הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

עכבר דגם ריאה של פיצוי ריאות צמיחה

13.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52294

⸱

17 בדצמבר 2014

 ,  , 
1Division of Critical Care Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

במאמר זה

סיכום

כריתת ריאות בעכבר היא מודל נפוץ לצמיחת ריאות מפצה. ניתן להשתמש בהליך זה בשילוב עם מעקב אחר שושלת או מודלים של עכברים טרנסגניים כדי להבהיר את המנגנונים הבסיסיים.

תקציר

בבני אדם, שיבוש בתיקון ועיצוב מחדש של ריאות פגועות תורם לשורה של הפרעות ריאה חריפות וכרוניות שעלולות בסופו של דבר להוביל לנכות או למוות. מודלים של בעלי חיים מבוססי פציעות של תיקון והתחדשות ריאות מוגבלים על ידי תגובות ספציפיות לפציעה, מה שמקשה על ההבחנה בין שינויים הקשורים לתגובת הפציעה ופתרון הפציעה לבין שינויים הקשורים לתיקון ריאות והתחדשות ריאות. עם זאת, השימוש במודלים של בעלי חיים לזיהוי מסלולי איתות תיקון והתחדשות אלה הוא קריטי לפיתוח טיפולים חדשים שמטרתם לשפר את תפקוד הריאות לאחר פגיעה בריאות. מודל כריתת הריאות של העכבר משתמש בצמיחת ריאות מפצה כדי לבודד את אותות התיקון וההתחדשות הללו על מנת להגדיר בצורה ברורה יותר מנגנונים של ספטציה מחדש של המכתשית. כאן, אנו מתארים את הטכניקה שלנו לביצוע כריתת ריאות של עכבר וכריתת ריאות דמה. ניתן להשתמש בטכניקה זו בשילוב עם מעקב אחר שושלת או מודלים אחרים של עכברים טרנסגניים כדי להגדיר מנגנון מולקולרי ותאי של תיקון והתחדשות ריאות.

מבוא

תפקידו העיקרי של הריאות הוא לספק לחמצן ופחמן דו-חמצני חילופי בין האורגניזם והאווירה. בבני אדם, שורה של תנאים מולדים ונרכשים להוביל לשטח ריאות מופחת וכתוצאה מכך תפקוד ריאות לקוי. למרות שורה של טיפולים כגון סטרואידים בשאיפה, מרחיבי סימפונות, חמצן, אוויר ואוורור מכאני כרוני משמשות כדי למתן את ההשלכות של תפקוד ריאות לקוי 1-3, הטיפול האידיאלי לתנאים אלה יקדם צמיחה מחודשת של רקמה תפקודית ריאות - כלומר, ריאות התחדשות.

התחדשות רקמות של יונקים תועדה היטב. קוצני העכבר האפריקאי יכול להתחדש שטחים גדולים של עור ללא היווצרות צלקת 4. גדוד דיסטלי בבני אדם יכול להתחדש בעקבות פציעה או קטיעה 5-7. הריאה הבאה (PNX), צמיחת ריאות מפצה מתרחשת בעכברים 8, 9 חולדות, לעשותGS 10, ובני האדם 11. על פי הגדרה, צמיחת ריאות פיצוי כרוכה הרחבה לא רק של airspaces הקיים, אך מחדש septation של airspaces המוגדל אלה עם הרחבת זרימת הדם קשור 12. ניתוח ביטוי גנים הוכיח כי מודל זה משחזר רב של אירועי האיתות של התפתחות ריאות 13. ארבעה שבועות לאחר העכבר PNX, שטח פן alveolar הוא שווה ערך לזה של בעלי חיים דמה מופעלים 14. בכתב היד הזה, אנו מתארים את PNX העכבר ונהלי PNX דמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת שימוש בבעלי חיים:: הערה כל הנהלים במחקר זה נערכו באישור וביצוע ההנחיות של בעלי החיים המוסדיים השימוש וטיפול הוועדה (IACUC) בבית החולים לילדים בסינסינטי. עכברי זכרים שמונה שבועות בן C57BL / 6J התקבלו מג'קסון מעבדות (Bar Harbor, ME) ואפשרו להסתגל לשבוע לפני שימוש אחד. עד ניתוח, בעלי חיים שוכנו במתקן מחסום הפתוגן ללא וסיפקו אוכל autoclaved וlibdium מודעת מים מסונן. כל כלוב עכבר סופק עם אוויר ומים ייעודיים, וחדרים נשמרו במחזור היום-לילה 12 שעות. בעקבות התאוששות מניתוח, עכברים נשמרו בכלובים עם צמרות מסוננות, ובלבד libidum מודעת אוכל autoclaved, ובלבד שמים מסוננים מבקבוק מים.

