מאמר שיטה

בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (R-μCP) והתמר נוקלאופילית סדרתית

DOI:

10.3791/52186

⸱

31 באוקטובר 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Mechanical Engineering, University of Wisconsin, Madison

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למצעי תרבית תאים המתפקדים עם דפוסים בקנה מידה מיקרו של ליגנדים ביולוגיים יש תועלת עצומה בתחום הנדסת הרקמות. כאן, אנו מדגימים את הייצור הרב-תכליתי והאוטומטי של מצעי תרבית רקמות עם מברשות פולי (אתילן גליקול) מרובות ומיקרו-דפוסיות המציגות כימיה אורתוגונלית המאפשרת קיבוע מדויק מרחבית וספציפי לאתר של ליגנדים ביולוגיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהנדסת רקמות, רצוי להפגין שליטה מרחבית במורפולוגיה של רקמות וגורל תאים בתרבית בקנה מידה מיקרוני. ניתן להשתמש במצעי תרבית המציגים מברשות פולי (אתילן גליקול) (PEG) מושתלות כדי להשיג משימה זו על ידי יצירת אזורים עמידים להידבקות תאים בקנה מידה מיקרו, שאינם עכירות והידבקות תאים, כמו גם אזורים שבהם תאים משתתפים באינטראקציות ביו-ספציפיות עם ליגנדים קשורים קוולנטית. כדי להנדס רקמות מורכבות באמצעות מצעים כאלה, יהיה צורך לעצב ברצף מברשות PEG מרובות המתפקדות כדי להעניק ביו-אקטיביות דיפרנציאלית ומיושרות בכיוונים מיקרו-סקאליים המחקים נישות in vivo. הדפסת מיקרו-מגע (μCP) היא טכניקה רב-תכליתית לעיצוב מברשות PEG מושתלות כאלה, אך לא ניתן לבצע μCP ידני בדיוק בקנה מידה מיקרו. לפיכך, שילבנו רובוטיקה מתקדמת עם טכניקות ליתוגרפיה רכה ותגובות כימיות מתפתחות של פני השטח כדי לפתח שיטה רובוטית בסיוע הדפסת מיקרו-מגע (R-μCP) לייצור מצעי תרבית עם דפוסים מורכבים, מיקרו-סקאליים ומסודרים מאוד של מברשות PEG המציגות כימיה אורתוגונלית של 'קליק'. כאן, אנו מתארים בפירוט את זרימת העבודה לייצור מצעים כאלה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת של משטחים מורכבים-PEG להציג הליגנדים ביוכימיים קוולנטית כרוכים בו-זמנית, תוך שמירה על מאפייני עכירות שאינן טבועים להפוך אותם בחירה אידיאלית עבור סביבות מיקרוסקופיות מותאמות אישית הנדסה על מצעי תרבות 1,2,3. אינטראקציות biospecific מתווכות על ידי מברשות PEG יגנד מצומדות מאפשרת ניתוח מצמצם של ההשפעות של יוכימיים רמזים שנמצאו בתוך מתחם במייקרו-סביבות רקמות vivo על פנוטיפים תא בודדים. יתר על כן, ניתן להשתמש chemistries "לחץ" ביו-מאונך כדי להקל על חוסר תנועה כיוונית של הליגנדים, כך שהם מוצגים בתצורות ילידי 4-6. כך, דפוסים מרחביים מיקרוסקופים של PEG מברשות הוא כלי תכליתי ליצירת מעצב בנישות מבחנה לחקור איתות תא הנגרמת על ידי רמזים ביוכימיים משותקים 6,7.

