לוקליזציה, זיהוי, וכריתה של בסיס מיון Murine שומן

סיכום

בשל קשר דרסטי והשלילי בין השמנת יתר ומחלות רקע אחרים, מחקר על תפקיד השומן משחק במחלה ועל בריאות כללית היא מוצדקת. אנו מציגים פרוטוקול לבידוד והכריתה של מחסני שומן ומאפשרים לחקר השומן באמצעות באתר ובשיטות חוץ גופית.

תקציר

השמנת יתר עלתה באופן דרמטי בעשורים האחרונים ומשפיעה על יותר משליש מהאוכלוסייה הבוגרת בארה"ב. ההשפעה הכלכלית של השמנת יתר בשנת 2005 הגיעה לסכום מדהים של 190.2 מיליארד דולר בעלויות רפואיות ישירות בלבד. השמנת יתר היא גורם סיכון מרכזי לשורה רחבה של מחלות. מבחינה היסטורית, מעט היה ידוע על השומן ותפקידיו העיקריים והחיוניים בגוף. שומן חום ולבן הם שני הסוגים העיקריים של שומן, אך הספרות הנוכחית זיהתה סוג חדש של שומן הנקרא שומן בריט או בז'. מחקרים הראו כי למחסני שומן יש פרופילים מטבוליים ספציפיים ומחסנים מסוימים מאפשרים נטייה להשמנת יתר והפרעות קשורות אחרות. מטרת פרוטוקול זה היא לספק לחוקרים את היכולת לזהות ולכרות מצבורי שומן שיאפשרו ניתוח של השפעות פקטוריאליות שונות על שומן; כמו גם התפקיד המועיל או המזיק של השומן במחלות ובבריאות הכללית. בידוד וכריתת מצבורי שומן מאפשרים לחוקרים להסתכל על שינויים מורפולוגיים גסים כמו גם שינויים היסטולוגיים. השומן המבודד יכול לשמש גם למחקרים מולקולריים להערכת שינוי שעתוק ותרגום או לניסויים במבחנה לגילוי מטרות מעניינות ומנגנוני פעולה. טכניקה זו עדיפה על טכניקות אחרות שפורסמו בשל התכנון המאפשר בידוד של מספר מחסנים בפשטות ובזיהום מינימלי.

מבוא

שומן היה חלש בולטת באור זרקורי התקשורת, כתוצאה מהעלייה הדרמטית של השמנת יתר במהלך העשורים האחרונים של המאה ה -20. השמנה כיום משפיעה על יותר משליש ממבוגרים ו -17% מילדים ובני הנוער בארצות הברית (ארה"ב) ^1. פורש את כל הקבוצות האתניות, מחקר סטטיסטי המקיף את מגיפת ההשמנה הראה שיש לי שחורים שאינו היספנים השיעור מותאם לגיל הגבוה ביותר של השמנת יתר (49.5%) בהשוואה לאמריקאים מקסיקניים (40.4%), כלל ההיספאנים (39.1%), ואי לבנים היספני (34.3%) ^2. ההשפעה הכלכלית של השמנת יתר היא גם דאגה גוברת למערכת הבריאות. בשנת 2012, הוערך כי העלות השנתית של טיפול הרפואית לטיפול בהשמנה בארה"ב בשנת 2005 הייתה $ 190,200,000,000, כמעט 21% מתקציב ההוצאות רפואיות הכללי. למרבה הצער, השמנה בילדות הייתה מוערך להיות אחראי על 14 מליארד דולרים בעלויות רפואיות ישירות לבד. מבחינה סטטיסטית, נקבע כי העלות הממוצעת של רפואיתאנשים עם השמנת יתר היו גבוה יותר 2741 $ בשנה מאשר אלו ללא תחלואה זה ^3-5.

השמנת יתר היא גורם סיכון עיקרי למגוון רחב של מצבים כגון: סוכרת מסוג 2, דיסליפידמיה, מחלות לב וכלי דם, סרטן, הפרעות שלד שרירים ודלקת כרונית. השמנה קשורה עמוק לפתוגנזה של תסמונת מטבולית ומחלות כרוניות אחרות ^6-8. עם קשרי דרסטי ושליליים כגון בין השמנת יתר ומחלות רקע אחרים, מחקר מדעי מיקד את תשומת לב כדי להבין את המגיפה הנוכחית ותפקידים המגוונים ומרכזיים שמילאו שומן טוב יותר.

