תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי Electroporation

סיכום

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי. אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תקציר

תאי שיער שמיעתיים הממוקמים בתוך איבר העכבר של קורטי מזהים ומעבירים מידע קולי למערכת העצבים המרכזית. תאי השיער המכנו-סנסוריים מיושרים בשורה אחת של תאי שיער פנימיים ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים המשתרעים לאורך הציר הבסיסי עד האפיקלי של השבלול. טכניקת תרבית האקספלנט המתוארת כאן מספקת שיטה יעילה לבידוד ותחזוקה של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של העכבר העוברי. כמו כן, המורפולוגיה והמאפיינים המולקולריים של תאי שיער חושיים ותאים תומכים לא חושיים בתוך תרביות צמח השבלול דומים לאלה שנצפו in vivo וניתן לחקור אותם בסביבה התאית הפנימית שלהם. צמחי השבלול יכולים לשמש ככלי ניסיוני חשוב לזיהוי ואפיון של מסלולים מולקולריים וגנטיים המעורבים באפיון ובדפוס התאים. למרות שמודלים של עכברים טרנסגניים מספקים גישה יעילה למחקרי ביטוי גנים, מספר ניכר של מוטציות עכברים מתים במהלך ההתפתחות העוברית ובכך מעכבים את הניתוח והפרשנות של פנוטיפים התפתחותיים. ניתן לתרבת את איבר קורטי מעכברים מוטנטיים שמתים לפני הלידה כך שניתן יהיה לנתח את התפתחותם במבחנה ואת תגובותיהם לגורמים שונים. בנוסף, אנו מתארים טכניקה לאלקטרופורציה של צמחי שבלול עובריים ex vivo שניתן להשתמש בהם כדי להפחית או לבטא יתר על המידה גנים ספציפיים ולנתח את התפקוד האנדוגני הפוטנציאלי שלהם ולבדוק אם תוצר גן ספציפי נחוץ או מספיק בהקשר נתון כדי להשפיע על התפתחות השבלול של יונקים^1-8.

מבוא

איבר היונקים של קורטי מורכב מפסיפס של סוגי תאים מיוחדים, כולל שני סוגים של תאי שיער מכניים-חושיים וכן לפחות ארבעה סוגים של תאים תומכים לא חושיים, מה שהופך אותו למערכת מודל אידיאלית לחקר תהליכים תאיים נורמליים כמו התפשטות, מפרט גורל, התמיינות ודפוס. בנוסף, התפתחות תקינה של סוגי תאים שונים אלה חיונית לתפקוד שמיעה תקין. לפיכך, חיוני להבין את הגורמים, הן המולקולריים והן התאיים, המווסתים את התפתחותם. עם זאת, גודלו הקטן של שבלול העכבר כמו גם חוסר הנגישות שלו מהווים אתגר מיוחד למחקרי ביטוי גנים. יתר על כן, רוב אירועי המפרט והדפוס של גורל התא מתרחשים בתקופות זמן עובריות ומסתיימים לרוב לפני הלידה. לכן, זיהוי ואפיון של אירועי איתות במהלך תקופות זמן עובריות חיוני כדי לקבל תובנה לגבי הבסיס המולקולרי של מורפוגנזה של השבלול.

כאן, אנו מדגימים שיטה לתרבית שבלול שלם במבחנה מאוזניים פנימיות של עכברים עובריים. הרציונל מאחורי השימוש בטכניקה זו הוא ששבלול מתורבת שומר על המאפיינים המולקולריים והמורפולוגיים שלו ובכך מספק מודל רב ערך לחקירת גנים מועמדים פוטנציאליים ולחקר המנגנונים המעורבים במורפוגנזה של השבלול. למרות שעכברים טרנסגניים יכולים לשמש למחקרי ביטוי גנים, לעתים קרובות יש צורך במערכת חוץ גופית לניטור תפקודי גנים ספציפיים. יתר על כן, ניתן להקים תרביות שבלול מעוברי עכברים טרנסגניים כך שניתן יהיה לחקור את התפתחותם במבחנה ותגובתם לגורמים מסיסים ואנטגוניסטים שונים. למרות שעוברים ביום 13 (E13) משמשים בפרוטוקול זה, תרביות מ-E12 או E14 לאוזניים הפנימיות המוקדמות לאחר הלידה יכולות לתת תוצאות דומות.