שיטה נפוצה ליצירת תבניות המרחביות של מ"ק ביוכימייםes כרוך מצעים מצופים זהב הדפסת microcontact (μCP) עם דפוסי alkanethiols מצומדות PEG. ואז, monolayers micropatterned העצמי התאספו (טילי הקרקע-האוויר) של alkanethiols ylated-PEG מגביל ספיחה פיזית של מולקולות ביוכימיות, למשל, חלבונים, רק לאזורים בדוגמת שאינה של המצע 8,9. עם זאת, טילי הקרקע-האוויר שנוצרו על ידי טכניקה זו הן רגישות לחמצון בתרבית תאי תקשורת לטווח ארוך. כך, μCP'd alkanethiol טילי הקרקע-האוויר לעתים קרובות מורכב עוד יותר עם ​​מברשות פולימר PEG באמצעות פילמור הרדיקלי העברת אטום ביוזמת פני השטח (SI-ATRP) כדי להגביר את היציבות שאינה מזהמת את האזור 10. באופן ספציפי, μCP של יוזם פילמור alkanethiol, bromoisobutyrate ω-meraptoundecyl, על משטחים מצופים זהב ואחריו SI-ATRP של פולי (אתילן גליקול) methacrylate אתר מתיל (PEGMEMA) מונומרים יוצר משטחים עם טווח ארוך micropatterned, יציב, ושאינה עכירות PEG מברשות. יתר על כן, אלה הם מסוגלים להיות שונה יותר להציג moieties הכימית מגוון 11.

ניצול של נכס זה, שא et. אל. פיתח שיטה להנדס מצעי תרבות עם מברשות PEGMEMA multicomponent הצגת chemistries "לחץ" מאונך. בשיטה זו, הם משתמשים בסדרה של צעדי μCP / SI-ATRP ביניהם אזיד הנתרן רציף, ethanolamine, וpropargylamine החלפות nucleophilic ליצור מצעי תרבות מציגים דפוסים מיקרוסקופים של הליגנדים משותקים מרובים 6. בעוד שהפוטנציאל של שימוש chemistries כזה בשיתוף עם μCP מדריך ללהנדס מצעי תרבות רומן הוא עצום, הוא מוגבל על ידי הדיוק ואת הדיוק שבה ניתן ליישר צעדי μCP מרובים על מצע אחד. רמה גבוהה של דיוק ודיוק היה נדרשת לייצור reproducibly מורכב בנישות מבחנה תוך שימוש בטכניקות מגוונות אלה.

e_content "> כדי לטפל במגבלה זו, מספר מערכות μCP אוטומטית וחצי אוטומטי שנוצרו. צ'אקרה et. al. פיתחו מערכת μCP בי בולים מותאמים אישית מונחים על מערכת רכבות והביאו במגע קונפורמי עם מגלשות מצופים זהב באמצעות מפעיל פנאומטי מבוקרת מחשב. עם זאת, שיטה זו דורשת ייצור המדויק של עיצובי בולים מותאמים אישית ומדווח 10 מיקרומטר דיוק ללא דו"ח של הדיוק שהושג בעת ביצוע μCP מרובה השלבים 12. לאחרונה, שיטת ניצול מערכת צימוד kinematic משולבת דיוק שדווח להלן 1 מיקרומטר באמצעות דפוס בודד, אבל לא הצליחו ליישר במדויק דפוסים מרובים בשל חוסר השליטה מדויקת של תכונות חותמת מעובש לעצב 13. בנוסף, בשתי השיטות הקודמות דורשים מצע ליישארו קבועים בין צעדי דפוסים , וכך להגביל את מגוון chemistries שינוי פני השטח שיכול להיות משמעותימנוצל. כאן, אנו מתארים מערכת R-μCP אוטומטית מסוגל יישור מדויק ומדויק של צעדי μCP מרובים תוך מתן גמישות מירבית בעיצוב בולים וייצור. יתר על כן, מצעים בדוגמת ניתן להסיר שוב ושוב מהמערכת בין stampings, ובכך לאפשר את שימוש בchemistries שינוי המצע מגוון, כוללים החלפות nucleophilic רציפות. מצעים שהונדסו בשיטות chemistries כזה כבר נעשו שימוש בתרבית תאים בעבר על ידי שנינו 6,14 ואחרים 7. כך, יש לנו התמזגו R-μCP ותגובות התמר נוקלאופילית רציפות לפתח שיטה לייצור להרחבה של מצעי תרבות עם רמזים ביוכימיים מורכבים וmicropatterned.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בולים יצירת אלסטומרי