מבחינה הסטורית, רקמת שומן נחשבה חסרת חשיבות ונתפסה רק כרקמת מילוי פשוטה. נכון לעכשיו, שומן הוכח לשחק הרבה תפקידים חיוניים בתפקוד הגוף ב: חילוף חומרים, ויסות הורמון, דלקת, הגנה ובידוד ^9. רקמת שומן מורכבת בעיקר מadipocytes אלא גם מכיל pericytes, תאי האנדותל, מונוציטים, מקרופאגים ותאי גזע pluripotent ^8. רקמת שומן מופצת בכל הגוף בתחנות שונות. ניתן למצוא המחסנים העיקריים subdermally, תת-עורית, לשריר, ולעומק ^10. מחסני שומן הוכחו לי פרופילי מחסן ספציפיים חילוף חומרים, אשר הראו רגישות ספציפית מחסן להשמנה והפרעות הקשורות ^8.

באופן מסורתי, רקמת שומן כבר מסווגת לשני סוגים עיקריים: רקמת שומן לבנה (WAT) ורקמת שומן חומה (BAT); למרות שהספרות האחרונה מציינת את הנוכחות של קבוצה שלישית הוטבלה שומן brite או בז ^'11. רקמת שומן הוכח לי צבעים שונים, מורפולוגיות, פונקציות מטבוליות, תכונות ביוכימיות ודפוסים גנטיים ביטוי ^10. יש לי adipocytes בWAT, טיפה אחת גדולה של שומנים וכמויות משתנות של המיטוכונדריה. WATנמצא דומיננטי ביישובים תת-עורי והקרביים של הגוף. פונקציות WAT כאתר של אחסון אנרגיה והגנה על איברים בעיקר. יש לי adipocytes בBAT מורפולוגיה multilocular והמיטוכונדריה בשפע. BAT ממוקם בעיקר בצוואר וכלי דם גדולים של בית החזה, כמו גם את השכמות ^12. BAT פונקציות בעיקר בהתנהגויות משקיעה באנרגיה, המסדירות thermogenesis ^7. שומן Brite או בז 'הוכח לשתף מורפולוגיה דומה וביטוי לBAT אבל כבר מצא להיות מקור מתאי שומן לבן ^11.

השיטה הניתוחית שתוארה בכתב היד הזה מספקת לחוקרים עם היכולת לנתח תופעות שונות שגורמים כגון: סביבה, תרופות, וגנטיקה, יש בשומן; כמו גם את תפקיד השומן מועיל או מזיק משחק במחלה ועל בריאות כללית. כמו כן, מספק דרך לזהות ולבודד סוגים שונים של רקמת שומן ללאפשר להבין טוב יותר של מערכות יחסים ביוכימיים והבדלים בין מחסנים. זה יכול לסייע בקביעת הקשר בין מיקום, פונקציה, וסוגים של שומן בגוף. שיטה מתוארת זה משיגה זאת על ידי מתן האמצעי להדמיה גולמית, ניתוח ביטוי גנים, ניתוח ביטוי חלבון, בדיקה היסטולוגית, ובידוד של שורות תאים עיקריות למחקרים במבחנה. נכון לעכשיו יש מאמרים רבים המספקים תובנה התנהגות חילוף חומרים של מחסנים שונים שומן, כמו גם במקומות אנטומיים שלהם; אבל לא מספק שיטה לעומק על איך למקם במיוחד, לזהות, ולבודד מחסנים אלה. שיטה ניתוחית זו מספקת טכניקה מדויקת שמאפשרת בידוד של מחסנים מרובים עם כמות מינימאלית של נתיחה וזיהום בהשוואה לאחרים שיטות שנועדו לבודד ממחסנים אחד או שתיים ^13-14.

המטרה של פרוטוקול זה היא לספקשיטה מדויקת לזיהוי ולבידוד סוגים שונים של מחסני שומן ממקומות אנטומיים רבים של.

פרוטוקול

הערה: כל הנהלים בבעלי החיים בוצעו באישור הוועדה המוסדי הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת סינסינטי ובהתאם למדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה מהמכון הלאומי לבריאות (NIH פרסום מס . 85-23, מתוקן 1996).

