טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לכימות פגוציטוזיס של חלקיקים פלואורסצנטיים על ידי קו תאי מקרופאגים דבק בשיטה פלואורומטרית. שיטה זו מאפשרת כימות תפוקה גבוהה של הפנמת חלקיקים כמו גם פילמור האקטין המתקבל.

תקציר

המטרה של ניתוח fluorometric היא לשמש ככלי עזר יעילים, חסכוני, תפוקה גבוהה של ניתוח phagocytosis ותהליכים תאיים אחרים. טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגי תאים, שני חסיד ולא חסיד, לבחון מגוון רחב של תכונות הסלולר. כאשר לומדים phagocytosis, טכניקת fluorometric מנצלת סוגי תאי phagocytic כגון מקרופאגים, וחלקיקי opsonized שכותרתו fluorescently הקרינה שיכולים להיות כבוי בנוכחות trypan הכחולה. בעקבות ציפוי של מקרופאגים חסיד ב96-גם צלחות, חלקיקי ניאון (ירוק או אדום) מנוהלים ותאים מותר phagocytose לכמויות שונות של זמן. בעקבות הפנמה של חלקיקי ניאון, תאים נשטפים עם trypan כחול, המאפשר הכחדה של אות ניאון מחיידקים אשר לא הפנימו, או שהם רק הקפדה על פני התא. בעקבות לשטוף trypan, תאים נשטפים עם PBS, קבועה,nd מגואלות DAPI (תווית ניאון כחולה גרעינית), המשמש לסימון גרעינים של תאים. על ידי כימות fluorometric פשוט באמצעות קריאת צלחת גרעינית (כחולה) או חלקיקי הקרינה (אדום / ירוקה) אנחנו יכולים לבחון את היחס של יחידות יחסית הקרינה של ירוק: כחולות ולקבוע מדד phagocytic מעיד על כמות חיידקי ניאון הפנימו לכל תא. משך assay באמצעות טפטפות שיטה ורבות ערוצים 96-גם לשטיפה, מסוף phagocytosis לסיים רכישת נתונים, הוא פחות מ 45 דקות. Cytometry זרימה יכולה לשמש באופן דומה, אך היתרון של fluorometry הוא התפוקה הגבוהה שלה, שיטה מהירה של הערכה עם מניפולציה מינימאלית של דגימות וכימות מהיר של עוצמת ניאון לכל תא. ניתן ליישם אסטרטגיות דומות לתאים שאינם חסיד, שכותרתו חיידקים חי, פילמור אקטין, ובעצם כל תהליך ניצול הקרינה. לכן, fluorometry היא שיטה מבטיחה עבור העלות נמוכה, הגבוה throughpיכולות ut במחקר של תהליכים תאיים.

מבוא

כימות של אות ניאון כבר בשימוש נרחב במגוון רחב של שיטות מדעיות החל PCR, cytometry זרימה, מיקרוסקופיה confocal, וסריג ניתוח זמנית ELISA. יש הדמיה הקרינה וכימות יישום רחב והוא יכול להיות כלי נהדר לניתוח כמותי של תהליכים תאיים שונים. שימוש בסמני ניאון והאות שלהם כבר מהפכה בעשור האחרון, והופעתה של קוראי צלחת ניאון יש להקל כימות תפוקה הגבוה של הקרינה הנפלטת במהלך תהליכים תאיים.

