פיתוח במבחנה מערכת מודל לחקר האינטראקציה של Equus Caballus IgE עם קולטן גבוה הזיקה שלה FcεRI

Summary

המחקר הנוכחי מתאר את הפיתוח והיישומים של מערכת בדיקה מהונדסת גנטית המבוססת על טרנספקציה של תאי לוקמיה בזופילית של חולדות עם הגן FcεRIα של הסוסים. תאים שעברו טרנספטציה מבטאים קולטן פונקציונלי שבו ניתן להפעיל את שחרור המתווכים של התגובה האלרגית על ידי IgE ואנטיגן.

Abstract

האינטראקציה של IgE עם קולטן ה-Fc בעל הזיקה הגבוהה שלו (FcεRI) ואחריו אתגר אנטיגני היא המסלול העיקרי בתגובות אלרגיות בתיווך IgE. כתוצאה מקשירת הזיקה הגבוהה בין IgE ל-FcεRI, יחד עם הייצור המתמשך של IgE על ידי תאי B, אלרגיות נמשכות בדרך כלל לאורך כל החיים, כאשר כרגע אין תרופה קבועה זמינה. סוסים, במיוחד סוסי מירוץ, שבדרך כלל מולדים, הם מין של יונקים המועדים מאוד להתפתחות תגובות רגישות יתר, שעלולות להשפיע באופן רציני על ביצועיהם. תגובות פיזיולוגיות לרגישות אלרגית בסוסים משקפות את זו שנצפתה בבני אדם ובכלבים. במאמר זה אנו מתארים את התפתחותה של מערכת בדיקה באתרה להערכה כמותית של שחרור מתווכים של התגובה האלרגית הנוגעת למערכת הסוסים. לשם כך, הגן המקודד לסוס FcεRIα הועבר והתבטא על פני השטח של תאי לוקמיה של חולדות (RBL-2H3.1). תוצר הגן של שרשרת α הסוסים הטרנספטנטית יצר קומפלקס קולטנים פונקציונלי עם שרשראות β ו-γ של חולדה אנדוגנית ¹. מערכת הבדיקה שהתקבלה אפשרה הערכה של כמות המתווך המופרש מתאי RBL-2H3.1 שעברו טרנספטציה של סוסים FcεRIα בעקבות רגישות עם IgE של סוסים ואתגר אנטיגני באמצעות שחרור β-hexosaminidase כקריאה ^{2, 3}. שחרור מתווך הגיע לשיא של 36.68% ±-4.88% ב-100 ננוגרם מ^"ל-1 של אנטיגן. בדיקה זו שונתה ממבחנים קודמים ששימשו לחקר תגובות אלרגיות של בני אדם וכלבים ^{4, 5}. הראינו גם שלסוג זה של מערכת בדיקה יש יישומים מרובים לפיתוח כלי אבחון והערכת בטיחות של אסטרטגיות התערבות טיפוליות פוטנציאליות במחלות אלרגיות ^{6, 2, 3}.

Introduction

אלרגיה ידועה כבר אלף שנים. טיפול באסתמה תואר בטקסט הרפואי המצרי העתיק המכונה פפירוס אברס (~ לפנה"ס 1550) ודן בתרופות צמחיות לטיפול בזה ^7.

אלרגיה היום מסווגת כתגובה רגישות יתר מהסוג I, שבו סוג T התא עוזר 2 (TH ₂₎ הזרוע של מערכת החיסון מנווטת את הייצור של נוגדני אימונוגלובולין E (IgE) בתגובה לאנטיגנים סביבתיים הנקראים אלרגנים. אלה הם חומרים מגוונים שאינטראקציה בדרך כלל עם תאים במערכת החיסונית ולהמריץ את הסינתזה והפרשה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל interleukin-4 וinterleukin-13 ^{8, 9} כאל חלקיקים בחלקיקי עשן סיגריות או דיזל אשר משפרות סינתזת IgE ^10.

