernematids בעוד Photorhabdus היא סימביוזה של heterorhabditids. יחד נמטודות וחיידקים יוצרים מורכבת קוטלי חרקים חזקים שהורג מגוון רחב של מיני חרקים בשותפות אינטימית וספציפית. במסמך זה, אנו מדגימים in vivo ובטכניקות מבחנה בשימוש נפוץ בגידול של נמטודות אלה בתנאי מעבדה. יתר על כן, טכניקות אלה מייצגים שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של תרבויות EPN וגם יוצרות את הבסיס לbioassays האחר שעושים שימוש באורגניזמים אלה למחקר. הייצור של נמטודות aposymbiotic (ללא הסימביונט) הוא לעתים קרובות קריטי לעומק ובגישה רבת פנים למחקר של סימביוזה. זהפרוטוקול אינו דורש תוספת של אנטיביוטיקה וניתן להשיג בפרק זמן קצר עם ציוד מעבדה סטנדרטי. נמטודות מיוצרות באופן זה הן חזקות יחסית, אם כי השארות שלהם באחסון עשויות להשתנות בהתאם למין משמש. הטכניקות מפורטות במצגת זו מתאימות לאלה המתוארים על ידי מחברים שונים ומעודנים על ידי המעבדה של פ המלאי, אוניברסיטת אריזונה (טוסון, אריזונה, ארה"ב). טכניקות אלו נבדלות מהגוף של טכניקות המשמשים בייצור ההמוני של יצורים אלה למטרות טיפול במזיקים.
מבוא
נמטודות Entomopathogenic (EPN) Steinernema וspp Heterorhabditis. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) והסימביוזה עם החיידקים שלהם, Xenorhabdus וspp Photorhabdus (Enterobacteriaceae) נחשבים מודל מתהווה של יחסים סימביוטיים בעלי חי חיידק יבשתי 2-4,6,10,19. Xenorhabdus וspp Photorhabdus. הם טיפחו כבסימביוזה במעיו של שלב חיים נטולי רק של נמטודות, הידוע גם בנוער המזהם (IJ) או שלב 3 rd מזהם נוער 8,10,13. זוג החיידק-נמטודות הוא פתוגניים למגוון רחב של חרקים והצלחה יושם בהדברה ביולוגית ותוכניות טיפול משולבים במזיקים בעולם 6,8.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
.1 בvivo גידול של Entomopathogenic נמטודות עם החיידקים Symboitic
- הפוך צלחת פטרי פלסטיק 100 x 15 מ"מ ומניח את שני דיסקים של נייר סינון (90 מ"מ) במכסה של הצלחת.
- לפזר באופן שווה 1 מ"ל של ההשעיה IJ (קטינים מזהמים) מים (בריכוז של 1,000-2,000 IJ / מ"ל) על נייר הסינון.
הערה: IJS לא צריך להיות מעוקר לפני שטח. - הוסף 10 זחלי instar האחרונים של mellonella Galleria waxmoth הגדול יותר לצלחת. המטרה היא לספק כ 100-200 IJS / זחל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיטת גידול in vivo משתמשת חרקים חיים כמארחים לצמיחת נמטודות ורבייה. תאי דלקת הם שיטה יעילה לחשיפת IJS חרקים. זהו השלב היחיד במעגל החיים 'נמטודות שוקטורים בסימביוזת החיידקים ממארח חרק אחד למשנהו. איור 1 מציג את להגדיר עבור תא זיהום, כמו גם את החומרים הדרושים לבניית תא זה. במבחנה שיטות גידול לאפשר EPN לגדול בלי מארח חרק, אלא גם מיושמים לגידול של נמטודות aposymbiotic (ללא הסימביונט). איור 2 מראה צלחת אגר שומנים עם שלבי נמטודות שונ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שימוש מארח מתאים הוא גורם מפתח להצלחה בגידול vivo של EPN. בדרך כלל, שתי steinernematids וheterorhabditids יכולים להתרבות ולהשלים בהצלחה מחזור החיים שלהם בזחלים של עש הדונג הגדול יותר, mellonella Galleria (פרפרים: Pyralidae). עם זאת, מיני חרקים אחרים ממשפחות ו / או צווים שונים יכולים להיחשב. כמה ממיני נמטודות תיארו כיום ידועים יש ספציפי למארח חרקים מסוים. לדוגמא, ס ' kushidai וס scarabaei אינו מאוד ארסי לזחלי lepidopteran, וצריך זחלים קשים כנפיים כגון.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריזו.
תודות
המחברים מבקשים להודות לחברי העבר של המעבדה המלאי: מינג-Min לי, קתרין Plichta, ויקטוריה מירנדה-תומפסון וסם-קיו קים על תרומתם לשיפור של רבים מהפרוטוקולים הללו. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענק הקרן הלאומית למדע IOS-0840932 וIOS-0724978 לצילומי SP
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עבור In vivo זיהומים | |||
| 100 x 15 צלחות פטרי | VWR | 25384-088 | |
| נייר סינון, 9 ס"מ דרגה 1 תאית | Whatman/VWR | 28450-081 | נייר סינון דרגה 1 מומלץ |
| מארחי חרקים | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella הם מומלץ |
| עבור אגר כבד-כליה (עבור 500 מ"ל) | |||
| 60 x 15 מ"מ צלחות פטרי | VWR | 25384-092 | |
| כבד בקר, 50 גרם | מתוצרת מקומית; אטליז או סופרמרקט | ניתן לאחסן את הנותרים קפואים ולהפשיר לשימוש עתידי | |
| כליות בקר, 50 גרם | מתוצרת מקומית; אטליז או סופרמרקט | ניתן לאחסן את הנותרים קפואים ולהפשיר לשימוש | |
| עתידינתרן כלורי 2.5 גרם (0.5% ריכוז סופי) | Acros/VWR | 200002-434 | ניתן להשתמש בכל NaCl בדרגת מחקר |
| אגר, 7.5 גרם (1.5% אגר, ריכוז סופי) | HiMedia/VWR | 95026-642 | ניתן להשתמש בכל אגר בדרגת מדיה |
| 500 מ"ל מזוקק H2O | |||
| לאגר ליפיד (עבור 1 ליטר) | |||
| 100 x 15 צלחות פטרי | VWR | 25384-088 | |
| מרק תזונתי, 8 גרם | BD/VWR | 90002-660 | |
| תמצית שמרים, 5 גרם | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| מגנזיום כלוריד הקסהידרט 10 מ"ל (0.2 גרם/מ"ל) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| שמן תירס, 4 מ"ל | כל מותג | ממקור מקומי; סופרמרקט | ניתן להשתמש |
| בכל מותג של שמן תירססירופ תירס, 96 מ"ל מערבבים 7 מ"ל סירופ תירס ב-89 מ"ל H2O מחומם ומערבולת להומוגניות | Karo | ממקור מקומי; סופרמרקט | |
| אגר, 15 גרם | HiMedia/VWR | 95026-642 | ניתן להשתמש בכל אגר בדרגת מדיה |
| מזוקק H2O, 890 מ"ל |
מקורות
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