ניתוח Fluorometric יכול לשמש כלי נהדר בכימות של phagocytosis. Phagocytosis נחקר מאז גילוי phagocytes ידי Metchnikoff בשנת 1800 ^1. במהלך השנים, במגוון שיטות כבר נוצל כדי לבחון תהליך חשוב זה חיוני להגנה חיסונית מולדת נגד פלישת חיידקים, נגיפיות, פטריות וטפילות פתוגנים ^2-5. שיטות קודמות של מיקרוסקופיה כימות מנוצל וטכניקות stereological כדי להמחיש תאים הphagocytosing, שהיו לכמת אז על ידי ספירה של חלקיקים הפנימו (ידני או עם שימוש בתוכנה) ^6-8. חסרונות מסוימים לבאמצעות מיקרוסקופ לבד לניתוח כמותי הם שספירה ידנית של חיידקים היא עבודה אינטנסיבית ונוטה יותר להטית משקיף. שיטה נוספת המשמשת בכימות של phagocytosis היא טכניקת המיקרוביולוגית של ציפוי של חיידקים מהתא lysates (להלן phagocytosis) על צלחות תרבית חיידקים, אך שיטה זו יכולה להיכשל לתת דין וחשבון למנגנונים ונוכחות של חיידקים הפנימו באופן חלקי bactericidal. שיטה זו היא עוד יותר עבודה אינטנסיבית בהשוואה למיקרוסקופיה ולוקחת כמה ימים כדי לנתח. נראה cytometry זרימה להיות דרך המהירה והיעילה ביותר לכימות phagocytosis ונוצל על ידי קבוצות רבות ^9-11, אבל העלות הגבוהה נפוצה הקשורים במחוונים דרושים לניתוח עושה את זה בשיטה יקרה ביותר בהשוואה למבחנים שהוזכרו קודם לכן.

שיטת fluorometric היא אלטרנטיבה טובה לcytometry זרימה לניתוח של הפנמת חלקיקים שכן הוא מציע כימות משוחד של ציוד הקרינה באמצעות שאינו כעלותו. יתרונות נוספים אחרים של fluorometry הם יעילות גבוהה, ויכולות תפוקה גבוהות לכימות הקרינה הנפלטת על ידי שכותרתו החלקיקים הפנימו.

יתרונות של fluorometry ניתן להסיק לכימות של תהליכים אחרים מאשר phagocytosis. לדוגמא, ניתוח fluorometric ניתן ליישם ללמוד כל תהליך מוביל לשינויים בביטוי של תאית או קולטני קרום הנכנס, שינויים בתא חדירות / כדאיות, יעילות transfection, ואפנון בפילמור אקטין. חיסרון אחד של טכניקת fluorometric הוא ש, בהתאם לתוויות שימוש, ייתכנו גבוהניסוי לניסוי שונות אשר בדרך כלל ניתן לפתור על ידי הוכחת נתונים באמצעות כימות יחסי, כגון שינוי קיפול או עליית אחוזים מהשליטה.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש עבור יישומים רבים כגון כימות של פילמור phagocytosis ויקטין הכמשמש בעבודה שפורסמה בעבר שלנו ^12. הפרוטוקול משאיל את עצמו למגוון רחב של שינוי, וסוגי תאי טבלה 1 וחלקיקים נוצלו בהצלחה בלימודים האחרונים. שימוש סטנדרטי של פרוטוקול זה לכימות של פילמור phagocytosis או אקטין מתואר בתרשים 1.

תרשים 1:. תרשים של assay fluorometric לכימות של פילמור phagocytosis ויקטין לאחר התאים מצופה, טופלו, ואפשרו לדבוק, חלקיקים שכותרתו עם הקרינה ירוקה (FITC) מתווספים לתאים לphagocytosis. תגובה הוא נעצר על ידי trypan או antibiלשטוף otic (כדי למנוע חלקיקים-הפנים שאינם) והקיבעון מתבצע עם paraformaldehyde 4%. תאים הם מוכתמים לאחר מכן עם תווית אדומה ניאון אקטין (phalloidin rhodamine) ותווית כחולה ניאון (DAPI). אינדקסים של phagocytosis ופילמור יקטינו לכמת כמו יחס של יחידות הקרינה היחסית של ירוק / כחול (FITC / DAPI), או הקרינה אדומה / כחולה (rhodamine / DAPI).