אנו מציגים גם טכניקת העברת גנים בצמחי שבלול עובריים מתורבתים באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. לאחר הבידוד של צמחי השבלול, ניתן להשתמש באלקטרופורציה כדי לבטא פלסמידים של DNA של גנים מעניינים בתאים בודדים בתוך צינור השבלול. טכניקה זו משמשת כגישה משלימה למחקרים המשתמשים בעכברים טרנסגניים כדי לקבל תובנה לגבי המסלולים המולקולריים העומדים בבסיס הפנוטיפ התאי. באמצעות שיטה זו של העברת גנים, מגוון סוגי תאי אפיתל בתוך השבלול העוברי עוברים טרנספטציה, ובכך מאפשרים ניתוחי אובדן ורווח תפקוד ברמת התא הבודד. בנוסף, ניתן לבצע מחקרים אלקטרופיזיולוגיים גם בתרביות שבלול⁸. שיטה זו של אלקטרופורציה במבחנה היא פשוטה ופשוטה יחסית, בשילוב עם נזק מינימלי לרקמה, הביאה להתרחבות מהירה של טכניקה זו.

פרוטוקול

הערה: כל הפרוטוקולים באמצעות בעלי חיים חייבת להיות נבדקו ואושרה על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) וחייבת לעקוב אושרה שיטות לטיפול ולשימוש בחיות המעבדה באופן רשמי. כל הניתוחים צריכים להתבצע באמצעות טכניקה סטרילית על ספסל זרימה למינרית נקי. כפפות ומסיכה, אם תרצה בכך, יש ללבוש במהלך הליך זה.

1. Dissection של האוזן הפנימית עכבר עוברי

1. הגדרה לצורך האיבר של קורטי תרבויות explant:
   1. לעקר את מכסה המנוע תרבית רקמת הזרימה למינרית ידי הפעלת אור UV למשך כ 30 דקות ולחטא את המשטח עם אתנול 70% לפני השימוש. בנוסף, לעקר את כל מכשירי הנתיחה כולל כלים לנתיחה משובחים ומנות מצופות Sylgard לנתיחה עובר באמצעות החיטוי או על ידי השרייה באתנול 70% לפחות 20 דקות לפני השימוש. יוצקים את אתנול 70% ולאפשר את הכלים ומכשירים לייבוש באוויר בזרימה למינרית קליאה נקייהספסל n לפני השימוש.
   2. הכן תמיסת מלח מאוזנת של האנק סטרילית (HBSS) / (4 (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic) תערובת (HEPES) על ידי הוספת 10% מ10x HBSS ו 0.5% HEPES ולהתאים את ה- pH של כ 7.2 ומסנן לעקר פתרון סופי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לבצע את כל הניתוחים בפתרון HBSS / HEPES מקורר לשמר את הרקמה טובה יותר לאורך כל ההליך.
   3. כלים מזכוכית מעיל תחתון עם מטריצת קרום במרתף על ידי הוספת 5 מיליליטר של הנשר בינוני השתנה הקר (4 ° C) סטרילי של Dulbecco (DMEM) לaliquot 300 μl של מטריצת קרום במרתף בצינור פוליפרופילן סטרילי 15 מיליליטר. מערבבים על ידי vortexing את התוכן ולהוסיף 150 μl של תערובת המטריצה-DMEM קרום במרתף למרכז של כל מנה תרבות, כך שהוא מכסה את כל התרבות גם בהווה במרכז הצלחת. לכסות את הכלים וחנות בחממה 37 ° C לפחות 45 דקות לפני השימוש.
   4. יוצקים 4-5 מיליליטר מקורר HBSS לתוך הרי צלחות פטרי קלקר סטרילי ולהשאיר סגורים במכסת המנוע.
   5. להכין מדיום תרבות בצינור 15 מיליליטר פוליפרופילן סטרילי על ידי הוספת 9 מיליליטר של DMEM, תוספי N2 100 μl, 10 גר '/ מיליליטר Cipro ו 1 מיליליטר של FBS.
2. בידוד של עוברים:
   הערה: בהליך זה לculturing explants שבלול מעוברי עכברים, אוזניים פנימיות אסיף מיום עוברי (E) 13 עצמות זמניות עם היום לאחר הפריה נשקלות ^כ9 E1. גם הפרוטוקול ניתן להשתמש עם אוזניים פנימיות עכבר עוברי החל מE12 לE18.
   1. להרדים עכבר מתוזמן בהריון עם CO ₂ ולהקריב את בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם או פרוטוקולים שאושרו מתאימים. לבצע euthanization ממכסת מנוע בתרבית הרקמה למינרית זרימה כדי לשמור על סטריליות בחדר תרבית הרקמה.
   2. הנח עכבר מורדמים על מגבת נייר עם בטן כלפי מעלה ולחטא בטן עם אתנול 70%.
   3. פתח את חלל הבטן על ידי גרירה עורעם מלקחיים מעוקלים ביד אחת ועור חתוך ושרירים לאורך קו האמצע עם מספריים באמצעות יד אחרת. שני חתכים בניצב משני הצדדים ולשלוף את הרחם בקפידה על ידי הרמת קרן רחם דו-צדדית עם מלקחיים ולנתק אותו ממתחת מספריים רקמות באמצעות חיבור.
   4. מניחים את השרשרת העוברית בצלחת פטרי המכילה פתרון מקורר דיסקציה (תערובת HBSS / HEPES) והעברה לספסל הנקי מינרית הזרימה.
   5. הסר עוברים בזהירות מהשליה ולהכניס אותם לתוך אחת מנות סטרילי פטרי המכילות פתרון לנתיחה. אם הפתרון הופך עקוב מדם, להעביר אותם לצלחת פטרי חדשה.
      הערה: בשלב זה, יכול להיות מבוים עובר באמצעות מדריך היערכות Theiler.
   6. לערוף עוברים על ידי צביטה באזור הצוואר עם זוג מלקחיים או מספריים נקיים ומניח את הראשים בצלחת פטרי המכילה טרי פתרון לנתיחה מקורר.
3. Dissection של האוזניים הפנימיות:
   1. o מקוםראש עובר ne בצלחת sylgard סטרילית המכילה לנתח קר
   2. פתרון. עבודה תחת מיקרוסקופ לנתח בהגדלה של ~ 1.6x, לשתק את ראש העובר על ידי הצבת סיכות Minutien מסביב או קרוב יותר לאזור עיניים (איור 1 א).
   3. באמצעות שני זוגות מלקחיים סטרילי להסיר בזהירות את העור ולפתוח את הגולגולת בצד הגב לאורך קו האמצע (איור 1). הסר מוח מחלל גולגולת ואוזניים פנימיות הנמצאות בתוך עצמות זמניות ניתן לזהות בשלב זה (איור 1 ג, ד). הציפוי הפנימי של כלי הדם, שהיא בדרך כלל נוכחים סביב האוזניים הפנימיות, יכול לשמש כנקודת ציון לזיהוי האוזן הפנימית בשלב זה (1D איור).
   4. לנתח את האוזן הפנימית מהעצמות הזמניות על ידי הצבת המלקחיים מתחת לרקמה ובידוד האוזן הפנימית מבסיס הגולגולת וההעברה לצלחת חדשה המכילה פתרון לנתח קר (איור 1E, F).