1. להרדים ולעקר את העכבר

1. מניחים את העכבר בdropbox המכיל מינון supratheraputic של isoflurane ולאפשר לשאוף להשפעה. לאחר העכבר הוא מורדמים, להסיר מהתיבה.
2. Cervically לנקוע כאמצעי שני של המתת חסד.
3. לעקר את פני השטח החיצוניים של העכבר על ידי ניקוי את החיה עם אתנול 70%.

2. זיהוי ובידוד של שלושה בסיס מיון שומן שונה

1. רקמות שומן חום בידוד (BAT):
   1. ודא שהפרווה היא רטובה מטיהור האלכוהול כדי לסייע בחיתוך דרך Laye אפידרמיס ועוריrs.
   2. מקם את העכבר במצב שכיבה עם גב על השולחן.
   3. תפוס את העור ממש מתחת לסרעפת עם מלקחיים, מעלית ולחתוך עם מספריים.
   4. לחתוך רוחבי סביב ההיקף של העכבר כדי לחשוף את הצפק.
   5. לחשוף את מחסן BAT בצורת פרפר על ידי degloving המחצית העליונה של העכבר. החזק את הנספחים והבטן התחתונים ביד אחת ומושך את העור כלפי מעלה, אל הראש.
   6. כוון את העכבר, כך שהוא נמצא בעמדה נוטה על השולחן. היזהר שלא לזהם את המחסן החשוף עם שיער.
   7. מכשירים נקיים כירורגית ושינוי לזוג טרי של כפפות.
   8. אתר את השכמות ומחסן מקביל. מוציא בזהירות את כל שומן לבן שטחי על גבי הפרפר ולאחר מכן לנתח את הפרפר של שומן חום interscapular. להיות זהיר, כדי למנוע את השריר קשור קשר הדוק עם שומן החום.
      הערה: השימוש במיקרוסקופ לנתיחה מומלצת להסרת wשומן היט, כמו גם בהפרדה של שומן החום מעצם השכמה.
   9. להסיר את שומן המחסן ולהעביר לצינור microcentrifuge 2 מיליליטר.
   10. אם RNA או חלבון הוא להיעקר, להקפיא את הרקמה על ידי טבילה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. להקפיא את המדגם בבת אחת כדי למנוע השפלה. אם culturing, לכסות את הרקמה בDMEF-12 ולהגדיר על קרח עד שכל הדגימות שנאספו לתרבות (מידע נוסף).
2. בידוד של רקמה התת עורית שומן (SQ), רקמות שומן לבן דיפו (WAT):
   1. לשים על זוג טרי של כפפות כדי לא לזהם צולב בין מחסני שומן.
   2. לחשוף את המפשעה, מחסני SQ משולשים על ידי דה-gloving המחצית התחתונה של העכבר. החזק את הנספחים ובית החזה העליונים ביד אחת ומושך את העור כלפי מטה לכיוון הרגליים ביד השנייה.
   3. כוון את העכבר במצב שכיבה בזמן נזהר שלא לזהם את המחסן החשוף עם שיער.
   4. surgica הנקימכשירי l ושינוי לזוג טרי של כפפות.
   5. זהירות לנתח המשולשים של שומן SQ. היזהר שלא לזהם את הדגימה עם שריר, שומן השכן, בלוטות החלב או על ידי חיתוך כל כלים ולזהם את דגימת דם.
      הערה: השימוש במיקרוסקופ לנתיחה מומלצת אם גבולות אינם מוגדרים באופן ברור.
   6. הסר מחסני שומן ולהעביר עד 2 מיליליטר צינורות microcentrifuge.
   7. אם RNA או חלבון הוא להיעקר, להקפיא את הרקמה על ידי טבילה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. להקפיא את המדגם בבת אחת כדי למנוע השפלה.
   8. עבור מכתים, לתקן או להטביע באוקטובר אם culturing, לכסות את הרקמה בDMEF-12 ולהגדיר על קרח עד שכל הדגימות שנאספו לתרבות (מידע נוסף).
3. בידוד של אשכי שומן קרבי שומן רקמות (מע"מ) ולבן שומן רקמות (WAT) דיפו:
   1. לשים על זוג טרי של כפפות כדי לא לזהם צולב בין מחסני שומן.
   2. עם מדעssors, לחתוך את הצפק רוחבי, ישירות מתחת לסרעפת. חותך את הצפק מהסרעפת לאמצע פי הטבעת coronally לחשוף אברי בטן.
   3. אתר את האשכים או שחלות ולזהות את רקמת שומן הלבנה המצורפת, הידועה בשם שומן epididymal בזכרים או שומן אשכים אצל נקבות.
   4. מכשירים נקיים כירורגית ושינוי לזוג כפפות חדש
   5. זהירות לנתח שני מחסני שומן epididymal מהאשכים, epididymides, וdeferentia Vasa. או אם נקבה, לנתח בזהירות את שני רפידות שומן האשכים מהשחלות.
   6. הסר מחסני שומן ולהעביר אותם ל- 2 צינורות microcentrifuge מיליליטר.
   7. אם RNA או חלבון הוא להיעקר, להקפיא את הרקמה על ידי טבילה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. להקפיא את המדגם בבת אחת כדי למנוע השפלה.
   8. עבור מכתים, לתקן או להטביע באוקטובר אם culturing, לכסות את הרקמה בDMEF-12 ולהגדיר על קרח עד שכל הדגימות שנאספו לתרבות (מידע נוסף).

3. בידוד של רקמות שומן perivascular (PVAT)

1. בידוד של הלב:
   1. הנח את העכבר במצב שכיבה עם נספחים העליונים ותחתונים מורחבים כלפי חוץ.
   2. נספחים מאובטחים באמצעות קלטת כירורגית.
   3. לאחר מיצוב העכבר כמפורט לעיל, ליצור מתח על ידי ההרמה על תהליך xiphoid עם מלקחיים. חותך אופקי דרך הסרעפת, חושף את החלק התחתון של חלל בית החזה.
   4. תוך שמירה על מתח, על ידי ההרמה על תהליך xiphoid, לחתוך דרך בית החזה superiorly לכיוון הראש, רק לצד של עצם החזה.
   5. להרים את כלוב הצלעות רק נחותה עצם הבריח, ולחתוך לאורכו הנחותים של עצם הבריח לעבר הבית השחי בשני הכיוונים. חלל בית החזה ובתכניו (לב, ריאות, וכו ') צריכים עכשיו להיות ברור לעין.
   6. נקה את חלל בית החזה של דם ונוזל זרים באמצעות ga סטריליuze לספוג את הנוזל. אם איברים או כלי איסוף הקפידו שופע (מידע נוסף).
   7. ברגע שהאזור מנוקה של נוזל, לחתוך את כלי הסמפונות ומצרפים להסיר את הריאות, המאפשר חשיפה טובה יותר של הלב.
2. לוקליזציה ורקמות כריתה של אבי העורקים perivascular השומן (PVAT):
   1. הסר את האיברים הבאים כלזהות טוב יותר את החלקים הנחותים של אב העורקים: כבד, קיבה, טחול, לבלב, מעי, ומעי גס.
   2. ראשית תתחיל עם זיהוי של הקיבה והוושט. חותך את הוושט בצומת גסטרו-הוושט כדי לשחרר את הבטן מהגוף.
   3. בשלב הבא, לזהות את המעיים ולפדר שמסביב. לחתוך באופן שטחי דרך לפדר, כפי שהוא נמצא קרוב מאוד לחלק הכליות של אב העורקים, ואז "להפעיל את המעיים."
   4. חותך את המעי הגס לשחרר קרוב לפי הטבעת ככל האפשר. לפיכך, לשחרר את הקיבה, המעי ומעי גס מהעכבר.
   5. Reלהזיז את הקיבה, מעי, מעי גס, הלבלב וטחול על ידי חיתוך דרך לפדר המצרף וכלי דם. הלבלב והטחול צריך לבוא בחינם עם הקיבה, המעי ומעי גס.
   6. הסר את הכבד על ידי חיתוך דרך ורידי הכבד ומצרף לפדר, להסיר את כל האונות.
   7. לחתוך את שכבת שומן הקרביים ומקיף את הכליות. השאר את הכליות מחוברים לאב העורקים בvivo לשמש כסמנים גיאוגרפיים למגזרים שונים של אב העורקים.
   8. יש לשטוף את האזור עם סטרילי 1X PBS ולהסיר את כל הנוזל על ידי קליטה עם גזה סטרילית.
   9. באמצעות מיקרו המספריים ומיקרו-מלקחיים, להפריד את אב העורקים מזיקתו לגב עמוד השדרה והקובץ המצורף גחונו לוושט.
   10. לבודד את אב העורקים על ידי ביצוע וניתוק אב העורקים האורך של אב העורקים היורדים מהמוצא בלב להסתעפות באזור הכסל.
   11. לזהות ולבודד את כלי subclavian. לבודד הכלים האלהמהצוואר ועד שורש אב העורקים לחשוף טוב יותר לצומת אב העורקים ושורש בלב.
   12. הסר את בלוטת התימוס ואז לחתוך את עורק brachiocephalic, עורק התרדמה המשותף שמאל, ועורק subclavian שמאל, המאפשר תנועה של הלב.
   13. בסיוע מיקרוסקופ לנתיחה, להציג את שכבת perivascular רקמת שומן (PVAT) המקיפה את אב העורקים.
   14. נקיטת זהירות רבה שלא לצבוט או לסחוט PVAT, משוך בעדינות את דרך PVAT מאב העורקים עם מיקרו-מלקחיים. בעדינות לחתוך את הקובץ המצורף של PVAT לאב העורקים עם מיקרו המספריים החל משעת אזור בית החזה פשוט מעולה למקום שבי הסרעפת ממוקמת.
       הערה: מיקרוסקופ לנתיחה מומלץ.
   15. חזור על תהליך זה לכל האורך של אב העורקים, שסיים באזור אב העורקים infrarenal, הנמצא רק מעולה להסתעפות הכסל של כלי השיט של אב העורקים.
   16. אם PVAT קשת אב העורקים הוא רצוי, השתמש באותה השיטה כדי להסיר את PVAT מג פחותיםurvature של הקשת.
   17. הנח דגימות PVAT לתוך 2 מיליליטר צינור microcentrifuge (ים).
   18. אם RNA או חלבון הוא להיעקר, להקפיא את הרקמה על ידי טבילה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. להקפיא את המדגם בבת אחת כדי למנוע השפלה. אם culturing, לכסות את הרקמה בDMEF-12 ולהגדיר על קרח עד שכל הדגימות שנאספו לתרבות (מידע נוסף).
       הערה: מחסני שומן נוספים לשקול אם מעוניין בניתוח מחסן שומן מקיף כוללת: retroperitoneal, mesenteric, omental, קרום הלב וpopliteal.

