צפייה וגישה לעובר התרנגולת במהלך ההתפתחות יכולה להיות מאתגרת. פיתחנו שיטת ex ovo שהיא פשוטה, חסכונית וניתן להשתמש בה בקלות בכיתה או במסגרת מחקר. שיטה זו מספקת גישה לעובר בשלבים מאוחרים של התפתחות עוברית (HH 40).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מותאם באופן מיטבי Ex-אובו Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקר באנטומיה, אמבריולוגיה וביולוגיה התפתחותית הסתמך במידה רבה על שימוש באורגניזמים מודלים. על מנת לחקור התפתחות בעוברים חיים משתמשים לעתים קרובות באורגניזמים מודלים, כמו התרנגולת. התרנגולת היא אורגניזם מודל מצוין בשל עלותה הנמוכה ותחזוקה מינימלית, אולם הם מציבים אתגרי תצפית מכיוון שהם סגורים בקליפת ביצה אטומה. על מנת לראות כראוי את העובר תוך כדי התפתחותו, יש לחלון או להסיר את הקליפה. הן טכניקות החלונות והן טכניקות ex ovo פותחו כדי לסייע לחוקרים בחקר ההתפתחות העוברית. עם זאת, לכל אחת מהשיטות יש מגבלות ואתגרים. כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה ואופטימלית של תרבית ביצית לעוברי תרנגולות המאפשרת התבוננות בהתפתחות עוברית משלב HH 19 ועד לשלבי התפתחות מאוחרים (HH 40), כאשר איברים רבים התפתחו. קל לאמץ טכניקה זו הן בכיתות לתואר ראשון והן במעבדות מחקר מתקדמות יותר בהן מתבצעות מניפולציות עוברים.
מבוא
תרבית אקס אובו מילאה תפקיד חשוב בחקר התפתחות התרנגולת1, 2. שיטת תרבות זו שימשה לחקר מחלות נוירולוגיות, התפתחות גפיים, התפתחות גולגולת, וכמודל לחקירת מומים הקשורים לסוכרת 3, 4, 5.
ישנן וריאציות רבות לטכניקת ex ovo. הגישה הנפוצה ביותר היא להשתמש בכוס קלקר6,7,8 או בקערת זכוכית5. בשיטות אלה, הכוס או הקערה מרופדת בניילון נצמד כדי לערסל את העובר, מניחים מכסה על הכוס, ולאחר מכן מניחים את העובר באינקובטור עם לחות מתאימה6. עם זאת, הגדרה זו יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית. האתגר הראשון הוא הניילון הנצמד המשמש לעריסת העובר. עטיפה זו קשה לעבודה ולעתים קרובות אינה נדבקת לגביעונית היטב. כדי לפתור בעיה זו, מניחים רצועה אלסטית סביב הכוס כדי להחזיק את העטיפה במקומה. למרות זאת, העטיפה עדיין יכולה להחליק, וזה קטלני לעובר. לעטיפת הפלסטיק יש פוטנציאל להיקרע או לנקב על ידי מלקחיים או מחטים שעשויים לשמש במהלך מניפולציות ותצפיות עוברים. לבסוף, מערך זה אינו יציב במיוחד והתלמידים יכולים בקלות להפיל את הכוסות. גובה הכוסות גם מקשה מאוד על הצבת העובר תחת סטריאומיקרוסקופ, שמטרתו מוגבלת לגובה הבמה. אתגרים אלה מקשים על סטודנטים לתואר ראשון לעבוד עם עוברי אפרוחים חיים במעבדות הוראה, כגון קורסים מתקדמים בביולוגיה התפתחותית.