1. הכנה של מכשירים

  1. הפוך 6 מפשקי עור באמצעות אטבי נייר וסיכות. טוויסט יישר מהדקי נייר באנקס של סיכות נייר, leave תיל פלדה ישר 5 סנטימטר בקצה אחד ולעשות 0.5 סנטימטר בודד וו "U" בצורה בסוף החוט.
  2. הפוך וילונות כירורגי מרובעים כ -15 x 15 סנטימטר באמצעות ניילון נצמד. הכן רוטב אחד לכל עכבר. שים מגדל נייר בין כל לעטוף.
  3. לעקר את כל הכלים כירורגיים יחד עם ערימה של אריחי 12 x 12 אינץ 'פקק, גזה, וספוגיות כותנה שקצה.

2. עכבר הכנה

  1. לגרום להרדמה עם isoflurane 2%. לשקול בעלי חיים.
  2. באזור הכנה כירורגית ייעודי לגלח בית חזה שמאלי ואזור צוואר עם מכונת גילוח חשמלי.
  3. החל ירידה של המשחה הדמעה המלאכותית לעיניו של העכבר.
  4. לטהר צוואר ובית חזה שמאלי עם chlorhexidine ואלכוהול איזופרופיל. חזור פעמיים יותר.

אינטובציה 3. העכבר Oro-קנה הנשימה ואוורור מכאני

  1. יש מקום טכנאי כירורגית שאינו סטרילי פרקדן העכבר באזור הניתוח המחומם מראש.
  2. לאשר עומק ההרדמה על ידי תיעוד חוסר תגובה לקמצוץ כפה.
  3. לאחר שטיפת ידיים ועוטים לבוש כירורגית, מסיכה, וכובע, דון כפפות מנתחים סטרילית.
  4. לאחר כורך ובאמצעות טכניקה האספטי, לעשות חתך אנכי 1 סנטימטר מעל אמצע הצוואר-הקדמי כדי לחשוף את הגרון. קל לחזור שרירי הרצועה עם משוננים מלקחיים מעוקלים סנטימטר, 10 ולחשוף את הגרון וקנה נשימה על ידי הפצת שרירי הרצועה עם הקצה של מספריים ישר.
  5. דרך הפה להכניס angiocatheter בוטה, קצה 22 G לאמצע קנה הנשימה (איור 1 א) וחזותי לאשר מיקום (איור 1). לשמור על ההרדמה ולאוורר באמצעות isoflurane 1-3% באמצעות מכונת הנשמה מכרסם (225 μl לשבץ; 200 סטוקס לדקה). להעסיק מגבלת לחץ של 15 סנטימטרים H 2 O.

4. עכבר ריאה

  1. הנח את העכבר בעמדת פַּחֶסֶת רוחב תקין עם מול האחורי של העכברהמפעיל (בצד שמאל למעלה). השתמש בניילון נצמד איטום עצמי כוילון סטרילי. חיתוך דרך הווילון, להשתמש במספריים מעוגלים היטה בוטים לעשות מקביל ארוך קיצוץ של 2 סנטימטר לצלעות בחלל צלע 4 th וה -5. הכנס את המספריים קצה מעוקל בוטים ולנתח את העור מצלעות הבסיס ושרירים הבין-.
  2. לחזור בו העור עם ארבעה מפשקים לחשוף מרובע 1.5 x 1.5 סנטימטר חלון כירורגית (איור 2 א). אבטח את המפשקים ללוח השעם.
  3. לנתח את הצלעות באמצעות מלקחיים מעוקלים, ולהשתמש בקצה אחד של המלקחיים המעוקלים להיכנס לחלל בית החזה.
  4. שימוש במייקרו-המספריים קצה הקהה, השתמש בלהב התחתון להיכנס לחלל בית החזה. ביצוע חתך 0.5 סנטימטר בין הצלעות וחזור על הפעולה בכיוון ההפוך.
  5. באמצעות שני הכולים הכתיבה שנותרו, לפתוח את בית החזה בציר הקדמי-אחורית והמפשקים מאובטחים ללוח השעם (איור 2).
  6. שימוש שבקצו מלקחיים בוטים מעוקלים ביד השמאל, לתפוס את הריאה השמאלית ולעקור את החלק העליון של הריאה השמאלית רוחבי וinferiorly באמצעות פתיחת בית החזה עד עורק הריאה השמאלי והסמפונות נחשפים (איור 3 א ', ב').
  7. מחזיק המוליך microclip כלי הדם טיטניום הטעון ביד ימין עם הגוף של המוליך בכף וקצה מעוגל פונה אל כף היד (איור 3 ג), חלק את קצה המוליך לבית החזה לאורך העקמומיות של חלק האחורי של השמאל ריאות וקליפ הסמפונות עזבה ועורק ריאה (איור 3D).
  8. הסר את המוליך אבל לשמור הריאה השמאלית חזר בו. אחוז במייקרו המספריים קצה הקהה ​​עם יד ימין וחתכתי את הסמפונות ודיסטלי עורק הריאה לקליפ ולהסיר ריאה שמאלית (איור 3E).
  9. הסר את מפשקי צלעות.
  10. השתמש במלקחיים בוטים המעוקלים לצבוט את 1 סנטימטר של עור נחות incisiבאבל מעל לרמה של הסרעפת והכנס angiocatheter G 24 דרך העור ולתוך חלל בית החזה השמאלי (איור 4 א ', ב').
  11. השתמש 5-0 prolene תפר למקום שני תפרים שהופסקו סביב ה 4 ו -5 צלעות ה לסגור את חלל בית החזה.
  12. הסר את מפשקי העור. השתמש בשני סטים של מלקחיים כדי להתקרב לעור לאורך החתך ומדביק את העור סגור.
  13. חבר מזרק luer נעילת 3 מיליליטר לangiocatheter ולהסיר אוויר שייר על ידי יישום שאיבה עדינה ונסיגת angiocatheter.
  14. מדביק את החתך בצוואר נסגר באמצעות שני סטים של מלקחיים כמו קודם.

5. עכבר שאם ריאה

  1. לחשוף את הריאה השמאלית כפי שצוין בפרוטוקול "עכבר ריאה". הרם את כלוב צלעות עם מלקחיים בוטים מעוקלים כדי לאפשר לאוויר לתוך חלל החזה השמאלי (איור 5 א ', ב').
  2. הנח angiocatheter G 24 לאף השמאלחלל racic כאמור לעיל נזהר שלא לפגוע הריאה השמאלית.
  3. באמצעות 5-0 תפר prolene ונזהר שלא לנקב את הריאות (איור 5 ג), למקם את שני אורכים של חומר תפר לתוך 3 rd / 4 th וה -5 / 6 interspaces צלע ה (איור 5D). הנח את שני האורכים של חומר תפר לפני הקשירה כדי להפחית את הסיכונים של פריצת ריאה השמאלית. לקשור את חומר התפר לעשות שני תפרים שהופסקו (איור 5E).
  4. מדביק את העור על החתך בבית החזה, להסיר אוויר שייר עם angiocatheter, ולהדביק את החתך בצוואר כאמור לעיל.

6. החייאה, שיכוך כאבים, ושחזור

  1. כבה את isoflurane, ולנהל 0.1 מ"ג / קילוגרם של עצירות ו0.5 מיליליטר של תת-עורית מלח הרגילה.
  2. כאשר נשימה ספונטנית לחדש, להסיר את הטובוס.
  3. שים לב עכבר עד שהוא שוב אמבולטורי. הליכה בדרך כלל resumes כמה דקות לאחר הסרת הטובוס.
  4. מניחים את העכבר ב-27 מעלות צלזיוס חממה (חמצן humidified, 25%) כדי לשחזר O / N.
    הערה: אנו שמים כמה כדורים של האוכל רטוב עם מים על רצפת הכלוב ל24 שעות הראשונות שלאחר ניתוח.
  5. לנהל 0.1 מ"ג / קילוגרם של עצירות בזריקת intraperitoneal פעמיים ביום למשך שלושה ימים לאחר ניתוח. הקפד לא לפתוח את האתר כירורגית בעת טיפול בבעלי חיים.

7. ניטור עכבר

  1. לשקול עכברים בבית 1, 3, 5, ו -7 ימים לאחר ניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

. חלקה של PNX ומשקולות עכבר מזויף פעל מסופקת באיור 6 בידיים שלנו, הישרדות היא באופן עקבי 95-100% עבור שתי pneumonectomy PNX והעמדת פן. לתיאורים של איך הריאה הימנית מחדש גדל במודל זה וכמובן הזמן הצפוי, אנחנו מפנים את הקורא לכתבי יד של גיבן et al. 15 וet al וואנג. 14

יש להימנע מכמה ממכשולים נפוצים לבצע בהצלחה את נהלי pneumonectomy דמה PNX העכבר ועכבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

סיפקנו תיאור מפורט ביותר של נהלי PNX PNX העכבר ועכבר דמה שדווחו עד כה. אנחנו עשינו את הקורא מודע לכמה מהמכשולים הנפוצים שחוקרים לומדים ההליך נפוץ להיתקל, ויש לנו התווינו כמה טכניקות שפותחו על ידי המעבדה שלנו כדי להקטין נגד המלכודות הללו. מעבדות אחרות ניצול מודל זה עשויות פיתחו שינויים בטכניקה אחרים או משתמשות במכשירים שונים. בעת הערכת הבדלים בטכניקות, חוקרים פרטיים יצטרכו להחליט אם הבדלים אלה משפיעים באופן משמעותי את תוצאות ניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות לחטיבת השירותים הווטרינריים של בית החולים לילדים בסינסינטי על הסיוע. כתב היד הזה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות K12 HD028827. אנה פרל, דוקטורט, לימדה את המחברים את ההליך הכירורגי הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מוליך קליפ כלי דם 6 אינץ'טלפלקס רפואי (WECK)137062
אופק קטן טיטניום אדום קליפטלפלקס רפואי (WECK)1201
דפוס צר 12 ס"מ מלקחיים מעוקליםFine Science Tools11003-12
מעוקל משונן 10 ס"מ מלקחיים GraefeFine Science Tools11052-10
מחזיקמחט CastroviejoFine Science Tools12565-14
מספריים פזילה ישרים 9 ס"מ (קצה קהה)Fine Science Tools14075-09
ישר 8.5 ס"מ מספריים עדינים מוקשיםFine ScienceTools 14090-09
ישר וקצה קהה Cohan-Vannas מספריים קפיצייםFine Science Tools15000-12
דבק עורGluture32046
22 גרם אנגיוקטטר
24 גרם אנגיוקטטר
3 מ"ל מזרק
4 מחזירים קצרים
2 מחזירים ארוכים
5-0 פרולן על מחט חיתוך מעוקלתEthicon8698G
0.5 מ"ל מזרק על מחט
רגיל
Buprenorphine
Press-n-Seal לעטוףאת חברת מוצרי
12 x 12 אינץ 'ערימת לוח פקקאופיס דיפו
70% אתנול
בטדין
עכבר מאווררהוגו סאקס אלקטרוניקMinivent Type 845
Isoflurane וופורייזרOHMEDAExcel 210 SE
משחת דמעות מלאכותיתPuralubeNDC: 17033-211-38
נעילת לואר 27 גרם מלח שמחה

מקורות

  1. Strueby, L., Thebaud, B. Advances in bronchopulmonary dysplasia. Expert review of respiratory medicine. , (2014).
  2. Donn, S. M., Sinha, S. K. Recent advances in the understanding and management of bronchopulmonary dysplasia. Seminars in fetal & neonatal medicine. 14, 332(2009).
  3. Molen, T., Miravitlles, M., Kocks, J. W. COPD management: role of symptom assessment in routine clinical practice. International journal of chronic obstructive pulmonary disease. 8, 461-471 (2013).
  4. Seifert, A. W., et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561-565 (2012).
  5. Vidal, P., Dickson, M. G. Regeneration of the distal phalanx. A case report. Journal of hand surgery. 18, 230-233 (1993).
  6. Potter, P. C., Levine, M. H. Bone Regeneration Following Chronic Suppurative Osteitis of the Distal Phalanx. Annals of surgery. 80, 728-729 (1924).
  7. McKim, L. H. Regeneration of the Distal Phalanx. Canadian Medical Association journal. 26, 549-550 (1932).
  8. Brown, L. M., Rannels, S. R., Rannels, D. E. Implications of post-pneumonectomy compensatory lung growth in pulmonary physiology and disease. Respir Res. 2, 340-347 (2001).
  9. Holder, N. Regeneration and compensatory growth. British medical bulletin. 37, 227-232 (1981).
  10. Hsia, C. C. Lessons from a canine model of compensatory lung growth. Curr Top Dev Biol. 64, 17-32 (2004).
  11. Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367, 244-247 (2012).
  12. Konerding, M. A., et al. Spatial dependence of alveolar angiogenesis in post-pneumonectomy lung growth. Angiogenesis. 15, 23-32 (2012).
  13. Kho, A. T., Liu, K., Visner, G., Martin, T., Boudreault, F. Identification of dedifferentiation and redevelopment phases during postpneumonectomy lung growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305, 542-554 (2013).
  14. Wang, W., Nguyen, N. M., Guo, J., Longitudinal Woods, J. C. Noninvasive Monitoring of Compensatory Lung Growth in Mice after Pneumonectomy via (3)He and (1)H Magnetic Resonance Imaging. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 697-703 (2013).
  15. Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI research. 2, 48(2012).
  16. Rawlins, E. L., Perl, A. K. The a'MAZE'ing world of lung-specific transgenic mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 46, 269-282 (2012).
  17. Ochs, M., Muhlfeld, C. Quantitative microscopy of the lung: a problem-based approach. Part 1: basic principles of lung stereology. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305, L15-22 (2013).
  18. Ysasi, A. B., et al. Effect of unilateral diaphragmatic paralysis on postpneumonectomy lung growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305, L439-445 (2013).
  19. Dane, D. M., Yilmaz, C., Estrera, A. S., Hsia, C. C. Separating in vivo mechanical stimuli for postpneumonectomy compensation: physiological assessment. Journal of applied physiology. 114, 99-106 (2013).
  20. Mortola, J. P., Magnante, D., Saetta, M. Expiratory pattern of newborn mammals. Journal of applied physiology. 58, 528-533 (1985).
  21. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of applied physiology. 106, 984-987 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ShamLineage Tracing
עכבר דגם ריאה של פיצוי ריאות צמיחה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.