  1. כדי ליצור אדוני סיליקון של חותמת PDMS, לעצב דפוסי התכונה של photomask באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב.
    1. לעצב את הדפוס הראשון כ20 x 20 מערך של annuli עם 300 מיקרומטר קוטר פנימי (ID) וOD מיקרומטר 600 עם 1,200 מיקרומטר מרווח מרכז למרכז.
    2. לעצב את הדפוס השני כ20 x 20 מערך של annuli עם 600 מזהה מיקרומטר וOD מיקרומטר 900 עם 1,200 מיקרומטר מרווח מרכז למרכז.
    3. בנוסף, מקום 1 x 1 מ"מ 2 סימני התייחסות רבועים בכל ארבע הפינות של כל עיצוב מערך המרווחים 1,200 מיקרומטר מרכז למרכז מדפוס הפינה בזווית של 45 מעלות.
    4. לפברק את אדוני סיליקון לשימוש בניסוי זה עם 1: 1 יחס רוחב-גובה, המקשר לעומק תכונה 300 מיקרומטר תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיה סטנדרטית מפורטות במקום אחר 15 או בשיתוף פעולה עם בית יציקה microfluidic.
      הערה: תכונת עומקים נמוכים מ -100 מיקרומטר יכולים להוביל לעיוות חריגה של בולים לפני מגע עם משטחי מצע.
      הערה: פרוטוקול זה מתחיל שביש אדוני סיליקון כבר הושגו עם הדפוסים שתוארו של photoresist, אשר דורשים ציוד מיוחד וחדרים נקיים ליצור. עדיף להתייעץ עם מתקן מפברק או ליבה ליצור מאסטרים בדוגמת אלה.
  2. אדוני סיליקון Silanize O / N על ידי דגירה עם אדים (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) trichlorosilane.
    הערה: אדי Silane הוא רעילים ביותר ויש לטפל רק במנדף הכימי.
  3. ליצור העתקים הפוכות של אדוני סיליקון על ידי ריפוי 10: 1 של PDMS מראש פולימר וPDMS סוכן ריפוי על גבי אדוני סיליקון silanized בO צלחת פטרי / N ב 60 ° C.
  4. הסר את בולי PDMS מן המאסטרים סיליקון, ואג"ח הבולים לאקריל ניטריל acrylonitrile רפידות (ABS) או כל חומר קשיח אחרs באמצעות דבק.
    הערה: החומר של בחירה לא צריך להיות שקוף או ביולוגית. עם זאת, הוא חייב לספק משטח שטוח לממשק עם נוסע רובוטית וקשיחות גבוהה יותר מPDMS.

2. Coverslides הכנה

  1. coverslides לשטוף מיקרוסקופ (24 מ"מ x 50 # 1 מ"מ) בטולואן, מתנול וsonicate באצטון 1 דקות לפני השטיפה עם אתנול וייבוש תחת זרם חנקן עדין.
    הערה: ידית טולואן ואצטון רק במנדף הכימי.
  2. coverslides מעיל עם ~ 3.5 טיטניום ננומטר (TI) ואחריו 18.0 זהב ננומטר (Au) באמצעות מאייד אלומת אלקטרונים ממוקד.
    הערה: הליך זה תואם עם מגוון רחב של מצעים מצופים זהב כוללים סיליקון וקלקר. למרות שניתן ליצור אלה באתר, מצעים מצופים זהב זמינים גם באמצעות ספקים מסחריים.
    הערה: שכבות Ti צריכה להיות לפחות 3 ננומטר עבה, בעוד ששכבות Au על מצעים צריכה להיותt לפחות 5 ננומטר עבה ויכולים לנוע כל הדרך עד 1 מ"מ בעובי בהתאם לתכונות אופטיות האידיאלית של המצע הסופי 16,17. מצעים אינם נדרשים להיות ברור אופטי לייצור; עם זאת, הוא מאפשר בדיקה מיקרוסקופית של מצעים מפוברקים.
  3. יש לשטוף coverslides מצופה זהב עם אתנול ויבש תחת חנקן עדין מייד לפני השימוש.