תוצאות

זיהוי, ולוקליזציה של שומן תת-עורי מפשעתי, שומן חום interscapular, שומן קרביים epididymal (איור 1), כמו גם את שומן קשת אב העורקים perivascular, שומן אב העורקים החזי, שומן אב העורקים suprarenal ושומן אב העורקים infrarenal (איור 2) הושג בהצלחה באמצעות השיטה הניתוחית שתוארה. בדיקה היסטולוגית ובידול בין דגימות BAT וWAT הוערכו באופן חיובי באמצעות Hematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים (איור 3). ניתוח של רמות RNA של אדיפונקטין, גמא קולט מ...

דיון

השמנת יתר יכול להוביל למארח גדול של תחלואות וההבנה המלאה של התפקיד שממלא שומן אינו מובן במלואו; מחקר לכן המשיך בתחום השומן הוא הכרחי. מודלים של בעלי חיים, במיוחד מודלים עכבריים הם אידיאליים למחקר ראשוני בהתקדמות של מחלות ובדיקות של טיפולי תרופות פוטנציאליים. בשימוש במודלים אלה, בידוד וכריתה של מחסני שומן מדויקים הוא כלי חשוב וההכרחי ביותר במחקר של פתולוגיה של מחלות שומן מושפעת.

בספרות הקיימת לגבי מחסני שומן, יש כ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% אתנול	פישר	07-678-001
DMEF-12	Sigma Aldrich	D-6421	יש לחמם באמבט מים לפני הנחת טישו.
2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה	Midsci	MCT-200-C-S
פוספט חוצץ מלח	סיגמא אולדריץ'	P5368-10PAK