האתגרים הנ"ל בשיטת ex ovo גרמו לכך שהחוקרים פונים לשיטת החלונות 9,10 כדי לראות את התפתחות הגוזלים העובריים. בטכניקה זו נוצר חור או "חלון" בקליפת הביצה המכסה את העובר. ניתן לאטום מחדש את החור עם סרט או שעווה9 כדי לאפשר התפתחות עוברית נוספת. למרות שלשיטת החלונות יש כמה יתרונות, כמו היכולת לראות התפתחות עוברית ותחזוקה קלה, לשיטה זו יש גם מספר מגבלות. הראשון הוא שהחלון צריך להיות גדול למדי על מנת לראות את העובר כולו (במיוחד בשלבים מאוחרים). שנית, קשה לאטום חלונות גדולים; איטום לא תקין יוביל לבעיות סטריליות ושרידות. שימוש בשעווה מותכת כחומר איטום מוסיף עוד שלב לא נוח ומבולגן לפרוטוקול. לכן, למרות ששיטת החלונות עשויה להיות אידיאלית עבור עוברי אפרוחים בשלבים צעירים (HH 11 - HH 27), צפייה בעובר כולו בשלבים מאוחרים אינה מושגת בקלות.
כאן, אנו מתארים טכניקה משופרת ופשוטה של תרבית ביצית 11 המונעת את הצורך בציוד טכנולוגי מתקדם, קלה לטיפול תחת סטריאומיקרוסקופ, מעניקה לעובר מספיק תמיכה לביצוע מניפולציות מיקרוסקופיות, ומאפשרת לחוקרים לראות את גדילת העובר בשלמותו היטב בשלבי ההתפתחות המאוחרים יותר (עד HH 40-41). עם ההתקדמות הללו בטכניקת ex ovo, אנשים מקבלים גישה להבנה מלאה יותר של התפתחות עוברית. לדוגמה, צמיחה לשלבים מאוחרים יותר מאפשרת לאנשים להתבונן בתהליכים התפתחותיים שאינם מתרחשים עד לנקודת זמן זו, כגון התעצמות, התפתחות נוצות והתפתחות מתקדמת של הגפיים והעיניים. כל העובר והממברנות החוץ-עובריות וכלי הדם נראים בבירור. ניתן לבצע גם מחקרים מתקדמים יותר, כגון מניפולציות עובריות (כלומר, השתלת חרוזים ספוגים במעכבים או החדרת מחסומים בין שכבות הרקמה), ואז החוקרים יכולים לצפות בהשפעת המניפולציות בעוברים בשלב מאוחר יותר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל הציוד מפורטים בטבלה 1.
1. אחסון עוברי העופות
- דגירה ביצי תרנגולת של זן גאלוס גאלוס אופקי על 37 מעלות צלסיוס ולחות כ -40% ולהפוך ביצי פעם או פעמיים ביום. הפיכת ביצים היא חשובה כדי למנוע את העובר מהקפדה על קליפת הביצה.
- לא להפוך את הביצה בשעה 24 לפני הקמת התרבות אחרת העובר יהיה ממוקם הגחון למסת החלמון ויהיה פגום על פתיחת הביצה בשלב 3. בנוסף, לשמור על הביצים ב 4 o C מעלות ללא יותר משבוע אחד לפני הדגירה לפיתוח "עצירה" אבל זה לא אידיאלי.
2. Staging עוברי עופות
- לביים את עוברי העוף באמצעות המבורגר ושולחן בימוי המילטון 12. השלב האידיאלי להקמת culturing לשעבר אובו הוא HH שלב 19-20 (כ 3 ימים של דגירה) BECause זה זמן קצר לאחר שהראש מסתובב על 53 hpf.
הערה: שלב HH 19-20 מתאפיין בתכונות המורפולוגיות הבאות: somites מורחבים למרבית הזנב, אך סופו של הזנב נשאר unsegmented, ניצן הזנב מסולסל, allantois הוא קטן וכלי דם מוגבל, הרגל-הניצנים הם גדולים יותר מאשר באגף-ניצנים והעיניים הן חסרות צבע או שיש לו גוון אפרפר.
3. הסרת העובר מShell
- לפני הסרת העובר מהפגז, לרסס את הפגז עם אתנול 70% ולאפשר לו להתייבש. אל תכבה את הביצה במהירות כמו זה יגרום ניזק לעובר.
- נזהר שלא לשנות את הכיוון של הביצה, לפצח בזהירות את הביצה בצד התחתון (כלומר, הצד שהיה הגחון במהלך דגירה) ולשחרר את העובר לסטרילי לשקול סירה (88 x 88 x 23 מ"מ). נגב את לשקול סירות עם אתנול 70%. בדוק את העובר על מנת להבטיח כי שק החלמון אינו פגום. אם h החלמוןכשבור, לבטל את העובר, כפי שהוא לא ישרוד.