3. R-μCP של annulus החיצוני

  1. לפני R-μCP עם המערכת באופן סלקטיבי תואמת זרוע רובוט ניסחה (SCARA), לכייל את effectors רובוטית הכלי ומערכות מצלמה כפולה נלוות באמצעות התוכנה של המערכת.
    הערה: מכשירים אלה הם בתמונה באיור 1.

figure-protocol-1
מערכת באיור 1. R-μCP ורובוטיק נוסע זרוע. (ב) נוסע זרוע רובוטית המתאר (ו) כלי תחריט שקצהו יהלום וכלי יניקת פנאומטי מחזיק חותמת PDMS (ח) מגובי ABS (ז).

  1. באופן ידני לשים בול PDMS עם 600 מזהה מיקרומטר ו -900 OD מיקרומטר בולט annuli עם הפנים כלפי מטה במתקן קינון חותמת. באופן ידני למקם coverslide מצופה זהב נוקה לאחרונה על גבי צ'אק הוואקום, מוצג באיור 1 א, ולשתק אותו באמצעות ואקום המעבדה המחובר.
  2. שימוש בפקדי הרובוט, ליישר את המצלמה כלפי מטה למול נקודת coverslide מצופה זהב המרכז, כמו באיור 2 א.
    הערה: נקודה זו התחלה יכולה להיות מוגדרת על ידי בדיקה ויזואלית ואינה דורשת דיוק רב, כמו חותמת PDMS היא הרבה largאה מ השקופית מצופה זהב.
  3. הדרך את הזרוע הרובוטית כדי לחרוט ארבע התייחסות "X" סימנים בקודקודים של ריבוע עם ממדים 3.8 מ"מ של 3.8 מ"מ במרכז בcoverslide מצופה הזהב באמצעות כלי תחריט שקצהו היהלום הצמוד לזרוע רובוטית. (מתואר באיור 2; תהליך אוטומטי)
    הערה: זו מבטיחה שכל ארבעת סימני ההתייחסות נמצאים במסגרת חזותית אחד של המצלמה פונה כלפי מטה.
  4. השימוש ברובוטים נוסע יניקת פנאומטי, איסוף ולהחזיק PDMS להחתים 1 מ"מ מעל מתקן קינון חותמת כמו באיור 2 ג. (תהליך אוטומטי)
  5. שימוש במצלמה כלפי מעלה מול וטבעת תאורת LED בתמונה באיור 2 ד ו E, לדמיין סימני ההתייחסות מרובעת של הבולים ולזהות אותם עם תוכנת המצלמה 10 פעמים על מנת לקבוע X הממוצע של הבול, Y, וזוויתי לקזז מהמרכז ציר נוסע רובוט. (תהליך אוטומטי)
  6. כמו ב הערה: חישוב פנימי מבוצע על ידי התוכנה של מערכת רובוטית כדי ליישר בדיוק של הבולים וX של coverslip, מקומות מרכז Y וקיזוזים זוויתי בצעדי R-μCP עתיד.
  7. 3.8) מניחים את החותמת באמבט של alkanethiol יוזם ATRP, bromoisobutyrate ω-mercaptoundecyl (2 מ"מ באתנול) כמתואר באיור 2F. (תהליך אוטומטי)
  8. הסר את החותמת מפתרון alkanethiol ומניח מעל זרם חנקן הדחוס כדי 0.48 בר (5 psi) להתאדות אתנול כמו באיור 2G. לאחר 1 דקות להגביר את הלחץ של זרם החנקן הוא 1.03 בר (15 psi) כדי להבטיח יובש אחיד. (תהליך אוטומטי)
    הערה: הייבוש חלקי יגרום לאובדן מוחלט או חלקי של נאמנות דפוס.
  9. לאחר ייבוש, להעביר את החותמת על עמדת המרכז המחושבת של השקופית מצופה זהב ומוריד אותה ב 100 מיקרומטר במרווחים תוך מעקב כוח מנוע ציר Z-כמתואר באיור 2H.
    הערה: זה מועבר כמומנט שחווה את מנוע ציר Z-ומוצג בתוכנת הדרכת רובוט. (תהליך אוטומטי)
  10. להפסיק הורדת החותמת פעם הלחץ הקבוע מראש של 79.2 kPa הושג, ולשמור על קשר עם השקופיות מצופים זהב במשך 15 שניות. (תהליך אוטומטי)
    הערה: ערכי הלחץ כאן מותאמים לגובה עיצוב בול והתכונה הנוכחי. אם עיצוב הבול משתנה, במיוחד עבור בולי יחס רוחב-גובה גבוה, מנגינה בהתאם אלה בתהליך של ניסוי והטעייה.
  11. לאט לאט להסיר את החותמת מהשקופית מצופה זהב ולמקם את החותמת בחזרה במתקן קינון חותמת. (תהליך אוטומטי)
4. SI-ATRP של PEGMEMA על Coverslides micropatterned
  1. לשחרר לחץ ואקום מחזיק coverslide micropatterned, ולהעביר אותו לבקבוק Schlenk 50 מיליליטר. חותם ודגת Schlenk בקבוקון באמצעות משאבת ואקום.
  2. להוסיף 5.5 מיליליטר של תערובת תגובת ATRP מכילה macromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), מים (34.4 מיליליטר), מתנול (43.8 מיליליטר), נחושת (II) ברומיד (mmol 1), ו- 2 ', 2-bipyridine (3 mmol) ל בקבוק Schlenk.
  3. הוסף 0.5 מיליליטר של ascorbate L-נתרן (454.3 מ"מ) במים כדי ליזום את התגובה, ותאפשר לה להמשיך במשך 16 שעות ב RT תחת גז אינרטי.
    הערה: בעקבות תוספת של ascorbate L-נתרן, צבע תגובה תעבור מהצבע הירוק בהיר עד חום כהה, כפי שמוצגת באיור 3 א-B.
    הערה: התגובה יכולה להמשיך מעבר 16 שעות, אבל זה לא יהיה להגדיל את האורך של מברשות PEG באופן משמעותי.