1. ציפוי ותאי טיפול

הערה: לפני תחילת, לשקול הפעלת הטיפולים עם לפחות 4 משכפל טכני, וכוללת את הפקדים הבאים בפריסת הצלחת: תאים בלבד (בלא כתם, עם DAPI לבד או rhodamine לבד) וחלקיקים בלבד.

1. לנהל את כל התוספת של חומרים כימיים בצעדים 1-4 במנדף תרבית תאים סטריליים כדי להגן על הדגימות מזיהום.
2. מקרופאגים צלחת (קו תא J774 עכברי) בצלחת 96-היטב ב1-5 x 10 ⁴ תאים ב -50 μl (לכל טוב) של תוספת תקשורת שחומם מראש. צלחות אידיאליים לשיטה זו הן 96-גם צלחות שחורות עם תחתית שקופה או שחורה, תלוי ביכולות קורא.
   1. לתקשורת בתוספת, להשתמש בחום של 10% מומת FBS כדי למנוע הפרעה של מפל משלים, ופניצילין 1% / סטרפטומיצין (אם לא באמצעות חיידקים חיים לphagocytosis). אם תאים חסיד באמצעות לאפשר 1-2 שעות להידבקות, ולתאים שאינם חסיד, ספין למטה הצלחת עם תאים במשך 10 דקות ב 500 x גרם.
3. להוסיף אגוניסטים / יריבים רצויים או שליטה ברכב בריכוז 2x (resuspended ב PBS או יותר עדיף, בתקשורת בתוספת) ב -50 μl עבור נפח סופי של 100 μl (1x) ו דגירה של כמות רצויה של זמן. מאגרי פיפטה ומגיב רב-ערוצי יאפשר עיבוד המהיר ביותר.

2. Opsonization של חלקיקי פלורסנט

ftp_upload / 52,195 / "width =" 500 52195table1.jpg "/>
סוגי תאים נבדקו וחלקיקי ניאון בניתוח fluorometric של phagocytosis ופילמור אקטין טבלה 1 מדגימה שילובים של סוגי תאים (שורות תאים, ותאים ראשוניים) שהקבוצה שלנו השתמשה באמצעות שיטת fluorometric: טבלה 1.. מלבד מסתכל על phagocytosis ופילמור אקטין על ידי תאים מסוג בר, יש לנו גם כמה מנוצלת של חלקיקים אלה לבדיקה של phagocytosis על ידי תאי transfected להביע GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק). גם הקרינה של התאים transfected עם פלסמידים המכילים כתבי ניאון יכולה לשמש כסמן סלולארי בנוסף לDAPI אגדה בטבלה. - פילמור אקטין; P - phagocytosis; PT - phagocytosis ידי GFP שכותרתו תאי transfected; OPDex - opsonized חרוז dextran; HKOP - חום הרוגים opsonized.

1. ודא שחלקיקים ותוויות ניאון מוגנים מפני אור בכל העת, during עיבוד, כביסה, כמו גם במהלך הדגירה על מנת למנוע photobleaching
   1. לחלקיקים יבשים, לשקול את חיידקים נהרגו חום ניאון opsonized (HKOP) (E2861: זן E. coli K-12), תוך שימוש במפרטים של היצרן. תשמור על עצמך כדי לוודא שהחשבונות ההמוניים במשך 10: 1 - 20: 1 חיידקים: יחס תא (או לפחות 10: 1 - נפוצה בכימות של phagocytosis) ^13,14. מספר החלקיקים יכול להיות מסופק על ידי היצרן או נקבע באמצעות couting דילולים סדרתי של 1 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות.
   2. Resuspend ב 50 μl PBS ו מערבולת דקה 1 בהגדרה הגבוהה ביותר. ודא vortexing הנכון (כאן ובכל רחבי הפרוטוקול) כחלקיקים נוטים לצבור אשר עשוי להשפיע יעילות של opsonization.
   3. עבור חלקיקים בתרחיף כגון חרוזים dextran ככותרתו fluorescently (חרוזים DEX), מערבולת פתרון מניות דקות 1, לקחת 50 μl של השעיה או בהתאם לריכוז חרוז בד הנפחetermine הר של חרוזים כדי להקל על 10: 1 חרוז: יחס תא.
2. הוסף נפח שווה של מגיב opsonizing לחלקיקים ונמרץ מערבולת עוד דקה.
3. דגירה החלקיקים עם opsonizing מגיב על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
4. לאחר הדגירה, צנטריפוגות החלקיקים במשך 5 דקות ב 500 XG, ולהסיר את supernant מכיל מגיב opsonizing עודף. לשטוף את החלקיקים על ידי הוספה של PBS 100 μl, מערבולת resuspend גלולה, וcentrifugate במשך 5 דקות ב 500 x גרם.
   1. חזור על שלבים אלה שתי פעמים כדי להבטיח opsonization וההסרה של נוגדן מאוגד נכונים.
5. הכן את פתרון העבודה של חלקיקי opsonized ידי resuspending ב 5 מיליליטר של תקשורת (מספיק לצלחת אחת 96-היטב) ולאחסן הרחק מאור עד בנוסף לתאים.

3. phagocytosis

1. מניחים את פתרון העבודה של חלקיקים במאגר מגיב סטרילי. מכאן, להוסיף 5056; l של חלקיקי opsonized לתאים מוכנים בשלב 1 (לריכוז סופי של 50 ng / ml) ולאפשר phagocytosis להתרחש בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. מודגמים להלן שתי שיטות של phagocytosis שניתן להעריך בשיטה זו (תרשים 2).

תרשים 2:. השוואה של phagocytosis הרציף לעומת לסנכרן phagocytosis הרציף מציינת הפנמה מתמשכת של חלקיקים לאורך זמן כפי שהם מגיעים לאט את התאים על תחתית הבאר. צעד מנוגד סנכרון (צנטריפוגה) מאלץ את החלקיקים לשקוע לתחתית, שיפור הקשר עם חלקיקי התא, ושהוביל להפנמה מיידית על ידי התאים. phagocytosis המסונכרן הוא תהליך מהיר שמהירות רבה יותר מפנימים חלקicles בשל תא המוגבר: קשר חלקיקים.

1. 1. לשיטה רציפה phagocytosis (תרשים 2) המאפשר לתאי phagocytose רציפות חיידקי opsonized כפי שהם שוקעים לאט לתחתית ובאים במגע עם תאים, לנצל מסגרות זמן ארוכות יותר כדי לאפשר לחיידקים להגיע לתחתית הבאר ולקבל ב לגעת בתאים. אם ביצוע ניסוי timecourse, להוסיף חיידקים במרווחי זמן שונים ולעצור את כל הצלחת של תגובות באותו הזמן על מנת לשפר את מהירות העיבוד.
   2. לשיטה המסונכרן phagocytosis (תרשים 2) שמשפרת את החלקיקים: תא קשר באמצעות צנטריפוגה, ספין למטה כל הצלחת המכילה תאים וחלקיקים (5 דק 'ב 500 XG) ברגע שהחלקיקים מתווספים, כדי להקל על סנכרון של כל נקודות הזמן ו כדי לזרז את החלקיקים: האינטראקציה תא.
      1. למדוד את מהלך הזמן החל מייד לאחר השלמת centriצעד fugation. אם ביצוע ניסוי כמובן זמן, לעצור כל נקודת זמן באופן עצמאי במרווחי זמן שונים כמפורט להלן.

הערה: שיטת phagocytosis המסונכרן היא קצת יותר מייגע מקודמתה, אבל מספקת מדד phagocytic גבוה יותר בזמן קצר יותר.