העלייה בגילויים אלרגיים במדינות מתועשות ב -50 השנים האחרונות, שיוחסה לשילוב של ההשפעהמזהמים סביבתיים ומגמה לסביבה יותר מחוטא, המשלבים להעביר את התגובה החיסונית כלפי פרופיל שלט על ידי TH ₂ ציטוקינים, כפי שהוצע על ידי "היגיינה השערה ^'11.

כפי שצוין לעיל, בני האדם אינם יונקים רק נגוע באלרגיה. יש לציין סוסים וכלבים גם יכולים לפתח תגובות אלרגיות קלאסיות ומחקר על ידי ¹² הראה כי, כמו אצל בני אדם, אלרגיה לסוסים מיוחסת לגורמים גנטיים וסביבתיים. כתוצאה מכך, בעלי החיים הללו מהווים מודל טוב ללימוד יחסי הגומלין בין גורמים הגנטיים וסביבתיים של אלרגיה, ההתקדמות שלה מרגישות למחלה, ואסטרטגיות התערבות אפשריות פעם אחת ביטויים קליניים שהגדרתם ב

בשנת 1887, Stömmer היה האדם הראשון שתאר את הדמיון בין האדם ואסטמה סוסי ^13, ההשפעה של היסטמין על מערכת לב וכלי דם הסוסים היאדומה מאוד לזו של בני אדם ^14. סוסים הם גם אבן הפינה של התעשייה מרוצי הסוסים, שהוא בשווי $ 72000000000 עם מחזור הימורים של 115 מליארד דולרים בשנה ^15.

רוב סוסי מרוץ העכשוויים הם צאצאים של המספר הקטן של סוסים ערביים הגזעיים על ידי ליידי אן בלאנט מהשינה 1878 ואילך. סוסי מרוץ מודרניים בדרך כלל ממולדים כדי לבחור ליכולות ביצועים. הם נוטים להפרעות גנטיות, שאחד מהם היא הרגישות שלהם להר תגובות אלרגיות. יש להם גם 1000 פעמים רמות גבוהות יותר IgE בסרום יותר אפילו בני האדם ¹⁶ ביותר אלרגי קשה. תגובות אלרגיות סוסים בדרך כלל באות לידי ביטוי כרגישות יתר עקיצת חרק (IBH) ^{17, 18.} תוצאות IBH בדלקת עור כתוצאה מעקיצות חרקים מהוות בסוג Culicoides. צורה נוספת של מחלה אלרגית סוסים היא חסימות בדרכי נשימה חוזרות ונשנות (Rao), זה באו לידי ביטוי בבריאות ובדרכי הנשימה. הוא מאופיין על ידי צפצופים ומעבדהנשימה כבדה. לשכה לביקורת מתרחשת בדרך כלל בתגובה לעצב נבגים, ורמות IgE לאלרגן ספציפי גבוהות נרשמו בסוסים שסבלו מלשכה לביקורת במחקר אחד ¹⁹ למרות שחקירה עוד לא אישרה ²⁰ זה.