figure-protocol-2 איור 3. ייזום של SI-ATRP. () ייזום של תגובה ושינוי צבע שלאחר מכן (ב ') לאחר תוספת של ascorbate L-נתרן. תמונה (C) מיקרוסקופים של משטח coverslide micropatterned ביצוע הליך SI-ATRP. סרגל קנה מידה של 1 מ"מ.

  1. הסר את coverslide micropatterned מהבקבוק שנק ולשטוף עם אתנול, מים, ואתנול ויבש תחת זרם חנקן עדין.
    הערה: בעקבות SI-ATRP, שינויי משטח צריכה להיות גלויות לעין וניתן הדמיה ונותחו תחת מיקרוסקופ כמו באיור 3 ג.
    הערה: זוהי השיטה הפשוטה ביותר כדי לבדוק את הדיוק של המשפט כפי שהוא מייתר את הצורך לimmunostain מצעים.

5. Functionalization יזיד של שרשרות micropatterned PEGMEMA

  1. הנח את coverslide micropatterned בבקבוקון זכוכית תגובת 20 מיליליטר.
  2. הוסף 6 מיליליטר של N, N -dimethylformamide (DMF) מכיל 100 אזיד הנתרן מ"מ לבקבוקון התגובה. לשמור על תגובה זו על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    הערה: ידית DMF רק במנדף הכימי. נהג במשנה זהירות כאשר משקל את אזיד הנתרן.
  3. בסיום, להסיר את coverslide micropatterned מבקבוקון התגובה ולשטוף עם אתנול ואז מים ויבשים תחת זרם חנקן.

