מאמר שיטה

משטח מדידת פוטנציאל של חיידקים באמצעות קלווין Probe מיקרוסקופית כוח

DOI:

10.3791/52327

⸱

28 בנובמבר 2014

 , 
1BioNano Laboratory, School of Engineering, University of Guelph

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המסביר את השימוש במיקרוסקופ כוח בדיקה קלווין ככלי ליצירת מפות פוטנציאל פני השטח ברזולוציה גבוהה בקנה מידה ננומטרי. כלי זה יושם כדי להעריך את תפקיד פוטנציאל פני השטח על יכולת הקישור של מיקרואורגניזמים למשטחי מצע.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוטנציאל פני השטח הוא מאפיין פיזי נפוץ להתעלם שמשחק תפקיד דומיננטי בהידבקות של מיקרואורגניזמים למצע משטחים. מיקרוסקופיה קלווין כוח הבדיקה (KPFM) היא מודול של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) המודד את הפרש פוטנציאל קשר בין משטחים בקנה מידת ננו. השילוב של KPFM עם AFM מאפשר לדור בו זמני של פוטנציאל פני השטח ומפות טופוגרפיות של דגימות ביולוגיות כגון תאי חיידקים. כאן, אנו מעסיקים KPFM לבחון את ההשפעות של פוטנציאל פני השטח על הידבקות של חיידקים למשטחים רלוונטיים מבחינה רפואית כגון נירוסטה וזהב. מפות פוטנציאל פני השטח נמצאו הבדלים בפוטנציאל פני השטח לממברנות של חיידקים על מצעי חומר שונים. גרף צעד-גובה נוצר כדי להראות את ההבדל בפוטנציאל פני השטח באזור גבול בין פני המצע ומיקרואורגניזמים. שינויים בפוטנציאל פני השטח קרום תא נקשרו עם שינויים בחילוף חומרים ותנועתיות סלולריים. לכן, KPFM מייצג כלי רב עוצמה שיכול להיות מנוצל כדי לבחון את השינויים של פוטנציאל שטח קרום חיידקים על הידבקות למשטחי מצע שונים. במחקר זה, אנחנו מדגימים את ההליך כדי לאפיין את הפוטנציאל של תאי Staphylococcus aureus USA100 methicillin-עמיד בודדים משטח על נירוסטה וזהב באמצעות KPFM.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilms מיוצר על משטחי ציוד ובפצעי cutaneous מהווה בעיה עבור התעשייה הרפואית כbiofilms הוא סרבנים להסרת ויכול להוביל לעלייה בשיעור של העברת מחלות והתנגדות נגד חיידקים. קובץ מצורף הוא הצעד הראשון בהיווצרות biofilm והוא השלב הקריטי ביותר בשל ההפיכות שלה 1-3. מאפייני פני השטח מצע לשחק תפקיד מכריע בקובץ מצורף חיידקים. גורמים כגון קשיחות משטח, נקבוביות, חספוס, והידרופוביות הוכחו להשפיע קובץ מצורף חיידקים; עם זאת, מחקר קטן שבחן את תפקידו של פוטנציאל פני המצע (SP) על הידבקות של חיידקים נעשה 4,5. משטחים טעונים שלילי למנוע ההתקשרות של נבגי thuringiensis Bacillus ליציץ, סיליקון, וזהב 6. שינויים בפוטנציאל הממברנה סלולארי מעידים על שינויים בקובץ מצורף סלולארי ו5,7 תנועתיות. זה נצפה כי Hom חשמלימשטחי ogeneous יותר בקלות לקדם את ההידבקות של חיידקי 5. המאפיין את הפוטנציאל של חיידקי פני השטח בקנה המידה ננומטרי יכול לספק דרך רומן להבין קינטיקה ההידבקות של חיידקים למשטחים שונים, ובכך יכול לסייע בפיתוח אסטרטגיות אנטי-biofouling. בניגוד לשיטות אחרות המשמשות לאפיון קינטיקה אלקטרו של חיידקים, כגון פיזור electrophoretic אור, פוטנציאל זטה, ונחישות נקודת isoelectric, מיקרוסקופיה קלווין כוח הבדיקה (KPFM) מאפשרת הבדיקה של תאים בודדים במקום תרבויות שלמות 8-11. זה מועיל כאשר רוצה להשוות תאי תאים או biofilm מאפיינים חשמליים ברמת דיוק גבוהה ודיוק.

KPFM הוא מודול של מיקרוסקופיה כוח האטומית (AFM). AFM פותח כתוצאה ישירה של מיקרוסקופ מנהור הסורק (STM) 12. התמונות הראשונות שפורסמו באמצעות STM נעשו על ידי גרד ביניג והיינריך Rorhrer בשנת 1982 12 . ההמצאה שלהם הייתה מסוגלת לפתור מבנים אטומיים על ידי סריקה סריקת קצה מוליך חד מעל פני השטח מוליך באוויר. ההשלכות של השגת תמונות ברזולוציה גבוהה נרגשות ביולוגים שניסו במהירות כדי להשתמש STM לדגימות תמונה מיובשות של DNA, חלבונים, ווירוסים 12. יכול להיעשות גם STM בנוזלים באמצעות טיפים בדיקה מיוחדים 13. זה הוצג על ידי לינדזי et al., שהשתמש בSTM וAFM למולקולות DNA תמונה ב 10 מ"מ 4 HClO ובמים, על אלקטרודות זהב 13. KPFM הודגם בקביעת פוטנציאל Surface של ניתוח דנ"א וחלבון 25 ומולקולות ביולוגיות אינטראקציה עם ligands 26.

KPFM פועל על ידי מדידת הבדל המגע הפוטנציאלי (CPD) בין קצה AFM מוליך שלוחה ומדגם באופן אידיאלי מוליך (איור 1, i) 14,15. דוגמאות לא בהכרח חייבות להיות (כלומר, sampl ביולוגי מוליךes). הדמיה יכולה להתבצע על נציץ, זכוכית, וכל עוד המשטח שאינו מוליך הוא דק ויש חומר מוליך בסיסי 6,7 משטחי סיליקון (שאינם מוליכים). CPD הוא שווה ערך למתח פוטנציאל פני השטח וניתן לתאר את ההבדל בפונקציות העבודה בין הקצה (קצה φ) ומדגם (מדגם φ), מחולק בתשלום האלקטרונים השלילי (- ה). כאשר קצה AFM מוליך הוא הביא קרוב למשטח מדגם (מופרד על ידי מרחק d), כוח אלקטרוסטטי (es F) נוצר כתוצאה מההבדל באנרגיות פרמי (איור 1, ii,) 15. בשלב זה, את האנרגיות של הוואקום (v E) וקצה המדגם נמצאות בשיווי משקל ותואם. על הבאת הקצה קרוב יותר אל פני השטח המדגם, משטח הקצה והמדגם בא במגע חשמלי ולפעול כקבלים מקבילים צלחת (איור 1, ii, b ) 14,15. בנקודה, אנרגיות פרמי של פני השטח וקצה המדגם הופכות מיושרות, והגיעו לשיווי משקל מתמיד (איור 1, ii, ב). משטח הקצה ומדגם יחויב וCPD V יהווה בשל הבדל בפונקציות של v ועבודת E. מעשי es F באזור המגע החשמלי בשל CPD V נוצר. כוח זה בטל לאחר מכן באמצעות היישום של DC V חיצוני לקצה שיש את אותו גודל כמו CPD V נוצר (איור 1, ii, ג). זה מיושם מתח DC מבטל תשלום פני השטח באזור המגע חשמלי, והסכום של V DC הצורך לחסל את es F של CPD V הוא שווה להפרש בפונקציות העבודה בין saמשטח mple וקצה 15. יש לציין שפונקצית העבודה של הקצה ידועה והוא מסופק על ידי יצרנים. בכל שיטות KPFM, מתח AC (V AC, כ 100-500 mV) חל גם על הקצה על מנת ליצור כוחות חשמליים נעים בין הקצה והמדגם 14. זה מספק רזולוציה טובה יותר כאשר מודד שינויים בCPD V ו / או es F. בהקשר זה, שינויים בתדירות או משרעת תנודה חשמלית ניתן לתקן על ידי V DC, ועל פני השטח יכולות להיות שנוצרו מפות פוטנציאליות. נתונים מאזורים ספציפיים של מפות אלה ניתן לנתח נוספים על מנת לספק מידע על תכונות חשמליים טופוגרפיות ספציפיות.

יכול להיות מופעל KPFM בשלושה מצבים: (1) מצב מעלית, (2) מצב אפנון משרעת (AM), ו- (3) מצב 14,16 אפנון תדר (FM). מצב מעלית היה inc הראשוניarnation של KPFM. מצב Lift מסתמך על שיטת שתי עוקפת שבקצה נע נגרר על פני לקבל תמונה טופוגרפית. למעבר שני הקצה מורם מרחק קבוע מראש מעל המדגם (10 - 100 ננומטר) וסרק בחזרה אל מעבר לאותו אזור. בשל שיטה זו שתי עוקפת, מצב מעלית, בהשוואה לאמנון וFM-KPFM, לוקח את הזמן הארוך ביותר לרכישת תמונה. העלאת הקצה מהמשטח מבטיחה כי es F רק ארוך טווח נמדד. כמו כן, לדבר לחצות בין מדידות פוטנציאל טופוגרפיה ופני שטח decoupled על חשבון הרזולוציה רוחב מוגבר ורגישות.

AM-KPFM משפר רזולוציה רוחב ורגישות באמצעות דו-תדרים למדוד טופוגרפיה מדגם ופוטנציאל פני השטח (סריקה חד-פס) 14 בו-זמנית. במצב AM, השלוחה נעה מכאנית, בדרך כלל 5% מתחת לתדר התהודה הראשון שלה (ו 0), ונע חשמלי (through V AC) בתדר התהודה השני שלה (ו 1). שינויים במשרעת של f ליתרון 0 לדור של נתונים טופוגרפיים, ואילו שינויים במשרעת של f 1, כתוצאה משינויים בes F וCPD V, לתת נתוני מדידת פוטנציאל פני השטח. f 0 וf 1 של שלוחה מופרדים על ידי תדרים משמעותיים ואנרגיות שלאותת הצטלבות ממוזערת 14. האלקטרוניקה ראש התיבה (HEB) של AFM מפרידה את שני האותות לתת שני טופוגרפי ונתוני השטח פוטנציאליים בו-זמנית בסריקה אחת. FM-KPFM משפר רזולוציה עוד יותר מאשר AM-KPFM על משטחים ביולוגיים 14. FM-KPFM פועל בצורה שונה מאשר AM-KPFM בכך שהיא מודדת את השינויים בשיפועי כוח אלקטרוסטטי ולא בכוח אלקטרוסטטי (es F) 15. כמו מצב בבוקר, מצב FM מנצל כפולים תדרים וSinglמנגנון סריקת דואר לעבור כדי להשיג טופוגרפי ונתוני השטח פוטנציאליים בו זמנית 14. במצב FM, השלוחה נעה מכאנית בf 0 ונעה חשמלי בתדר שונה נמוך (ו mod, 1 בדרך כלל - 5 kHz). על אינטראקציות אלקטרוסטטיות, f 0 וf תערובת mod לייצר להקות צד f mod ו 0 ±. sidebands אלה רגישים מאוד לשינויים בכוח אלקטרוסטטי, ויכול להיות מופרד מf 0 דרך HEB של AFM. מאז FM-KPFM מודד שינויים בשיפועי כוח אלקטרוסטטי, צורת שיא הטיפים והתחזוקה / שלמותה לשחק תפקיד קריטי בשטח כולל רזולוציה פוטנציאל 14, 15. במשטח רזולוציה פוטנציאלית באמצעות AM ומצבי FM הם בטווח של 1 ננומטר רוחבי 14 -16. יש לציין כי ההדמיה KPFM ניתן לעשות זאת בנוזלים שאינם קוטביים, ולאחרונה, הוכח להיעשות ב( <10 מ"מ) נוזלי קוטב נמוכים יוניים (במצבים פתוח לולאה KPFM שאינו דורשים משוב הטיה, מייתר את היישום של הטיה DC) כגון מים MilliQ; עם זאת, ההדמיה KPFM טרם נעשתה על תאי חיים בפתרונות קוטביים 17-20. אתגרים נוספים הקשורים להדמית SP בנוזל הוא שפתרונות נפוצים לתאי שמירה (כלומר, שנאגרו מלוח פוספט) יש ריכוז גבוה של יונים ניידים, מה שיוביל לתגובות Faradaic, דינמיקת מטען נובע מהטיה, ודיפוזיה יון / חלוקה מחדש 20. כך, לניסוי זה, מדידות נלקחו מתאי MRSA מיובשים ומתים על משטחי poly-L ליזין פונקציונליות נירוסטה וזהב בתנאי סביבה. הדמיה יכולה להתבצע בתנאי אוויר או ואקום על דגימות ביולוגיות שכבר מיובש או משותקת על משטחים 20 בעבר. תנאי לחות גם הוכחו להשפיע הדמיה KPFM של משטחים 6.

במחקר זה, אנחנו עובדים FM-KPFMוAFM כדי לבחון את התפקיד של SP על הקובץ המצורף של methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) למשטחי נירוסטה וזהב פונקציונליות poly-L- ליזין. MRSA לאחרונה צבר מעמד רב-סמים (MDR) "superbug" עמיד בשל התנגדות טבעית שנבחרה לאנטיביוטיקה β-לקטם רב וcephalosporins 21. זיהומי MRSA הם עכשיו יותר מאתגר, קשים, ואימתניים לטיפול, שהובילו לשימוש באנטיביוטיקה חריפה יותר כגון vancomycin או oxazolidinones שיש רמות גבוהות יותר רעילות בבני אדם, ולכן אינו יכול לשמש כטיפול לטווח ארוך 22. נירוסטה נבחרה בשל הרלוונטיות רפואיות שלה ושימוש נפוץ כחומר במחטים תת עורי, סירי לילה, ידיות דלתות, כיורים, וכו 'הזהב שימש כמתכת השוואתית. FM-KPFM נוצל כדי לבחון אם SP קרום חיידקים משתנה על קובץ מצורף למצעים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת כלי הזכוכית ותרבויות

  1. לפני שתמשיך עם הניסוי הזה, להכין אגר 5 כבשים% דם (SBA) צלחות לגידול MRSA. דגירה צלחות SBA למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר פרק זמן זה, מושבות אחת, מבודדות היטב צריכה להיות נוכחת כדי לשמש לחיסונים שלאחר מכן לתקשורת נוזלית. חנות מפוספסת צלחות SBA עם מושבות אחת בC ° 4 ל1-2 חודשים.
    הערה: הצלחות אגר דם של הכבשים באות בחבילות שהוכנו מראש, המכילות בין 20 - 25 צלחות המבוססות על היצרן, ובדרך כלל מורכבת מבסיס אגר סויה tryptic עם התוספת של 5% w / דם הכבשים v.
  2. הפוך 500 מיליליטר של מרק tryptic סויה (TSB) בתוספת גלוקוז 1% ו -0.1% NaCl. אחרי זה, לאסוף ולנקות 2 מבחנות זכוכית. אם עפעפי autoclavable שאינם זמינים למבחנות, להשתמש בנייר אלומיניום ככובע. החיטוי TSB ומבחנות יחד עם קופסא הטיפים פיפטה 1 מיליליטר.
  3. תחת ממשלת בטיחות ביולוגית או בסמוך ללחמניות en מבער, פיפטה 5 מיליליטר של העבר autoclaved TSB למבחנות autoclaved. להיות זהיר כדי להבטיח שמספיק זמן ניתנה כדי לאפשר לTSB ומבחנות להתקרר לטמפרטורת חדר. מצלחת 5% SBA מפוספס בעבר, לחסן מושבה אחת ל -6 מיליליטר מרק TSB. אחד יכיל MRSA, והמבחנה השנייה תשמש כביקורת שלילית על מנת להבטיח סטריליות.
  4. קח מבחנות TSB מחוסנות ולמקם אותם בחממה הדדית למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס וב 200 סל"ד. לאחר פרק זמן זה התפתחותם של חיידקים צריכה להיות ברורה במבחנת MRSA ואילו צמיחה לא הייתה צריכה להתרחש במבחנת שליטה.
  5. קח 1 מיליליטר מתרבות 24 שעות ופיפטה לתוך 6 מיליליטר של TSB הטרי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות ב 200 סל"ד.
  6. פיפטה 1 מיליליטר של תת-תרבות 6 שעות לתוך צינור 1.5 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 850 x גרם. להסיר supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של H 2 O. deionized צנטריפוגה, לחזור, ומחדש להשעות.

"Jove_title"> 2. ניקוי וההרכבה של פלדת אל-חלד ומצעי זהב

  1. קח נירוסטה ודיסקי מדגם AFM הזהב (20 מ"מ ו -10 מ"מ בקטרים ​​בהתאמה) ולנקות כל צד עם 5 מיליליטר של H 2 O. deionized להחזיק דיסקי מדגם ביד הדומיננטית עם מלקחיים ולהשתמש סובדומיננטה היד לפיפטה 5 מ"ל בכל צד של דיסק המדגם. לאחר שטיפת שני הצדדים, דיסקי מדגם המקום בכוס המכילה 20 מיליליטר של H 2 O deionized ואחריו sonication דקות 1.
  2. לאחר מלקחיים שימוש sonication להסיר דיסקי מדגם מהכוס. הנח את הדיסקים, כך שהם מתכופפים בזווית 60 מעלות כנגד הקצה של צלחת פטרי פתוחה על מגבת נייר. השתמש המכסה של צלחת פטרי כדי לכסות את דיסקי הייבוש. בואו דיסקים להתייבש לחלוטין לפני שימשיכו. זמן הייבוש יכול להשתנות בין 4-8 שעות.
  3. לאחר יבש, להשתמש במלקחיים כדי למקם את דיסקי מדגם לתוך צלחת פטרי.
    1. לחלופין, functionalize המשטחים של דיסקי מדגם עם כל חומר (למשל, קולגן, hyaluronan, ננו-חלקיקי כסף, וכו ').
    2. לצורך ניסוי זה, להשתמש בפולי-L ליזין למעייל פני המצע. לפולי-L ליזין functionalization, פיפטה 200-400 μl של 0.1% פולי-L ליזין (בH 2 O) על גבי דיסקי מדגם, ולתת דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר בצלחת פטרי.
    3. אחרי שעה 1, להשתמש במלקחיים כדי להחזיק את דיסק המדגם, ולשטוף עם 1 מיליליטר של H 2 O. deionized בואו יבש על מגבות נייר כמתואר בשלב 2.2.
  4. קח 2x מחדש מושעה תאים נשטפו וצלחת 200-400 μl על דיסקי מדגם בתוך ארון בטיחות ביולוגי. אם דיסקי מדגם מצופים בpoly-L- ליזין, דגירה של 0.5 שעות בטמפרטורת חדר.
  5. לאחר הדגירה של תאים על דיסקי מדגם, לשטוף דיסקי מדגם בעדינות עם 1 מיליליטר של H 2 O. deionized בואו דיסקי ייבוש למשך הלילה לפני ההדמיה.

3. KPFM הדמיה

הערה: לצורך ניסוי זה,להשתמש סדרת Agilent 5500 ILM-AFM.

  1. כדי להתחיל AFM, להפעיל יחידת מחשב יחד עם בקר HEB וMAC III של AFM. תוכנת הדמיה AFM הפתוח (לדוגמא, PicoView של Agilent). הקפד תחילה כדי לבחור ACAFM או לפי הייעוד הנכון הוא על AFM הדמיה במצב לסירוגין-קשר.
  2. בעזרת המלקחיים AFM ביד הדומיננטית, ומחזיק את בעל קליפ קפיץ פתוח עם סובדומיננטה היד, למקם שלוחה KPFM לראש-חתיכה. היזהר בעת טיפול והעברת הראש-חתיכת AFM לAFM כיחידה זו (לפחות על 5500 ILM-AFM) מכילה יחידת גביש piezo השבירה ששולטת X, Y, Z וdirectionalities סריקה.
    הערה: זיזי KPFM משמשים במקרה זה היו DPE מוליך Mikromasch זיזים (רעש נמוך) עם תדר תהודה ממוצע של 80 קבועי kHz והאביב של 2.7 N / m. זיזים עם תדרי תהודה אלה וקבועים קפיץ נבחרו בשל קלות שימוש שלהם.גם זיזים עם קבועי קפיץ גדולים יותר ותדר תהודה גבוה יותר יכולים לשמש להדמיה.
  3. לטעון בזהירות את הראש-פיסה לAFM ולחבר את החוטים המתאימים (במקרה זה שני חוטים צריכים להיות מחוברים לחשמל ב: אור הלייזר ומנוע מעלית שלב).
  4. יישר את הלייזר על הקצה של שלוחה. יחידות מסוימות מכילות פונקציונלי מצלמה המאפשרת ליישור קל. אם פונקציונלי מצלמה הוא לא מקיים בAFM, ליישר על קצה שלוחה כמתואר הבא:
    1. סובב את הכפתור בכיוון השעון קדימה ואחורה כדי להעביר את לייזר overtop שבב שלוחה. כאשר הלייזר מגיע לשבב זה יהיה חסום ולא יהיה עוד לעין. לפנות רק את הידית כמה פעמים.
    2. סובב את הידית הקדמית אל הגב נגד כיוון השעון עד לנקודת הלייזר מופיעה שוב. הלייזר הוא עכשיו על הקצה של השבב.
    3. סובב את הידית מהשמאל לימין כדי למקם את הלייזר על שלוחה. כמו הלייזר עובר על שלוחתו תיעלם ותופיע מחדש iרצף מהיר n. כתם הלייזר צריך להיות גלוי בכיסוי הזכוכית החלבית שבו יחידת photodiode מאוחר יותר לשבת.
    4. סובב את הכפתור אל הגב מול נגד כיוון השעון כדי להעביר את הנקודה במורד שלוחה לכיוון הקצה עד הנקודה על הזכוכית החלבית נעלמה.
    5. הפעל כפתור בכיוון השעון אל הגב מול רק מעט על מנת למצב את הלייזר כך שהוא פשוט יושב על קצה שלוחה. כתם הלייזר יופיע מחדש בזכוכית החלבית.
      הערה: זוהי שיטת מיצוב הלייזר לזיזי קרש הקפיצה. לזיזים משולשים, תהליך היישור שונה במקצת.
  5. ברגע שהליזר מיושר, להחזיק את מנוע מעלית שלב במצב "הפתוח" במשך 10 שניות כדי להבטיח מספיק מקום בין שלוחה והמדגם בעת צירוף המדגם לAFM.
  6. הנח מדגם על הבמה מדגם KPFM. קרקע המדגם באמצעות חוטי נחושת. חבר את החוטים המתאימים מAFM לבמה המדגם. חבר שלכאחוז לAFM. ברוב המקרים השלב מוחזק במקום באמצעות מגנטים.
  7. בתוכנת AFM, מנגינת שלוחה ולאחר מכן להתחיל גישה של קצה שלוחה למדגם. ודא שזמן ההסדרה מוגדר על לא יותר מ 10 אלפיות שני, וכי מהירויות גישה לא יעלו על 2.0 מיקרומטר / sec כדי למנוע נזק קצה.
  8. ברגע שקצה שלוחה הוא על פני השטח המדגם, בחר גודל חלון הדמיה ואזור הדמיה אידיאלי. לייעל רווחים אני וP יחד עם הנקודה להגדיר שלוחה כך שהדמיה טופוגרפית היא מותאמת.
    1. ברגע שהדמיה טופוגרפית היא מותאמת, להפעיל מודול KPFM (או FM או AM מצב; כאן, להשתמש במצב FM). יש לציין כי ההדמיה KPFM היא מאוד מאתגרת מחוץ לחלון ההדמיה x 5 מיקרומטר 5 מיקרומטר. כמו כן, להדמית KPFM אופטימלית, להשתמש ברזולוציה 512 x 512 עם מהירויות איטיות סריקה (0.02-0.05 קווים / sec).
  9. להגדרות FM-KPFM (לא ACAFM הגדרות), להגדיר את כונן אחוזים בין 5 - 10%. הגדר את fr שלוחהequency בין 1-5 kHz עם רוחב פס של 2 קילו-הרץ. הגדר אני ורווחי P להגדרות FM-KPFM 0.3%.
    1. להשתנות רוחב פס של אות ואני ורווחי P בין משטחי מדגם. כדי לייעל את ההדמיה SP, נוסף להתאים רוחב פס של אות ואני ורווחים P כדי להשיג תמונות אופטימליות. הטווח המומלץ של רווחים אני וP הם 0.22-0.35%.
  10. עיבוד וניתוח תמונות שנאסף KPFM באמצעות תוכנת עיבוד תמונת פוסט-לאסוף נתונים SP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת למדוד SP באמצעות KPFM מסתמכת על העיקרון ששני פני השטח המדגם וקצה שלוחה הם מוליך במידה מסוימת. נירוסטה וזהב פעלו משטחים מוליכים כמו שאליה צורפו MRSA. תמונות KPFM נלקחו 15 תאי MRSA על שני המשטחים עם 512 x 512 החלטות, ועם אזורי סריקה נעים בין 5 x 5 מיקרומטר עד 10 x 10 מיקרומטר. הסריקה בוצעה במהירויות קו שנעו בין 0.02 קווים / sec ל0.05 קווים / sec. לכן, עם 512 נקודות נתונים שנאספו לקווי קו ולסרוק 512, פעמים סריקה נעו בין 2.84 שעות לשעה 7.11. הסוגים של תמונות שנאספו ניתן לראות <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KPFM הועסק כטכניקה חדשנית לקבלת נתונים חשמליים פני השטח. זה בדרך כלל נעשה שימוש כאמצעי לבחינת חלוקת תשלום בכימיה וברק לאחרונה החל להיות מיושם לחקר מערכות ביולוגיות במייקרו וננו-מאזניים. מהנתונים שנאספו מצאנו כי חיידקים לא הופיעו לצרף בקלות לניקוי משטחי נירוסטה וזהב, גם לאחר 3 שעות של הדגירה סטטי. משטחים פונקציונליות פולי-L ליזין הראו קובץ מצורף חיידקים מהירים אחרי 30 דקות. פעמים דגירה ארוכות יותר של חיידקים על משטחים פונקציונליות הובילו לתא צפיפות על משטחי מדגם, ותמונות טופוגרפיה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים מקרב לב למועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה, למשרד המחקר והחדשנות של אונטריו ולקרן קנדה לחדשנות על מימון מחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5500ILM כוח אטומי מיקרוסקופAgilent Technologies#N9435S
AFM/STM דיסקי דגימת מתכתTED PELLA, INC.#16219דיסקים לדוגמה מנירוסטה
בדיקות SPM מוליכות DPE (רעש נמוך)Mikromasch#HQ:DPE-XSC11ישנם 4 שלוחים מצופים Pt לכל שבב. השתמשנו בשלוחה B לניסויים.
דיסקי דגימת מתכת מצופים זהב PELCO AFM/STMTED PELLA, INC.#16218-Gדיסקים לדוגמה זהב
תוכנת PicoViewAgilent Technologies#N9797B5500ILM תוכנת הדמיה של מיקרוסקופ כוח אטומי
Pico Image Software (Pico Image Basic)Agilent Technologies#N9797AU-1FP5500 ILM מיקרוסקופ כוח אטומי לאחר עיבוד תמונה
תוכנה Scilogex D3024 מיקרו-צנטריפוגה במהירות גבוההתומאס סיינטיפיק#91201513צנטריפוגה המשמשת בשלבי שטיפת תאים להפרדת תאים (גלולה) ממדיה
Trypticase Soy Agar עם 5% דם כבשיםBD#221261צלחות מוכנות מראש
מרק סויה טריפטיBD#257107מגיע כאבקה יבשה. הוראות כיצד להכין לעלות על המיכל.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
  2. Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
  3. Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
  4. Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
  5. Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
  6. Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
  7. Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
  8. Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
  9. Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
  10. Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
  11. Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
  12. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
  13. Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
  14. Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
  15. Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
  16. Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
  17. Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
  18. Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103(2014).
  19. Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
  20. Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871(2014).
  21. Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
  22. Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
  23. Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
  24. Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
  25. Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
  26. Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Bacterial AdhesionAtomic Force MicroscopyMethicillin resistant Staphylococcus aureusStainless Steel SubstrateGold SubstrateContact Potential DifferenceTopographical ImagingElectrical Characterization

מאמרים קשורים