מחקרים על אלרגיה לסוסים סובבים סביב הניסיון בניטור ונטרול IgE סוסים על ידי פיתוח נוגדנים נגד סוסים IgE חד שבטיים (מבז) ^{21, 22.} יתר על כן המחקר של ²³ דן בייצור של תחומים תאיים של α של גבוהה-זיקת קולט Fc הסוסים קולט שרשרת (FcεRIα) בניסיון לזהות ולכמת בסרום סוסי IgE. במחקר נלווה על ידי ²⁴ Ledin דן בגישה חדשה שמטרתה לנטרל IgE בסרום על ידי תחול במערכת החיסון בimmunogen עצמי שאינם עצמי /. כל המחקרים הללו, עם זאת, היו חסרים assay יעיל על מנת לבחון את הבטיחות ויעילות של הפרוטוקולים שלהם. במאמר זה, אנחנו עכשיו נציג נתונים כאלה sys assayTEM החלים על המחקר של אסטרטגיות אבחון וטיפול רלוונטיות למערכת הסוסים, שבו שחרור β-hexosaminidase, כמדד לdegranulation מתווך תא, הוערך על תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα סוסים. פרוטוקול זה מבוסס על פרסומים קודמים ^{25, 4, 5, 2, 3} המתארים את ההנדסה של תאי RBL transfected עם הגן המקודד את תחום מחייב IgE של קולט גבוה הזיקה לIgE ממינים שונים. הפרוטוקול מסביר כיצד לבצע assay שחרור β-hexosaminidase, שתוצאותיה מוצגות כממוצע ± סטיית תקן של ניסויים בשלושה עותקים.

Assay השחרור היה ראשון שפותח על ידי Siraganian והוק ²⁵ ללמוד אלרגיה אנושית. קבוצת המעבדה בראשותו של ד"ר ראובן Siraganian גם פיתחה את קו תא RBL. תאי RBL אלו פותחו להביע FcεRIα האדם והפרוטוקול פורסם על ידי ^4. החלק האחרוןשל assay הגיע עם הפיתוח של פלסמיד PSV בנייר על ידי נויברגר ²⁶ אשר תאר את הייצור של נוגדני IgE על ידי שיבוט גן השרשרת הכבד שלו במורד הזרם של גן עכברי לאזור משתנה IgE שמכוון את hapten 4-הידרוקסי-3 -nitro-phenacetyl (NP), הנוגדן כימרי וכתוצאה מכך היה פונקציונלי מלא. היכולת לפתח כל IgE מיקוד אותו hapten, גם בעת שיבוט לקולטן שלו על פני השטח של תאי RBL הביאו סטנדרטיזציה של assay שהופך אותו פרוטוקול שימושי כדי למדוד את degranulation של תאי זופילים.

Assay עושה יש יתרונות וחסרונות. היתרונות של assay הוא ההסתגלות שלה לשימוש בכל מערכת יונקים, המעבדה שלנו ובכך השתמשה בו כדי לבדוק את degranulation במערכות אנושיות, כלבים וסוסים, וזה הוא בר השגה רק על ידי סינתזת IgE של האורגניזם ושיבוט לקולטן שלו על פני השטח של תאי RBL.

מצד השני,החסרונות של assay הוא שתאי RBL רגישים מאוד לשינויים תרמיים, מכאניים וPH, מה שהופך אותם לתת וריאציה של רמות degranulation בתוך אותו assay. הוא כך מומלץ בחום שהמבחנים תמיד חוזרים על עצמם בtriplicates ולאחר מכן ממוצע שנלקח מהם. יתר על כן, תאי RBL נוטים להעביר לפנוטיפ שאינו משחרר אם הם נשארים בתרבית רקמה לזמנים ממושכים (> 10 שבועות) ^27, מה שהופך את התחזוקה שלהם מסורבלת. הם גם נוטים לזיהומים על ידי חיידקי mycoplasma, שאינם גלויים לעין מיקרוסקופ אור ולא לשנות את המורפולוגיה של התא, אך בצורה קיצונית ישנו את רמות degranulation. כך בדיקות mycoplasma רגילות יש צורך.