4. phagocytosis הפסקה

1. לתאים חסיד, להסיר את supernatant ולהוסיף 50 μl של כחול trypan מדולל עם PBS (דילול 1: 2), על מנת לכבות הקרינה של חיידקים-הפנים שאינם.
2. לתאים שאינם חסיד, ספין למטה הצלחת ולהסיר supernatant. הוסף 50 μl של trypan הכחול בדילול מלא. ודא צנטריפוגות הצלחת ב( 5-10 דקות ב 500 XG) בין כל שטיפה על מנת למזער את אובדן התא ומאפשר שטיפה נאותה.
3. לאחר הדגירה trypan, לשטוף תאים פעמיים עם PBS כדי להסיר כל trypan שייר (עד PBS הוסר מהבאר הופכת ברורה). Trypan הוכח כדי להרוות את הקרינה ^15,16 של, חלקיקי חיידקי חום נהרג הלא הפנימו שכותרתו fluorescently, אך לא לחיידקים חיים או חרוזים OPDex. לחיידקים חיים, כולל שטיפה עם אנטיביוטיקה כמו פניצילין, סטרפטומיצין, גנטמיצין או במקום לשטוף trypan כדי למנוע תופעות של בלבול של הקרינה מחלקיקים-הפנים שאינם.
4. תקן את התאים עם של paraformaldehyde 4% 100 μl, ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS (בכל טוב 100 μl לכל שטיפה). בשלב זה, לשמור את התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע, או להמשיך ישירות מכתים וכימות.
   הערה: כל השלבים הבאים מהווים הקדמת שלב זה יכול להיעשות מחוץ למכסת מנוע תרבית תאים.
5. הסר את כל הנוזל ולהוסיף 50 μl של DAPI ב -5 / מיליליטר ng מחדש בPBS. לאפשר 5 דקות לצביעה, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS. בעקבות הצעד לשטוף, להוסיף 50 μl של PBS על כל phagocytosis היטב והשיא.

5. אקטין מכתים

הערה: בנוסף לphagocytosis, שיטת fluorometric תאפשר כימות של פילמור אקטין על ידי מדידת עוצמת אקטין, אשר מצטמצם בעיכוב של lamellipodia, pseudopodiae, וקרום פורע כתוצאה מטיפול במעכבים (איור 1 א). זהו צעד אופציונאלי, אם עניין בכימות של פילמור אקטין בנוסף לphagocytosis. אם פילמור אקטין הוא המטרה הסופית, תוך שימוש בחלקיקי ניאון לphagocytosis הוא אופציונאלי.

1. בעקבות קיבעון paraformaldehyde (שלב 4.3), לשטוף את הצלחת פעמיים עם PBS לכל גם 100 μl לכל שטיפה. הוסף 50 μl של 0.1% Triton X-100 ב PBS עבור permeabilization ו דגירה -5 דקות ב RT.
2. לשטוף את פי 2 Triton X-100 0.1% עם PBS (כאמור לעיל), ולחסום עם 1% אלבומין בסרום שור (BSA) במשך 20 דקות כדי למנוע מחייב הלא ספציפית של label.
3. בעקבות חסימה, להסיר את פתרון BSA ולהוסיף phalloidin rhodamine מייד. כדי להכין את פתרון העבודה של כתם rhodamine, שימוש בפתרון methanoic (המסופק על ידי היצרן) 100 μl ב 5 מיליליטר של PBS (מספיק לצלחת אחת). מהפתרון עובד להוסיף 50 μl לכל גם דגירה של 20 דקות בטמפרטורת חדר.
   הערה: בעקבות צעדי הכביסה ומכתים DAPI כמו בשלב 4.4 תאים יהיו מוכנים לכימות.