6. פסיבציה של שרשרות ברום פונקציונליות PEGMEMA

  1. הנח coverslide micropatterned בבקבוקוני זכוכית תגובת 20 מיליליטר.
  2. הוסף 6 מיליליטר של sulfoxide דימתיל (DMSO) המכיל 100 ethanolamine מ"מ ו -300 מ"מ triethylamine לבקבוקון התגובה. החזק את התגובה הזאת ב 40 ° C למשך 24 שעות.
    הערה: ידית DMSO, ethanolamine, וtriethylamine רק במנדף הכימי.
  3. עם ההשלמה להסיר את coversl micropatternedIDE מבקבוקון התגובה, לשטוף עם אתנול ואז מים ויבשים תחת זרם חנקן.

7. R-μCP של annulus הפנימי וSI-ATRP של PEGMEMA

  1. לבצע צעדי R-μCP כפי שתואר לעיל בצעדים 3.2 ו3.6-3.12, החלפת חותמת PDMS עם 300 annuli OD הבולט מיקרומטר מזהה ו 600 מיקרומטר, כך שannuli עם תכונות קטנות ממוקמים בתוך annuli micropatterned בעבר.
    הערה: סף הלחץ בבול זה הוא 132.0 kPa. כפי שהוזכר קודם לכן, הגדרות לחץ אלה הינן אופטימליות לתכונות חותמות בשימוש בניסוי זה.
  2. לבצע צעדי SI-ATRP כפי שתואר לעיל בצעדים 4.1-4.4.

8. אצטילן Functionalization של שרשרות micropatterned PEGMEMA

  1. הנח coverslide micropatterned בבקבוקון זכוכית תגובת 20 מיליליטר.
  2. הוסף 6 מיליליטר של DMSO המכיל 100 מ"מpropargylamine לבקבוקון התגובה. לשמור על תגובה זו ב RT למשך 24 שעות.
    הערה: ידית DMSO וpropargylamine רק במנדף הכימי.
  3. עם ההשלמה להסיר את coverslide micropatterned מבקבוקון התגובה ולשטוף עם אתנול ואז מים ויבשים תחת זרם חנקן.

9.-catalyzed נחושת "לחץ" biotinylation של אצטילן הסתיים בשרשרות PEGMEMA

  1. הנח coverslide micropatterned בבקבוקון זכוכית תגובת 20 מיליליטר.
  2. להוסיף 6 מיליליטר של נחושת גופרתית (15 מ"מ) / טריס [(1-בנזיל-1 H -1,2,3-triazol-4 י.ל.-) מתיל] אמין (TBTA, 30 מ"מ) (1: 1 v / במים • / DMF) מכיל 562 מיקרומטר המצומד אזיד-PEG 4 -Biotin לבקבוקון התגובה. להוסיף 1.2 מיליליטר של חומצת L-אסקורבית (0.15 מ"מ) במים לתערובת כדי לאתחל את התגובה.
  3. חנקן בועה באמצעות פתרון התגובה עבור 10 שניות, לאטום את הבקבוקון עם Parafilm, ולהגיב למשך 24 שעות ב RT.
  4. על completion להסיר coverslide micropatterned מבקבוקון התגובה, לשטוף עם מים ומניחים אותו בצלחת קלקר 12 גם.

10. Immunofluorescent איתור של קבוצות אצטילן Biotinylated

  1. לחסום coverslide micropatterned בDPBS (3% חמורים בדם) במשך שעה 1 ב RT. כתם לקבוצות אצטילן biotinylated עם המצומד streptavidin-546 (2 מיקרוגרם / מיליליטר) בDBPS (3% חמורים בדם בPBS) לשעה 2 ב RT.
  2. יש לשטוף coverslide micropatterned 5 פעמים עם DPBS במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.
    הערה: איור 4 מתארים תמונה של השקופית לאחר שלב זה הושלם.

11. נחושת חופשית "לחץ" biotinylation של יזיד הסתיים בשרשרות PEGMEMA

הערה: אם תרצו, ניתן לבצע צעד שינוי המצע הזה באתר בתרבית תאים.