Protocol

1) הכנה של קו נייד:

1. פיתוח קו תא RBL-2H3.1 להביע α FcεRI סוסים:
   1. באמצעות שימוש בטכניקות תרבית רקמה בסיסיות לשורות תאי monolayer, transfect תאי RBL-2H3.1 הורים באמצעות פלסמיד pEE6, נושא את גן סוס FcεRIα (GenBank: Y18204.1) ^28. הוסף 2 מיקרוגרם μl ^-1 של פלסמיד דנ"א 0.8 מיליליטר של תאים בצפיפות של 1.2 x10 ⁷ מיליליטר תאים ^-1. Electroporate התאים ב 250 V 960 μF באמצעות electrocuvette 0.4 סנטימטר ואז דגירה מייד על קרח למשך 10 דקות.
   2. בחר את התאים שהשתנו באמצעות מדיה המכילה 0.4 גרם של סולפט G418 geneticin, אז למיין תאי חיים שנותרו באמצעות FACS על ידי תיוגם עם נוגדני IgE ניאון. השתמש בRBL-2H3.1 וכתוצאה מכך להביע את שורת תאי FcεRIα סוסים לחקירה ^{2, 3.}
2. רגישות נוגדן פרה-assay:
   1. -1 מיליליטר 5x10 ⁵ תא.
   2. הוסף את IgE המעניינים את התאים מושעים לריכוז סופי של 1 מיליליטר ^-1 ng, אז צלחת של תאים 100 μl לצלחת גם 96 בטורים 1-6 ו לדגור על 37 ° C + 5% CO ₂ + 90% לחות היחסית במשך 16 שעות. לאחר זמן הדגירה, ולפני ביצוע assay השחרור, לבדוק את הבארות תחת מיקרוסקופ לconfluency היטב ודבקות תא.

2) השחרור Assay:

1. שטיפת התאים:
   1. חיץ שחרור חם (25 צינורות מ"מ, 120 נתרן כלורי מ"מ, 5 מ"מ כלוריד האשלגן, 0.04 מגנזיום כלוריד מ"מ, וסידן כלורי 1 מ"מ) בשעה 37 ° C כדי לאפשר לשטיפת תאים עדינה.
   2. שטוף תאים על ידי מצליף את הצלחת להסיר תקשורת סלולארי והוספת 100 μl חם, 37 מעלות צלזיוס, חיץ שחרור. חזור פעמיים.
2. אתגר אנטיגן:
   1. הכן דילול סדרתי של אנטיגן (ניפ-HSA או DNP-HSA) של 0 מיליליטר ng ^-1, 0.1 מיליליטר ng ml ^-1, 1 ננוגרם ^-1, 10 מיליליטר ng ^-1, 100 מיליליטר ng ^-1, 1,000 מיליליטר ng ^-1, 10,000 מיליליטר ng ^-1 במאגר שחרור וחם על 37 מעלות צלזיוס.
   2. לאחר לשטוף התא השני, לבטל את התקשורת והוחלף בפתרוני אנטיגן 100 μl. ודא שיש לי בארות באותה השורה (A1-6 לדוגמא) את אותו ריכוז אנטיגן הוסיף להם.
   3. הגדר את בקרה שלילית בשורה על ידי הוספת 0 אנטיגן ^-1 מיליליטר ng. להוסיף ריכוז אנטיגן הגדלת את השורות (BG) ואחריו חיץ Triton-X (5% Triton X-100) בתאי H שורה לlyse התאים לשמש כביקורת חיובית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, כדי לאפשר לתאים לשחרר מתווכים שלה.
3. הגדרת בקרות ופרט:
   1. לאחר הדגירה, להעביר 50 μl של supernatant תא למחצית השנייה של הצלחת (בארות A1-6 לבארות A7-12, וכו '). מחק את 50 μl הנותר של supernatant ולהחליף עם 50 μl של חיץ Triton-X כדי לאפשר המדידה של כמות מתווכים שפורסמו בכל טוב בטורים 7-12 כאחוז מהמתווכים הכולל בתוך התאים בעמודה 1-6 .
4. סובסטרט:
5. הוסף 50 μl של מצע β-hexosaminidase (50 4 nitrophenyl-N-אצטיל-β-D-glucosaminide הערוך DMSO המדולל עד 2 מ"מ-ידי הוספתו למאגר ציטראט 0.2 M חומצת לימון ו -0.2 M נתרן אצטט, pH מ"מ 4.5) לכל הבארות לאפשרה ההמרה של המצע עד 4 nitrophenol-ידי אנזים β-hexosaminidase. דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.