2. דור של איברים של תרבויות קורטי explant

הערה: בשלב זה של התפתחות, רקמת סחוס היא ויכולה להיות גזור בקלות באמצעות מלקחיים.

1. אוריינט האוזן הפנימית, כך שהצד הגחוני פונה כלפי מעלה (איור 2 א) ולייצב את האוזן הפנימית על ידי בעדינות להכניס את הקצה החד של סיכות Minutien דרך חלק שיווי המשקל באוזן הפנימית (איור 2).
2. מלקחיים ultrafine באמצעות לחתוך את הסחוס שמעליה על ידי ביצוע חתך באמצעות קצה אחד של מלקחיים ליד החלון הסגלגל ובזהירות להסיר את הסחוס משבלול האוזן (איור 2 ג).
   הערה: חשוב לוודא כי מלקחיים אינם מוכנסים עמוק מדי לתוך הסחוס כסחוס שמעליה לעתים התמזגו עם צינור השבלול ובמקרה זה הוא מועיל להשתמש במלקחיים סגורים לשחרר סחוס מצינור השבלול הבסיסי על ידי גירוד מתחת ל surface של הסחוס. בשלב זה של התפתחות, ספירלת השבלול היא רק שלושה רבעים מתור באורך.
3. בשלב הבא, לחשוף את האפיתל החושית על ידי הצבת המלקחיים באזור המועדף של צינור השבלול, או הבסיס או לכל הקודקוד, ומשייכתו בעדינות את הגג של השבלול (איור 2 ד).
   הערה: הגג של השבלול יש להסיר לחלוטין כפי שהוא יכול להסוות את האפיתל החושית פוגע הניתוח.
   הערה: הליך זה חייב להיעשות בעדינות כפי שהוא קל לקרוע את האפיתל החושית.
4. כצעד אחרון, להסיר בזהירות את רקמת חיבור הבסיסית מהאפיתל החושית החשופה, כך שהבסיס של explant השבלול הוא אחיד שטוח.
5. לבודד את השבלול גזור מחלק שיווי המשקל באוזן הפנימית באמצעות מלקחיים. זה יכול להתבצע לפני או אחרי 2.4 (2E איור) הצעד.
6. העבר את האפיתל החושית השבלול גזור לתוך membra מרתףהתרבות גם באמצעות scooper סטרילי 1.5 מ"מ (איור 2F) מצופה מטריצת ne.
7. אוריינט explant השבלול עם משטח lumenal של האפיתל פונה כלפי מעלה ולשאוב את פתרון המטריצה-DMEM קרום במרתף לשטח בזהירות את הרקמה ולהחליף אותו עם 150 μl של מדיום תרבות הטרי בעדינות על ידי הוספה לצלחת. יש להקפיד לוודא שכל explant שומר היטב לcoverslip הזכוכית המצופה ולא צף במדיום התרבות. ודא שקצה המלקחיים הוא הצביע למעלה בזמן ההדבקה ולזכוכית כדי למנוע נזק לexplant השבלול.
8. בעדינות להעביר את המנה התרבות לתוך צלחת סטרילית 150 מ"מ תרבות ומקום בתרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ לתקופה רצויה של זמן, בדרך כלל 3-6 ימים במבחנה (DIV). לאחר DIV 1, לבחון תרבויות תחת מיקרוסקופ לנתח לוודא כי explant השבלול דבק גם למנת התרבות.
9. לאחר בcubation במבחנה לאורכים רצויים של זמן, תרבויות מעובדות אימונוהיסטוכימיה.
   הערה: תרבויות explant בדרך כלל טופחו במשך 6 DIV שהוא שווה ערך לשלב ההתפתחותי, P0. לאחר הדגירה במבחנה, יכולות להיות מעובד תרבויות עבור יישומים נוספים במורד הזרם כמו אימונוהיסטוכימיה (איור 3), RT-PCR, הכלאה באתר, ו / או כתם מערבי.

