פיתוח במבחנה מערכת מודל לחקר האינטראקציה של Equus Caballus IgE עם קולטן גבוה הזיקה שלה FcεRI

Sari Sabban; Hongtu Ye; Birgit Helm

doi:10.3791/52222

Method Article

פיתוח במבחנה מערכת מודל לחקר האינטראקציה של Equus Caballus IgE עם קולטן גבוה הזיקה שלה FcεRI

DOI:

10.3791/52222

⸱

November 1st, 2014

Sari Sabban¹ , Hongtu Ye² , Birgit Helm²

¹Biological Department, King Abdulaziz University, ²The Krebs Institute for Biomolecular Research, Department of Molecular Biology and Biotechnology, The University of Sheffield

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי מתאר את הפיתוח והיישומים של מערכת בדיקה מהונדסת גנטית המבוססת על טרנספקציה של תאי לוקמיה בזופילית של חולדות עם הגן FcεRIα של הסוסים. תאים שעברו טרנספטציה מבטאים קולטן פונקציונלי שבו ניתן להפעיל את שחרור המתווכים של התגובה האלרגית על ידי IgE ואנטיגן.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האינטראקציה של IgE עם קולטן ה-Fc בעל הזיקה הגבוהה שלו (FcεRI) ואחריו אתגר אנטיגני היא המסלול העיקרי בתגובות אלרגיות בתיווך IgE. כתוצאה מקשירת הזיקה הגבוהה בין IgE ל-FcεRI, יחד עם הייצור המתמשך של IgE על ידי תאי B, אלרגיות נמשכות בדרך כלל לאורך כל החיים, כאשר כרגע אין תרופה קבועה זמינה. סוסים, במיוחד סוסי מירוץ, שבדרך כלל מולדים, הם מין של יונקים המועדים מאוד להתפתחות תגובות רגישות יתר, שעלולות להשפיע באופן רציני על ביצועיהם. תגובות פיזיולוגיות לרגישות אלרגית בסוסים משקפות את זו שנצפתה בבני אדם ובכלבים. במאמר זה אנו מתארים את התפתחותה של מערכת בדיקה באתרה להערכה כמותית של שחרור מתווכים של התגובה האלרגית הנוגעת למערכת הסוסים. לשם כך, הגן המקודד לסוס FcεRIα הועבר והתבטא על פני השטח של תאי לוקמיה של חולדות (RBL-2H3.1). תוצר הגן של שרשרת α הסוסים הטרנספטנטית יצר קומפלקס קולטנים פונקציונלי עם שרשראות β ו-γ של חולדה אנדוגנית ¹. מערכת הבדיקה שהתקבלה אפשרה הערכה של כמות המתווך המופרש מתאי RBL-2H3.1 שעברו טרנספטציה של סוסים FcεRIα בעקבות רגישות עם IgE של סוסים ואתגר אנטיגני באמצעות שחרור β-hexosaminidase כקריאה ^{2, 3}. שחרור מתווך הגיע לשיא של 36.68% ±-4.88% ב-100 ננוגרם מ^"ל-1 של אנטיגן. בדיקה זו שונתה ממבחנים קודמים ששימשו לחקר תגובות אלרגיות של בני אדם וכלבים ^{4, 5}. הראינו גם שלסוג זה של מערכת בדיקה יש יישומים מרובים לפיתוח כלי אבחון והערכת בטיחות של אסטרטגיות התערבות טיפוליות פוטנציאליות במחלות אלרגיות ^{6, 2, 3}.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלרגיה ידועה כבר אלף שנים. טיפול באסתמה תואר בטקסט הרפואי המצרי העתיק המכונה פפירוס אברס (~ לפנה"ס 1550) ודן בתרופות צמחיות לטיפול בזה ^7.