- שים לב לעובר, כדי להבטיח שזה בר-קיימא; הלב פועם, כלי דם מופיע נורמלים, ואין חריגות ברורות נוכחים. ודא שהקצוות של הסירה לשקול יבשים.
- בעזרת פיפטה, ירידה של 40 μl של פניצילין / סטרפטומיצין (פניצילין 5,000 יחידות, 5 סטרפטומיצין מ"ג למ"ל) על גבי אלבומין כדי למנוע זיהום.
4. הכנת תא לחות
- הנח ערמה קטנה של kim-מגבונים ו / או כרית סופגת עשויה כותנה בחלק התחתון של מיכל פלסטיק סטרילי (12 x 12 x 6 סנטימטרים) ניגב עם אתנול 70%.
- מוסיף מים סטריליים, מזוקקים כדי ללחלח את kim-המגבונים ו / או כותנה (כ -150 מיליליטר מים).
5. הרכבת Ex אוב התרבות
- הנח את הסירה לשקול מכילה את העובר על גבי הריפוד הלח. לאחר מכן, מחצית מקום של צלחת פטרי רבועה סטרילי (9.5 x 9.5 סנטימטר) על גבי tהוא שוקל סירה כדי ליצור מכסה רופף.
- מכסה את מיכל הפלסטיק עם המכסה שלה. לחץ כלפי מטה שתי פינות של המכסה, להבטיח חותם חלקי שעדיין מאפשר לזרימת אוויר טוב בתוך החדר.
- זהירות במקום ההתקנה לתוך חממת C 37 o עד שלב רצוי.
- הנח מכולות של מים בחממה כדי לעזור לשלוט בלחות, אם חממת לחות מבוקרת אינה זמינה. לעקר את כל המים בתאי לחות ובחממה ולחדש במידת הצורך במהלך תקופת הדגירה. לחות 40% היא אידיאלית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לשעבר זה אוב השיטה מאפשר התצפית של עוברים משלבים המוקדמים של פיתוח (HH 19/20) לשלבים המאוחרים של התפתחות (HH 40-41) (איור 1 א ו -1 B). הגדרת התרבות בHH 19-20 מגדילה שרידות של העוברים בתרבות. לפני ראש הפיכה (לפני 53 hpf) שרידות נמוכות מאוד בתרבות ובאחרי שלב 21, העובר נוטה להיצמד יותר למעטפת בהסרה כל כך עוברים שלמים פחות מתקבלים. באופן כללי, שרידות של העובר באובו לשעבר התרבות היא גבוהות עד HH 35-36 (90-100%), אך היא עושה ט...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Ex אוב culturing וחלונאית לשניהם יש יתרונות ואתגרים. כאן אנו משווים את היתרונות והאתגרים של האקס קלקר כוס אוב השיטה ושיטת חלונאית לשעבר המותאם אוב השיטה שמוצגת כאן. השיטה שלנו מאפשרת מניפולציה והתבוננות קלה של עובר אפרוח בשלבים מאוחרים של התפתחות והחידודים שלנו לשעבר המסורתיים אוב השיטה 1, 2, 3 לעשות את זה גם מאוד קל לשימוש בשיעורי מעבדה הוראה לתואר ראשון.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אי לנו אינטרסים כלכליים מתחרים בכל הקשור למידע המוצג בכתב היד הזה.
תודות
ברצוננו להודות לפול Poirier, מפיק Media, בסיינט וינסנט אוניברסיטת הר לעבודתו בצילום ועריכת וידאו החלק של כתב היד הזה. אנו מכירים במדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה למימון.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פניצילין/סטרפטומיצין | סיגמא | P4458 | הכינו מנות קטנות כדי למנוע אירועי הקפאה/הפשרה |
| פטרי מרובעת | 9.5 ס"מ x 9.5 ס"מ | ||
| שקילה סירה | פישר 8732113 מדעי | 88 x 88 x 23 מ"מ | |
| מיכל זיפלוק | זיפלוק מס' | 12 ס"מ x 12 ס"מ x 6 ס"מ |
מקורות
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522(2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