3. העברת גנים בתיווך Electroporation

1. הגדרה לצורך electroporation:
   1. לעקר אחד 100 מ"מ צלחת זכוכית sylgard מצופה על ידי מעוקר או טבילה באתנול 70% לכ -20 דקות ולאפשר לאוויר יבש בספסל נקי לפני השימוש.
   2. הכן את ה- DNA מוקטור ביטוי של בחירה באמצעות ערכות maxi- או midi-הכנה מתאימות. וקטורי הביטוי בשימוש בפרוטוקול זה הם pIRES2-Atoh1.EGFP וpCLIG-NeuroD1.EGFP. הריכוז הסופי של ה- DNA צריך להיות מיקרוגרם / μl לפחות 1 בDNA סטרילי /-RNAse חופשית מים.
2. Electroporating DNA לתוך explants שבלול עוברי:
   1. הוסף 10 μl של פתרון ה- DNA פלסמיד לצלחת Sylgard מצופה 100 מ"מ טרי ולהעביר explant גזור באופן מלא שבלול (המתקבל משלב 2.5) לפתרון ה- DNA.
   2. עם משטח lumenal של האפיתל פונה כלפי מעלה, להטות את השבלול מעט כל כך שזה ניצב למישור של המנה.
   3. מניחים את משוטי אלקטרודה משני הצדדים של השבלול עם ההנעה שלילית (קתודה) לקראת האפיתל החושית וההנעה החיובית (אנודה) הממוקמת בסמוך לבסיס של השבלול.
      הערה: מאחר שה- DNA טעון שלילי, זה נודד משלילי להאלקטרודה חיובית ועל ידי הצבת סוף הקתודה של החללית בסמוך להאפיתל החושית; DNA בעיקר ילך דרך פני השטח של האפיתל החושי.
   4. באמצעות electroporator, לספק 9 עד 10 פולסים של 24 mV, 30 משך דופק msec עם בורר דוושת רגל על ​​tהוא electroporator, ולאחר מכן להוסיף של מדיום תרבות החם 100 μl לשבלול Electroporated.
   5. חזור על שלבים 3.2.1-4 לכל explants השבלול ולDNA של כל הגנים של עניין ולהעביר את cochleae electroporated לתוך הצלחת מצופה מטריצת קרום במרתף לציפוי (שלב 2.7). כל cochleae תרבות electroporated ב-37 מעלות צלזיוס, 5% ₂ חממה humidified CO לאורכים רצויים של זמן שלאחר מכן ניתן יהיה מעובד לimmunocytochemistry.
      הערה: השבלול מהמלטה שלמה של CD1 עכבר (כ 8-12 גורים) יכולה להיות מבודד, microdissected, electroporated ומצופית ב< 4 שעות.