6. כימות

1. כדי לכמת את phagocytosis באמצעות קורא צלחת ניאון ירוק הקרינה שיא, באמצעות מסנן עירור ב λ = 488 ננומטר ומסנן פליטה בקרינת λ = 518 ננומטר, וכחולה באמצעות מסנן עירור ב λ = 355 nm ומסנן פליטה בλ = 460 nm.
2. כדי לכמת את פילמור אקטין באמצעות קורא צלחת ניאון, הקרינה כחולה שיא באמצעות λ = 355 וλ = 460 nm שפעת (כאמור לעיל), ואדום ננומטרorescence באמצעות מסנן עירור ב λ = 584 nm וλ = 620 nm מסנן פליטה.
   הערה: Orbital או איתור מרכזי מקובלת להקלטה. סוגים מסוימים של תאים לאסוף יותר לקצה גם מהמרכז, שבו הקלטת מסלול מקרה יכולה להיות יתרון. בפרט, ממוצע של שלוש נקודות מסביב למסלול יכול לשמש גם כדי להשיג תוצאות מדויקות יותר.
3. מחלקים את RFU הכולל של הקרינה ירוקה או אדומה על ידי קריאת הקרינה כחולה (מDAPI), בהתאם לתווית החלקיק או phagocytic לעומת כימות אקטין (תרשים 1). בשל שונות צלחת לצלחת גבוהות, להשתמש במדדים יחסי (כגון ביחס לt = 0 שליטה), כדי להמחיש הטוב ביותר מגמות שנצפו וכדי להקל על ניתוח סטטיסטי אמין יותר.

תוצאות

שתי דרכים עיקריות לכימות phagocytosis ופילמור אקטין לאחר מכן באמצעות פרוטוקול זה היא להתבונן phagocytosis רציף או מסונכרן.

ניתוח מיקרוסקופי (איור 1) מדגים תמונות ניאון דומות למה שfluorometer הוא ההקלטה (ראה גם תרשים 1). באיור 1 הן הקרינה אדומה של אקטין, 268 הקרינה ירוקה של FITC תוויות HKOP E. coli, כתם DAPI גרעיני, ואת התמונה הממוזגת של כל שלושה 269 fluorophores יחד. תמו...

דיון

מגבלות עיקריות של טכניקת fluorometric הן שונות ניסיוני כמו גם אובדן תא הקשורים לכביסה ושימוש בתאים שאינם חסיד נרחבים.

שונות הוא ציינה בעיקר בשל השינוי בחלקיקי ניאון כמו המשקל וpipetting במהלך תקופת ההכנה של מניות הפתרון הוא לא דרך של שמירה על מספרים זהים של חלקיקים מניסוי לניסוי מדויק. כדי לטפל בבעיה של שונות בין ניסויים, יכולים לבוא לידי ביטוי נתונים במונחים יחסי, למשל כphagocytosis% או לקפל שינוי מהשליטה (שליטה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 μ m כדורי פלואו פלואורסצנטיים צהובים-ירוקים;	בדיקות מולקולריות	F8852	משלבות 50μ l עם 50μ l מגיב אופסוניזציה למשך 30 דקות ב-37oC לפני השימוש
חום הורג E. coli חלקיקים ביולוגיים פלואורסצאין מצומדים	בדיקות מולקולריות	E2861	מורכבות מחדש (5 מ"ג) ב-50 μ l של PBS ולשלב עם 50 μ l מגיב אופסוניזציה למשך 30 דקות ב-37 מעלות; C לפני השימוש
מגיב אופסוניזציה	בדיקות מולקולריות	E2870
רודמין פלואידין	בדיקות מולקולריות	R415
DAPI	סיגמא-אולדריץ'	D9542
טריפן כחול	Gibco	15250-061
הפריטים שלהלן זמינים במותגים רבים אך הפריטים בהם השתמשנו במחקר זה הם מהיצרנים הבאים:
מצע גדילה של תאי RPMI	Gibco		בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין; חם ב-37 מעלות; C לפני השימוש
קורא פלטות פלואורסצנטיות - Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldehyde (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	לדלל ל-4% לפני השימוש
צלחות 96 בארות	גריינר	655097	תחתית שקופה או שחורה או שקופה - לוחות שחורים
פיפטה רב ערוצית (8 - 12 ערוצים)
מאגרי ריאגנטים
1x צינורות מיקרופוגה PBS
(0.6 מ"ל)
קוניקלס (10 מ"ל)