אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי לגנוטיפ, צביעה והכנה של עכברים עובריים להדמיה של הקרנות אקסון נוציספטור היקפיות בבעל החיים כולו, כשיטה יעילה להערכת פנוטיפים של צמיחת אקסונים חושיים בפיתוח עכברים מהונדסים גנטית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
ההדמיה של תחזיות עצביות באורך מלא בעוברים היא חיונית כדי לזכות בהבנה של איך יונקים רשתות עצביות לפתח. כאן אנו מתארים שיטה לתייג באתר משנה של גנגליון שורש הגבי תחזיות האקסון (DRG) כדי להעריך את המאפיינים פנוטיפי שלהם באמצעות כמה שורות עכבר מניפולציות גנטית. נוירונים TrkA חיובי נוירונים קולטן אזעקה, שהוקדשו להעברת אותות כאב. אנו מנצלים קו עכבר TrkA taulacZ לתייג המסלולים של כל האקסונים ההיקפיים TrkA החיובי בעובר העכבר ללא פגע. בנוסף, אנו להתרבות קו TrkA taulacZ על רקע null Bax, אשר למעשה מבטל אפופטוזיס העצבי, על מנת להעריך את השאלות הקשורות לצמיחה באופן עצמאי מהשפעות אפשריות של מניפולציות גנטיות על הישרדות עצבית. בהמשך לכך, עכברים מהונדסים גנטי של עניין הם התרבו עם taul TrkAקו וnull acZ / Bax אז הם מוכנים למחקר באמצעות הטכניקות המתוארות במסמך זה. מצגת זו כוללת מידע מפורט על תוכניות רבייה עכבר, genotyping בזמן הנתיחה, הכנת רקמה, צביעה וסליקה, כדי לאפשר ויזואליזציה של מסלולי axonal באורך מלא בהכנה כל הר.
מבוא
הקמת רשתות עצביות מדויקות היא תהליך התפתחותי מורכב חיוני לפעולה התקינה של מערכת העצבים. הפרעה בתהליך זה מובילה לבעיות בתפקוד עצביים שהיה מעורב במחלות נוירולוגיות אנושיות 1-3. כדי לחקור את המנגנונים מולקולריים שבבסיס של צמיחת האקסון ועצבוב היעד ביונקים, שפיתחנו פרוטוקול לדמיין מסלולי axonal של TrkA להביע עצב סנסורי באמצעות שילוב של שני קווי עכבר מהונדסים גנטי.
TrkA הוא קולטן לגורם גדילה עצבית NGF ומהווה סמן תפקודי של עצב סנסורי nociceptive 4. TrkA מתבטא מאוד בתאי עצב nociceptive במהלך התפתחות מוקדמת ומתווך הישרדות NGF תלוי נוירון, צמיחת הא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל הנהלים עומדים במדריך NIH לשימוש וטיפול בחי מעבדה. פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי IACUC במכללה רפואית ווייל קורנל.
1. רקמות הכנה
- להרדים נקבות מתוזמן-הריון על ידי צוואר רחם עקירה 15. לנתח E16 עובריים - עוברי E18 מנקבות מתוזמן-הריון ועוברי מקום בנפרד בבארות של צלחת 6-גם, מלאות מלוח פוספט הקר שנאגרו (PBS).
- יש לשטוף את העוברים בקור PBS.
- הסר חלק קטן של הקרום....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
גנוטיפים של TrkA WT / taulacZ: Bax - / - וTrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - עוברים ניתן לקבוע באופן חד משמעי על ידי genotyping PCR הסטנדרטי (איור 1). מציגה צביעת X-gal מפורט סוכות axonal היקפיים תת עורי בעוברים מוכתמים קונבנציונלי (איורים 2, 3 א), ובכל רחבי העובר לאחר סליקת רקמה (3 ב איורים, 4).
יש לנו גידלנו TrkA .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההליך מכתים X-gal-שתואר לעיל של עכברי TrkA taulacZ עובריים מאפשר ההדמיה המהירה ומפורטת של תחזיות האקסון למרחקים ארוכים בעובר הקבוע בשלמותה. בגלל רקע null Bax עכברים אלה מאפשרים לחיטוט של איתות מנגנונים שעשויות לתרום לצמיחת שני האקסון והישרדות עצבית. הזדווגות עם עכברים מהונדסים או בנוקאאוט של עניין מאפשרת להערכה מקיפה של פנוטיפים axonal ויכול לשמש כמדריך שימושי לניסויים עתידיים לבחון איתות צמיחת האקסון באופן מפורט יותר. אתגר גדול עבור במחקר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
תודות
המחברים מבקשים להודות לד"ר לואיס Reichardt לעכברי TrkA taulacZ וד"ר אנט מרקוס לדיון והצעות תובנה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הפעלה מהקרן בורק כמו גם המענק וייטהול קרן מחקר 2010-08-61, מענק מחקר מכנפיים לקרן חיים (WFL-ארה"ב-028/14), להעניק ZB1-1102-1 מ כריסטופר ודנתי ריב קרן, ומענקים 1R01EY022409 ו3R01EY022409-01S1 מהעין הלאומית, לJZ. KJO הוא עמית גולדסמית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| תמיסת שטיפת רקמות A | Millipore | BG-6-B | |
| תמיסת שטיפת רקמות B | Millipore | BG-7-B | |
| תמיסת בסיס כתמי רקמות | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| בקבוקון זכוכית | Kimble Chase | 74500-20 | |
| חממה | Labline | דגם 120 | |
| סיכות חרקים | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| צלחת 6 בארות | ארה"ב Scientific | CC7672-7506 | |
| פריימרים | IDT | מותאמים אישית DNA פריימרים | |
| תערובת Takara dNTP | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR מכונת | Bio-Rad | DNA Dyad | |
| בנזיל אלכוהול | סיגמא-אולדריץ' | B-1042 | |
| בנזיל בנזואט | סיגמא-אולדריץ' | B-6630 | |
| מיקרוסקופ ניתוח | Leica | M205A | |
| מצלמה | Leica | DFC310FX | |
| טבעת אור | Leica | MEB110 | |
| פוטושופ | אדובי | פוטושופ 4.0 |
מקורות
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents wi....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