4. ניתוח של תרבויות השבלול explant

הערה: התרבויות בדרך כלל טופחו במשך 6 DIV שהוא שווה ערך לשלב ההתפתחותי, P0. לאחר הדגירה במבחנה, התרבויות הם קבועים ומעובדים עבור immunocytochemistry.

1. לאחר אורך רצוי של incubation, להסיר בינוני תרבות ובמהירות לשטוף את explant השבלול שבנאגר מלוח פוספט (PBS) דגירה בparaformaldehyde 4% (מוכן בPBS) במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
2. לשטוף את מקבע על ידי PBS הוספה ולשטוף בPBS שלוש פעמים במשך 15 דקות.
3. Permeabilize באמצעות PBS-T (Tween + 0.5% PBS) למשך 30 דקות לפני החסימה עם PBS-T המכיל סרום עיזים 10%.
4. דגירה בפתרון נוגדן ראשוני המכילה נוגדן ראשוני בPBS-T עם 1% עזים בסרום הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
5. שטוף את השבלול שלוש פעמים בטמפרטורת חדר באמצעות PBS-T 15 דקות כל אחד לפני שמוסיף את נוגדנים משני Alexa מצומדות- מתאימים.
6. מאז explant השבלול הוא בתרבית על coverslip זכוכית יכול להיות מטופלים בנפרד על ידי בידוד coverslip מצלחת והרכבה בשקופית. זו יכולה להיות מושגת על ידי השרייה המנה התרבות בOS30 ממס במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר. באמצעות סכין גילוח סטרילי, לנתק את coverslip מדאיש והר בשקופית ולדמיין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

אנו מתארים שיטה לבודד שבלול מהאוזניים הפנימיות העובריות ולנתח מיקרו כדי לחשוף את האפיתל החושי. לאחר הניתוח, הוא עשוי להיות מצופה ומתורבת כצינור שבלול שלם (איור 3) ולנתח אותו על ידי אימונוהיסטוכימיה. צמחי השבלול המתורבתים מספקים בדיקה שימושית לבחינת ההשפעה של מגוון גורמים מסיסים ותרופות פרמקולוגיות על התפתחות השבלול. לאחר דיסקציה של צמחי שבלול, ניתן להשתמש בטכניקת אלקטרופורציה כדי לבטא באופן שגוי גנים מעניינים ולבחון את השפעתם על מורפוגנזה של השבלול. התוצאות המוצגות כאן מדגימות כי ביטוי מאולץ של גורם שעתו...

דיון

כל התאים בתוך המבוך הקרומי של האוזן הפנימית העכבר כוללים חושי, nonsensory וכל הנוירונים הגנגליון הספירלה נגזרים מplacodally-נגזר otocyst ממוקם בסמוך למוח האחורי של האאקטודרם, סביב ^10-14 E8. בE11, אזור הגחון של otocyst משתרע ליצירת צינור השבלול וכפיתוח ממשיך, קבוצה של תאי האפיתל בשבלול האוזן, כמו גם באזורים אחרים של otocyst, הפכה צוין ככתמים prosensory שיהיה בהמשך להצמיח סוגים שונים של תאי שיער ותאי mechanosensory תמיכה nonsensory. בשבלול הפיתוח, שורה אחת של תאי שיער פני...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
HBSS	Gibco	14065-056
HEPES	Gibco	15630-080
Dulbecco ' s שונה	בינוני Gibco	12430-054
סרום בקר עוברי	Gibco	10082
N-2 תוסף (100x)	Gibco	17502-048
Ciprofloxacin hydrochloride	Cellgro	61-277-RF
צלחת זכוכית 60 מ"מ	קימבל צ'ייס	23062-6015/23064-6015
צלחת זכוכית 100 מ"מ	קימבל צ'ייס	23064-10015/23062-10015
סיכות Minutien	כלי מדע עדינים	26002-15
Dumont #5 מלקחיים	Fine Science Tools	11251-10
מחולל דופק	Protech International Inc	CUY21Vivo-SQ
כלי תרבות תחתון זכוכית	MatTek	P35G-0-10-C
מטריצת מטריג'ל	BD Biosciences	356237
צלחת תרבית, 60 x 15 מ"מ	Becton Dickinson	353037
כלי תרבית רקמות	Greiner Bio-one	639160
פוספט חוצץ	מלח Gibco	10010-023
OS-30	Dow Corning	4021768
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01
צינורות חרוטיים, 15 מ"ל	Greiner Bio-one	188261
Myosin 6	Proteus Biosciences Inc	25-6791
Myosin 7a	Proteus Biosciences Inc	25-6790
TuJ1	Sigma	T2200