הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

10.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52264

⸱

1 בדצמבר 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Rheumatology, Immunology and Allergy, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ניתוח במבחנה של רקומבינציה של מתג מחלקה בעכברים הוא מאתגר עקב מולקולות IgE ציטופיליות הקשורות לקולטני Fc על פני תאי B. אנו מתארים שיטה לזיהוי IgE באמצעות מחשוף בתיווך טריפסין של IgE קשור לפני השטח לפני קיבוע וחדירות לצביעה פלואורסצנטית ציטופלזמית.

תקציר

שרשרת כבדה (IGH) רקומבינציה אימונוגלובולין הלימפוציטים B מתג כיתה (CSR) היא תהליך שבו הביע תחילה IgM עובר לisotypes IGH האחר, כגון IgA, IgE וIgG. מדידה של IGH CSR במבחנה היא שיטת מפתח למחקר של מספר תהליכים הביולוגיים הנעים בין רקומבינציה DNA ותיקון להיבטים של אימונולוגיה מולקולרית ותאית. Assay במבחנה CSR כרוך ביטוי איג משטח מדידת הזרימה cytometric על תאי B מופעלים. בעוד מדידת subclasses IgA וIgG היא פשוטה, המדידה של IgE בשיטה זו היא בעייתית בשל IgE המסיס מחייב FcεRII / CD23 הביע על פני השטח של תאי B מופעלים. כאן אנו מתארים הליך ייחודי למדידה מדויקת של IgE-ייצור B עכבר תאים שעברו אחריות חברתית בתרבות. השיטה מבוססת על מחשוף בתיווך טריפסין של מתחמי IgE-CD23 על משטחי תא, ומאפשרת לגילוי של IgE-ייצור תאי B שושלת ידי CYצביעת toplasmic. הליך זה מציע פתרון נוח לניתוח הזרימה cytometric של CSR לIgE.

מבוא

במהלך שרשרת כבדה רקומבינציה אימונוגלובולינים (IGH) מתג כיתה (CSR) בעכברים ובבני אדם, IGH μ אקסונים קבועים אזור (Cμ) יימחקו ויוחלפו על ידי אחד מכמה סטים של אקסונים אזור קבועים במורד הזרם (ים H C) (למשל Cγ, Cε, וCα), וכתוצאה מכך מתג מייצור IgM לייצור של מעמדות אחרות איג (למשל IgG, IgE, או IgA). CSR מתרחש בתוך אזורי מתג (S), שהם 1-10 רצפי kb ממוקמים 5 'לכל קבוצה של C H של 1. אנזים ההפעלה-induced Cytidine deaminase (AID) יוזם אחריות חברתית באמצעות פעילות דיאמינציה cytidine.

IgE הוא מתווך עיקרי של מחלה אלרגית 2 והבנה טובה יותר של איך IgE מיוצר ומוסדר עשוי לפתוח דלתות לגישות טיפוליות חדשות למחלה אטופית. בעכברים ובבני אדם, IgE הוא אלוטיפ איג המוסדר ביותר בחוזקה. IgE בדרך כלל מתגלה באלפי רמות של times פחות מIGH האחר isotypes 3, אבל יכול להיות מורמים מאוד במצבי מחלה 4. עם זאת, אחריות חברתית לIgE הוא הבין באופן חלקי. הפעלה במבחנה של תאי B באמצעות IL-4 בשילוב עם שני אנטי CD40 או LPS, גורם לשני CSR IgG1 וIgE 5. תאי B מופעלים לבטא את קולט הנמוך זיקת IgE FcεRII / CD23 2,6, אשר נקשר IgE המסיס מופרש בתרבות לאחר CSR. לכן בעת ניתוח עם זרימת cytometry, תאי B עם כתם IgE-מחויב קולט בדומה לתאי B אופן אנדוגני להביע 7 IgE. אמנם ידוע כי B עכבר תאים לבטא את הזיקה הנמוכה IgG קולט FcγRIIB1 (CD32) 8, בניסיון שלנו זה לא מופיע להפריע למדידה של מיתוג בכיתה לIgG1. עם זאת, בעת מדידת מיתוג IgE לאחר הפעלת תא B בתרבות, IgE מחויב-פני השטח ספציפיים עלול לטשטש את הניתוח. עם שיטות צביעה משותפות, תאים שאינם IgE להביע להכתים חיובי עבור IgE.

מתואר כאן היא אסטרטגיה שנוצלה לביצוע מבחני אחריות חברתית ולזהות תאי B להביע IgE אמיתיים מעכברים 9-11. טיפול בתאי B מופעלים עם טריפסין, מגיב מעבדה משותפת לעיכול חלבון, מסיר משטח מחויב שני cytophylic וקרום IgE. permeabilization לאחר והצביעה לIgE cytoplasmic כך חושפים את התאים מייצרי IgE האמיתיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל הניסויים שתוארו כאן היו בהתאם להנחיות ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC) ואושרה על ידי בית החולים לבעלי חיים למחקר לילדים (קשת), בוסטון, מסצ'וסטס.

1. הכנת ריאגנטים

  1. בורסת 1,000x IL-4: מדוללים ציטוקינים IL-4 עד 20 מיקרוגרם / מיליליטר בH 2 O או 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA). לוותר ב200 aliquots μl 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge וחנות ב -20 ° C.
  2. 1,000x אנטי CD40: השג מהיצרן ברמה של 1.0 מ"ג / מיליליטר, חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. תקשורת גירוי תא B: כדי 425 מיליליטר של מדיום RPMI-1640, להוסיף 75 מיליליטר של סרום עגל עוברי מופשר טרי (FCS), 10 מיליליטר של 1.0 חיץ M HEPES, מניית L-גלוטמין 5 מיליליטר, 5 מיליליטר פניצילין: מניית סטרפטומיצין, 5 חומצות אמינו μl מיליליטר מינימאלי חיוני בינוני שאינו חיוני (MEM-NEAA), ו -3.5 של 2-mercaptoethanol. שמור תקשורת ב 4 C עד שבוע. הוספת IL-4 (20 ng / ml) ואנטי-CD40 (1.0 מיקרוגרם / מיליליטר) מייד לפני השימושרק להיקף המדיה הדרושה.
  4. 2% FCS-FACS מאגר: הוסף 10 מיליליטר של FCS ל -490 מיליליטר של 1x PBS. לשמור על 4 מעלות צלזיוס.
  5. פתרון 2x טריפסין-EDTA: לדלל 5 מיליליטר של 10x פתרון טריפסין-EDTA מניות (טריפסין 5.0 גר ', EDTA 2.0 גר' לכל ליטר) ב 20 מיליליטר של 1x PBS. חנות טריפסין-EDTA ב2x עובד aliquots ב 4 מעלות צלזיוס. לאפשר כדי לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש.
  6. עגל בסרום עוברי: שמור FCS המופשר ב 4 C עד שבועיים. מניחים על קרח 15 דקות לפני ההליך מכתים cytoplasmic.
  7. פורמלין שנאגרו ניטראלי: הכן פתרון 10% פורמלין (paraformaldehyde 3.7%). פורמלין הוא רעיל ולכן להתמודד עם זה מתחת למכסת מנוע קטר מעבדה כשהוא לבוש PPE המתאים. פורמלין לאחסן בטמפרטורת חדר בארון אחסון כימי.
  8. מתנול: מתנול החנות המוחלט (100%) ב -20 ° C עד שהתאים מוכנים להיות permeabilized. הערה מתנול שהוא דליק וצריך להיות מאוחסן במקפיא מתאים.

2.טיהור והפעלה של תאי B

  1. מטחול עכבר טרי שנקטפו, להכין השעיה תא בודדת על ידי הלחיצה בעדינות את האיבר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר עם הבוכנה של מזרק 3 מיליליטר. בצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר, לאסוף תאים ב 10 מיליליטר של 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. למזוג את גלולה supernatant וגלול ב 1 מיליליטר של תאי דם אדומים lysing הצפת למשך 5 דקות. לנטרל עם 13.5 מיליליטר של 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות.
  3. מגנטי נפרד (אופציונאלי) תאי B באמצעות אנטי CD45R (B220), שכותרת חרוזים, בעקבות פרוטוקול טיהור MACS לפי הוראות יצרן.
  4. לעורר תאי B מטוהרים ברמה של 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר בתקשורת גירוי תא B חימם המכילה IL-4 (20 ng / ml) ואנטי-CD40 (1.0 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 5 ימים על 37 מעלות צלזיוס. התחל עם 8 מיליליטר של התרבות מחולק ל 2 בארות של צלחת תרבות 6 היטב (4 מיליליטר כל אחד).
  5. בדוק cultuמחדש מדי יום כדי לשמור על 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר. התאם את הריכוז על ידי פיצול לתוך בארות אחרות ודילול התרבות עם תקשורת גירוי B תא המכילה IL-4 הטרי ואנטי-CD40.

3. trypsinization, קיבוע, וpermeabilization

  1. Trypsinization
    1. לאסוף עד 1.0 x 10 7 של תאים בתרבית בצינור חרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, ולמזוג supernatant.
    2. לשטוף עם 10 מיליליטר של PBS להסיר את החלבון שיורית מתקשורת אוסף תא. חזור על שלב צנטריפוגה ולמזוג supernatant.
    3. Resuspend התא גלולה בהיקף הנותרת לאחר decanting (כ -100 μl).
    4. בזהירות להוסיף 800 μl של טמפרטורת חדר 0.1% (2x) טריפסין-EDTA לתאים. לוותר לאט בזווית של 45 מעלות כלפי מטה בצד של צינור חרוטי.
    5. סגור את הצינור ומערבבים בעדינות על ידי הטיית הצינור כך הנוזל פועל לאורכו של זמן צינור 5-6s. משקע סיבי, לבן עלול להיווצר בפתרון. הגבל את זמן trypsinization לתחת דקות.
    6. להרוות את תגובת trypsinization עם 1 מיליליטר של FCS הקר. לדלל את FCS מייד על ידי הוספת 10 מיליליטר של PBS הקר.
    7. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס, אז למזוג supernatant ולהחזיר את הצינורות לקרח.
  2. קיבוע
    1. Resuspend התאים בהיקף הנותרת לאחר decanting. במידת צורך, להביא נפח עד עם PBS הקר 100 μl.
    2. במנדף, להוסיף 800 μl של 10% פתרון ניטראלי שנאגרו פורמלין לתאים וpipet למעלה ולמטה. הצינור יחמם על התוספת של פורמלין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. Permeabilization
    1. הגדר את מיקסר מערבולת benchtop במהירות רועדת עדינה.
    2. לצייר 9 מיליליטר של (-20 ° C) מתנול הקר לpipet סרולוגיות 10 מיליליטר.
    3. החזק את הצינור המכיל את התאים על פני מיקסר המערבולת בעדינות להתחיל שקיןg התאים.
    4. הוספת מתנול קר לצינור, כך שהוא נופל dropwise על גבי התאים תוך הצינור עדיין רעד כל כך שמתנול הוא הערבוב ברציפות. לאחר 2 מיליליטר הראשון של מתנול מהירות מחלק יכולה להיות מוגברת לזרם איטי.
    5. בואו הצינור לשבת על קרח למשך 30 דקות כדי להשלים את permeabilization. לחלופין, ניתן לאחסן את התאים ב -20 ° C עד חודש.

4. הקרינה מכתים לIgG1 ומיתוג IgE כיתה

  1. מדגם צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ולמזוג את פתרון מתנול. משקע לבן עשוי גלולה עם התאים.
  2. הוסף 10 מיליליטר של בטמפרטורת חדר 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות כדי לשטוף את התאים. חזור פעם אחת. הערה: כביסה גלולה עם טמפרטורת חדר PBS מתמוססת משקע נוסף שעלולות להיווצר לאחר שלב 4.1.
  3. לבצע שטיפה נוספת עם 10 מיליליטר של 2% חיץ FCS-FACS.
  4. להפיץ דוגמאות ל96-גם סיבוב צלחת תחתונהו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. למזוג supernatant ולשים את הצלחת על קרח.
  5. כתם ב -60 μl של 2% חיץ FCS-FACS לכל גם עם דילולים הנוגדן הבאים: Anti-IgM הרשתית / Cy7, 1: 200, Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
  6. לאחר 5 דקות של מכתים, לשטוף את הצלחת עם 150 μl של 2% חיץ FCS-FACS ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
  7. Resuspend ב400 μl של 2% חיץ FCS-FACS וpipet דרך מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור FACS 5 מיליליטר.

5. השתמש באסטרטגית gating בעקבות:

  1. לבודד CD45R (B220) תאים חיוביים מאוכלוסיית הלימפוציטים פיצוץ ממוקמת על חלקת FSC / SSC (איור 1).
  2. מהתאים החיוביים B220, להשתמש בעלילת IgE וIgG1 לחשוף האוכלוסיות המתאימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הליך זה יושם בהצלחה ללמוד CSR לIgE בB עכבר תאים. כדי להדגים את היעילות במדידת CSR, אנחנו מגורה תאי B טחול עכבר עם אנטי CD40 וIL-4 כפי שתואר לעיל 11. לאחר חמישה ימים של גירוי, תאים נאספו ועובדו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל ומוכתם עם fluorescently שכותרתו IgM, IgG1, IgE, וB220 נוגדנים (CD45R). מגודר על לימפוציטים מסוג פיצוץ (איור 1), אוכלוסייה ברורה של IgE + תאים לא יכול להיות מופלה בצורה נקיה ללא טיפול טריפסין (איור 2 א). עם זאת, trypsin...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גירוי של תאי B טחול עכבר בתרבות עם אנטי CD40 וIL-4 יהיה לדמות סוג T מסייע 2 (T H 2) אינטראקציות, מיתוג כיתה מעודד לIgG1 וIgE 5. תאי B יכולים להיות מופעלים על אחריות חברתית בהקשר של splenocytes הכולל של 12 או תאי B טחול מטוהרים 11. כפי שצוין בפרוטוקול (שלב 2.3), העשרת תאי B היא אופציונלית, ונתונה לשיקול דעתו של הנסיין כדי לקבוע אם הוא היית מועיל. הפרדה מגנטית חיובית של תאי B באמצעות CD45R (B220), שכותרת חרוזים מנוצלים כאן. לאחר הפרדה, מומ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין גילוי נאות.

תודות

DRW נתמך על ידי מענקי NIH AI089972 וAI113217, ועל ידי הרירי אימונולוגיה מחקרי צוות, ופרס קריירה עבור מדענים רפואיים מWellcome בורוז הקרן מחזיק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נגד עכבר IgE FITCBD Pharmingenשיבוט 553415R35-72
עכברוש נגד עכבר IgG1 PEBD Pharmingenשיבוט 550083A85-1
מתנולBDHBDH1135-4LPשמור על -20 °
מסננת תאי פלקון C 40 ומיקרו; m ניילוןקורנינג352340
מסננת תאי פלקון 70 ומיקרו; m קורנינג ניילון352350
Anti-Hu / Mo CD45R (B220) PerCP-Cy5.5eBioscience45-4052-82שיבוט RA3-6B2
נגד עכבר/חולדה CD40eBioscience16-0402-85שיבוט HM40-3
RPMI בינוני 1640Gibco11875-093
HEPES (1M)Gibco15630-080
MEM-NEAA (100x)Gibco11140-050
פוספט חוצץ מלח (10x)Lifetechnologies (Corning)46-013-CM
MACS CD45R (B220) מיקרו-חרוזים Miltenyi Biotec130-049-501
עמודת טיהור MACSMiltenyi Biotec130-042-401
IL-4PeproTech214-14Reconstruct במים או 0.1% תמיסת פורמלין BSA
, חוצץ ניטרלי, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
תמיסת טריפסין-EDTA (10x)Sigma AldrichT4174-100 מ"ל5.0 גרם טריפסין, 2.0 גרם EDTA• 4 Na לליטר של 0.9%
NaCl פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא אולדריץ'P0781-100 מ"ל10,000 U פניצילין; 10 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין (100x)
L-גלוטמין 200 מ"מסיגמא אולדריץ'G7513
2-מרקפטואתנול (99%)סיגמא אולדריץ'M6250-100 מ"ל
מאגר ליזה של תאים אדומיםסיגמא אולדריץ'R7757
עכברוש נגד עכבר IgM RPE/Cy7SouthernBiotech1140-17שיבוט 1B4B1
HyClone סרום עגל עוברי תרמוSH30910.03
תאי B מדיה לגירויתאי B מדיה לגירוי תאי B מורכבת מ-RPMI עם סרום עגל עוברי (15%), 20 מ"מ HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 מ"מ L-גלוטמין,   1x פניצילין-סטרפטומיצין (פניצילין: 100 U/ml, סטרפטומיצין: 100 ומיקרו; גרם/מ"ל), בטא-מרקפטואתנול (7 ומיקרו; ליטר/ליטר), IL-4 (20 ננוגרם/מ"ל) ואנטי-CD40 (1 ומיקרו; גרם/מ"ל)

מקורות

  1. Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
  2. Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
  3. Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
  4. Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
  5. Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
  6. Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
  7. Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
  8. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
  9. Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
  10. Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
  11. Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
  12. Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
  13. Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
  14. Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
  15. Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
  16. Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
  17. Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
  18. Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
  19. Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
  20. Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
  21. He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
  22. Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

B IgEClass Switch RecombinationBIgEIgEB
איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.