5. הפסקת התגובה:
   1. לעצור את התגובה על ידי חיץ הוספת 150 μl טריס (1 M טריס- HCl, pH 9) לכל אחד גם pH הגבוה של החיץ מפסיק את התגובה והופך את 4 nitrophenol-לצבע צהוב.
6. קריאה וניתוח התוצאות:
   1. קראו את הצלחת באמצעות ספקטרופוטומטר צלחת ב 405 ננומטר כדי למדוד את הספיגה של הצבע הצהוב. מחושב אחוז β-hexosaminidase שוחרר תוך שימוש בנוסחא הבאה:

2. ליישם את הנוסחה הזאת היטב כל אחד, לאחר שממוצע נלקח לכל שורה. A1 ו- A7 מייצגים את המיקום של הבארות בצלחת גם 96. לשרטט גרף של אחוז שחרור β-hexosaminidase (מתאים לסך שחרור מתווך) אגאיאנטיגן NST ריכוז ^{2, 3.}

Results

תאי RBL-2H3.1 הורים ואלה transfected עם גן קולט FcεRIα הסוסים היו רגישים ראשון עם העכבר IgE אנטי DNP-HSA וקראו תיגר עם אנטיגן DNP-HSA. עכבר IgE נקשר לקולטן החולדה אנדוגני בשני שורות התאים ובכך פועל כשליטה על מנת לבחון את כדאיות השחרור של שני שורות התאים לשחרר מתווכים (איור 1). זוהי בדיקה חשובה וצריכה להתבצע באופן שגרתי מאז על מעבר מורחב (> 10 שבועות) בתרבית תאים, תאי RBL-2H3.1 להיסחף לכיוון פנוטיפ שאינו מפריש ^27. התאים הוריים נתמכים שחרור מתווך שיא ש...

Discussion

לסיכום תוצאות מחקר זה הראו שכאשר תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα סוסים הם רגישים עם IgE סוסים ולערער על ידי אנטיגן, הם נותנים שחרור מתווך שיא של 36.68% ± 4.88% מהסכום הכולל של מתווך בתוך תאים, בהשוואה לRBL-2H3.1 תאי הורים לא מביעים FcεRIα סוסים.

כך assay זה מספק כלי שימושי לחקירה ולימוד תגובות אלרגיות סוסים במבחנה. שלו מאפשר קביעת כמות המתווך שפורסם על ידי תאים של תא פיטום / שושלת זופילים ובכך ניתן לצפות לקיד...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 מבטא סוסים Fcε RIα	-	-	מיוצר במעבדה
Equine IgE anti NIP-HSA	-	-	מיוצר במעבדה
96 Well Plate	Sigma		CLS3595-Multi
Channel Pipette	Anachem	-	-
Incubator	Galaxy R	-
-4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH הוצמד עם אלבומין בסרום אנושי כדי ליצור NIP-HSA במעבדה
דיניטרופניל מצומד לסרום אנושי אלבומין	סיגמא	A6661	בקיצור DNP-HSA
ספקטרופוטומטר צלחת	Anthos Labtec HT2	-
צינורות	Sigma	P1851-נתרן
כלורי	סיגמא	S7653-אשלגן
כלורי	סיגמא	P9333-מגנזיום
כלוריד	סיגמא	M2670-סידן
כלוריד	סיגמא	C1016-טריטון
x100	סיגמא
N-אצטיל-ובטא;-D-גלוקוזמיניד	סיגמא	N9376	תמיסת מלאי הנקראת &בטא;-הקסוזמינידאז היה 50 מ"מ שהוכן ב-DMSO
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא	D2650-חומצת
לימון	סיגמא
251275-נתרן אצטט	סיגמא	S7670-tris
	סיגמא	T5941	-