  1. השאר coverslide micropatterned ב12 גם pDBPS הבא המנה olystyrene שטיפות.
  2. הוסף 2 מיליליטר של DBPS (או תרבית תאי תקשורת) המכיל 20 מיקרומטר 4 DBCO-PEG -Biotin, ולאפשר תגובה זו להימשך 24 שעות על RT (או על 37 מעלות צלזיוס בחממה).
  3. בסיום, לשטוף coverslide micropatterned 5 פעמים עם DPBS (או פשוט לבצע שינוי תקשורת).

12. Immunofluorescent איתור של קבוצות יזידו Biotinylated

  1. כתם לקבוצות אזיד biotinylated עם המצומד streptavidin-488 (2 מיקרוגרם / מיליליטר) ב 2 DPBS מיליליטר (3% חמורים בדם) לשעה 2 ב RT.
  2. יש לשטוף coverslide micropatterned 5 פעמים בDPBS במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.
  3. תמונת micropatterned coverslide באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. איור 4 א-C מתארת ​​תמונות של השקופית לאחר שלב זה הושלם.
    הערה: בעת שימוש מצעים למבחני תרבית רקמה, לדלג סעיפים 10 ו -12 של פרוטוקול זה. לאחר degre הרצוידואר של functionalization, לעקר את coverslide המהונדס על ידי שטיפת שני הצדדים עם 100% אתנול וייבוש תחת זרם חנקן. העבר את השקופית לארון בטיחות ביולוגית סטרילי ולשטוף את השקופיות עם PBS חמש פעמים לפני שתמשיך עם זריעת תאים ותרבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בטכניקות μCP היישור ידניים להנדס מצעי תרבות עם מערכים של מברשות שהושתלו PEG פונקציונליות עם מאונך "לחץ" chemistries הוכח בעבודות קודמות 6. עם זאת, זה מציע שליטה מינימאלית של התמצאות דפוס ולעתים קרובות תוצאות חפיפה של התחומים פונקציונליות. כאן, מערכת R-μCP רומן משמשת כדי להתגבר על מגבלה זו, ואת יכולתו בצורה מדויקת תבנית מערך של annuli מברשת PEG עם 300 מיקרומטר מזהה ו -600 OD מיקרומטר הצגת קבוצות alkyne מסוף בתוך מערך נפרד של annuli מברשת PEG עם 600 מיקרומטר OD ID ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מצעים אידיאליים עבור הנדסת רקמות יהיו bioinspired ובכך לשחזר את ההתפלגות המרחבית של ביו הליגנדים קריטיים נמצאים בתוך הרקמות המקומיות. הם גם היו בעלי תכונות דינמיות המאפשרות התאמות זמניות של הליגנדים ודפוסי המרחב שבו הם מוצגים כדי לאפשר המורפוגנזה רקמה ביימה ומרחבית מוגבלת אינדוקציה של גורל תא. ייצור של מצעים כזה דורש הקיבוע של רמזים ביוכימיים רבים בכיוונים מורכבים והורה מאוד על מצעים. בעוד מדמים את כל הגורמים במשק של הנישה של תאים במבחנה אינו סביר, מערכת R-μCP המתוארת כאן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון לעבודה זו, GTK, TK ו-JDM סופקו על ידי מכון ויסקונסין לגילוי וקרן המחקר של בוגרי ויסקונסין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סקארה EpsonLS3-401STדגמים מתקדמים יותר עם דיוק מוגבר זמינים במידת הצורך. 
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilaneGelestSIT8174.0זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי. בעת סילאן ופלים, אף אחד לא צריך להיכנס למכסה המנוע עד שכל הסילאן התאדה.
ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184Ellsworth Adhesive CoNC9020938מסירה תמיסות באמצעות חשיפה בוואקום לפני השימוש. ערכות חלופיות כגון ערכה 182 מקובלות.
24 מ"מ x 50 מ"מ #1 כיסוי זכוכית שקופיותפישר סיינטיפיק48393106ניתן לרכוש אותם ממספר ספקים במידות משתנות בהתאם לצורך.
CHA-600 Telemark מאייד קרן אלקטרוניםTelemarkSEC-600-RAPדרישות הכשרה מיוחדת.
EPSON LS3 SCARAEPSONLS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrateProchimiaFT 015-m11-0.2יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. יוזמי ATRP אחרים עשויים לשמש כ-R-&mu זה; פלטפורמת CP ישימה לכל שיטות המיקרו-דפוס.
בקבוק צינור שלנק 50 מ"לSynthware60003-078דורש פקקי גומי עם דיאפרם.
פולי (אתילן גליקול) מתיל אתר מתאקרילטסיגמא אולדריץ'447943נשלח המכיל מעכבי קריאה ללא MEHQ ו-BHT.
מתנול (מאושר ACS)Fisher ScientificA412-4זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.
נחושת (II) ברומידסיגמא אולדריץ'437867זהירות, הגבל את החשיפה עם מסכה כירורגית.
2,2'-BipyridineSigma AldrichD216305זהירות, הגבל את החשיפה עם מסכה כירורגית.
נתרן L-אסקורבטסיגמא אולדריץ'A4034
20 מ"ל בקבוקוני נצנוץ זכוכית בורוסיליקטפישר סיינטיפיק03-340-4E
נתרן אזידסיגמא אולדריץ'S2002זהירות, הגבל את החשיפה עם מסכה כירורגית.
N,N-dimethyformamideSigma Aldrich227056זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.
אתנולמיןסיגמא אולדריץ'398136זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.
טריאתילאמיןסיגמא אולדריץ'T0886זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.
דימתיל-סולפוקסידסיגמא אולדריץ'276855זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.
פרופרג'ילמיןסיגמא אולדריץ'P50900זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.
200 הוכחת אתנולשירותי הפצת חומרים של אוניברסיטת ויסקונסין2292זהירות, יש לטפל רק במכסה אדים כימי.
Azide-PEG3-BiotinClickChemistryToolsAZ104-100מסיס ב-DMF
נחושת (II) סולפטסיגמא אולדריץ'C1297זהירות, הגבל את החשיפה עם מסכה כירורגית.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)Sigma Aldrich678937
L-Ascorbic AcidSigma AldrichA7506
Phosphate BufferInvitrogen14190144
Donkey SerumSigma AldrichD9663פריטים מזוהמים בסרום חמור נחשבים לחומר מסוכן ביולוגית ויש להשליך אותם בהתאם. תרכובות שונות אחרות (למשל BSA) זמינות ומשרתות מטרה זו.
צלחת פוליסטירן 12 בארותThermo Scientifit - NUNC07-200-81ניתן לרכוש צלחות ממספר ספקים במידות שונות.
DBCO-PEG4-ביוטיןClickchemistytoolsA105P4-10מסיס ב-DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 ConjugateLife TechnologiesS-11223מסיס ב-PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 ConjugateLife TechnologiesS-11225מסיס ב-PBS
Nikon A1-R מיקרוסקופ קונפוקליNikon NikonEclipse Ti, A1Rמספיק מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי כדי לדמות מצעים מיקרו-דפוסיים פונקציונליים.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
  2. Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
  3. Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
  4. Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
  5. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
  6. Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
  7. Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
  8. Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
  9. Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
  10. Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
  11. Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
  12. Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
  13. Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455(2011).
  14. McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
  15. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  16. Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
  17. Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
  18. Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
  19. Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
  20. Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97(2010).
  21. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  22. Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
  23. Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Biomaterials. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
  24. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  25. Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Robotic Microcontact PrintingSequential Nucleophilic SubstitutionPEG Brush FunctionalizationGold Coated SubstratesOrthogonal Click ChemistriesTissue Culture SubstratesMicron Scale PatterningFluorescent Probe ConjugationStreptavidin BindingCustom Image Analysis

מאמרים קשורים