אלרגיה היום מסווגת כתגובה רגישות יתר מהסוג I, שבו סוג T התא עוזר 2 (TH ₂₎ הזרוע של מערכת החיסון מנווטת את הייצור של נוגדני אימונוגלובולין E (IgE) בתגובה לאנטיגנים סביבתיים הנקראים אלרגנים. אלה הם חומרים מגוונים שאינטראקציה בדרך כלל עם תאים במערכת החיסונית ולהמריץ את הסינתזה והפרשה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל interleukin-4 וinterleukin-13 ^{8, 9} כאל חלקיקים בחלקיקי עשן סיגריות או דיזל אשר משפ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1) הכנה של קו נייד:

פיתוח קו תא RBL-2H3.1 להביע α FcεRI סוסים:
1. באמצעות שימוש בטכניקות תרבית רקמה בסיסיות לשורות תאי monolayer, transfect תאי RBL-2H3.1 הורים באמצעות פלסמיד pEE6, נושא את גן סוס FcεRIα (GenBank: Y18204.1) ^28. הוסף 2 מיקרוגרם μl ^-1 של פלסמיד דנ"א 0.8 מיליליטר של תאים בצפיפות של 1.2 x10 ⁷ מיליליטר תאים ^-1. Electroporate התאים ב 250 V 960 μF באמצעות electrocuvette 0.4 סנטימטר ואז דגירה מ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי RBL-2H3.1 הורים ואלה transfected עם גן קולט FcεRIα הסוסים היו רגישים ראשון עם העכבר IgE אנטי DNP-HSA וקראו תיגר עם אנטיגן DNP-HSA. עכבר IgE נקשר לקולטן החולדה אנדוגני בשני שורות התאים ובכך פועל כשליטה על מנת לבחון את כדאיות השחרור של שני שורות התאים לשחרר מתווכים (איור 1). זוהי בדיקה חשובה וצריכה להתבצע באופן שגרתי מאז על מעבר מורחב (> 10 שבועות) בתרבית תאים, תאי RBL-2H3.1 להיסחף לכיוון פנוטיפ שאינו מפריש ^27. התאים הוריים נתמכים שחרור מתווך שיא ש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסיכום תוצאות מחקר זה הראו שכאשר תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα סוסים הם רגישים עם IgE סוסים ולערער על ידי אנטיגן, הם נותנים שחרור מתווך שיא של 36.68% ± 4.88% מהסכום הכולל של מתווך בתוך תאים, בהשוואה לRBL-2H3.1 תאי הורים לא מביעים FcεRIα סוסים.

כך assay זה מספק כלי שימושי לחקירה ולימוד תגובות אלרגיות סוסים במבחנה. שלו מאפשר קביעת כמות המתווך שפורסם על ידי תאים של תא פיטום / שושלת זופילים ובכך ניתן לצפות לקיד.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים במאמר זה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר לינדה פרטרידג' על מתן ייעוץ ומתקני מעבדה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 מבטא סוסים Fcε RIα	-	-	מיוצר במעבדה
Equine IgE anti NIP-HSA	-	-	מיוצר במעבדה
96 Well Plate	Sigma		CLS3595-Multi
Channel Pipette	Anachem	-	-
Incubator	Galaxy R	-
-4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH הוצמד עם אלבומין בסרום אנושי כדי ליצור NIP-HSA במעבדה
דיניטרופניל מצומד לסרום אנושי אלבומין	סיגמא	A6661	בקיצור DNP-HSA
ספקטרופוטומטר צלחת	Anthos Labtec HT2	-
צינורות	Sigma	P1851-נתרן
כלורי	סיגמא	S7653-אשלגן
כלורי	סיגמא	P9333-מגנזיום
כלוריד	סיגמא	M2670-סידן
כלוריד	סיגמא	C1016-טריטון
x100	סיגמא
N-אצטיל-ובטא;-D-גלוקוזמיניד	סיגמא	N9376	תמיסת מלאי הנקראת &בטא;-הקסוזמינידאז היה 50 מ"מ שהוכן ב-DMSO
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא	D2650-חומצת
לימון	סיגמא
251275-נתרן אצטט	סיגמא	S7670-tris
	סיגמא	T5941	-

X100-4-ניטרופניל

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).
Sabban, S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

פיתוח במבחנה מערכת מודל לחקר האינטראקציה של Equus Caballus IgE עם קולטן גבוה הזיקה שלה FcεRI

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles