כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו מאפשרת למניפולציה במבחנה של neurogenesis למבוגרים ומאפשרת היישום הישיר של סוכנים תרופתיים להיפוקמפוס התרבותי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה
במאמר זה
סיכום
תקציר
כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס במוח המכרסם באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו שומרת על המורפולוגיה הטופוגרפית האופיינית של ההיפוקמפוס, ובמקביל לאפשר יישום ישיר של סוכנים תרופתיים לgyrus המשונן בהיפוקמפוס הפיתוח. בנוסף, יכולה להישמר תרבויות פרוסה לתקופה של עד 4 שבועות ובכך, לאפשר אחד כדי ללמוד את תהליך ההבשלה של תאי עצב גרגר יילוד. תרבויות פרוסה לאפשר מניפולציה תרופתית יעילה של פרוסות בהיפוקמפוס ואילו בניכוי משתנים מורכבים כגון אי ודאויות הקשורות למיקום האנטומי העמוק של ההיפוקמפוס, כמו גם את מחסום דם המוח. מסיבות אלה, אנו מבקשים לייעל את התרבויות פרוסה organotypic במיוחד עבור מחקר neurogenesis לאחר לידה.
מבוא
נוירוגנזה של מבוגרים בהיפוקמפוס של יונקים מייצגת דוגמה יוצאת דופן ליכולת המולדת של המוח להסתגל ולפלסטיות. תאי גרגיר משוננים (DGCs) נוצרים ממאגר מתחדש של תאי אב עצביים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס, שהוא אחד משני האזורים הנוירוגניים המאופיינים היטב כיום במוח היונקים, ונחשב לחשוב במיוחד ללמידה וזיכרון. ההיפוקמפוס הוא חלק מהמערכת הלימבית ויש לו מיקום עמוק בתוך מוח היונקים, מה שהופך אותו למטרה קשה למניפולציה פרמקולוגית מדויקת. בנוסף, נוירוגנזה חריגה הייתה מעורבת במצבים, כגון אפילפסיה, סכיזופרניה ומחלת אלצהיימר, מה שעורר עניין בהבנת השפעתם של גורמים פרמקולוגיים שונים במהלך ההתבגרות וההישרדות של נוירונים שזה עתה נולדו. ההבחנה בין נוירוגנזה לאחר לידה לנוירוגנזה למבוגרים מטושט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל נהלי בעלי החיים תאמו את הנחיות בריאות ורווחת בעלי החיים של החוג לרפואה באוניברסיטת טורונטו.
1. הכנת Slices בהיפוקמפוס
- לעקר את המכשירים הבאים באמצעות החיטוי היבש ב 125 ° C: ידית אזמל (# 3) (2), מלקחיים דפוס רגילים, (1), מספריים מבתר קטנים גדולים (זווית לצד) (1), כפית מיקרו (כף ושטוחה קצות מרית) (1), מיקרו-מריות (מעוגלות ומעוגלות קצוות מחודדים) (2), מכחול דק (1), אש מלוטשת פיפטה פסטר (2), ריבועי גזה, 2 x 2 אינץ '(5).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
קביעה אם תרבויות organotypic תהיה מתאימות למחקר neurogenesis למבוגרים נדרש כי הם לספק שני קריטריונים עיקריים: 1) שפרוסות לשמור על תכונות מורפולוגיות אופייניות לפרוסות בהיפוקמפוס לאחר 10-21 ימים במבחנה (DIV), ו -2) שניתן לכמת DGCs היילוד תוך שימוש בטכניקות immunohistochemical סטנדרטית המועסקות בדרך כלל במחקר neurogenesis למבוגרים. בנוגע לקריטריון הראשון, איור 1 א ו -1 B להדגיש את המורפולוגיה בהיפוקמפוס השתמרה. תכונות אופייניות כגון gyrus ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעקבות ממשל CldU (או BrdU), ניתן לבחור את ציר הזמן של יישום של סוכנים תרופתיים למקד DGCs יילוד בחלונות התפתחות מסוימים. לדוגמא, סוכן היפותטי ניתן ליישם במהלך הזרקת שבוע שלאחר CldU השני, שמוצע בקנה אחד עם הגיל של נוירונים בוגרים שנמצאים בשלב ההתפתחותי שבו GABA הוא depolarizing. מחקרים עתידיים תוך שימוש בפרוטוקול זה יכול להתאים את הסוכן התרופתי וחלון חשיפה ל" חייט "הגישה לשאלת הניסוי הספציפית של עניין.
קר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר MOP 119271 ל-JMW על ידי המכון הקנדי לחקר הבריאות. המחברים רוצים להודות לגב' יאו פאנג טאן על הסיוע הטכני יוצא הדופן שלה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 5-כלורו-2'-דאוקסיורידין (CldU) | MP ביו-רפואי | 105478 | מסוכנות, מסרטנות |
| , קוטר 30 מ"מ, 0.4 ומיקרו; m גודל נקבוביות | תרמו מדעי | 140660 | ציפוי דלתא Nuclon על תוספות אלו מספק הידבקות רקמות טובה יותר ומשפר את איכות הפרוסה. |
| צינורות צנטריפוגה חרוטיים (סטריליים) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| מספריים דיסקטור (בזווית לצד) | כלי מדע עדין | 14082-09 | |
| מינימום בינוני חיוני (MEM) | Gibco | 11095; נוזל | אחסן ב-4 מעלות; C |
| Eclipse Ni-U מיקרוסקופ פלואורסצנטי | דבק ניקון | ||
| לרקמות | דבק Krazy | KG585 | השתמש בכמות מינימלית של דבק כדי להשיג הידבקות מכיוון שכל רקמה שנחשפה לדבק לא תהיה שמישה עבור IHC. |
| האנק' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) (500 מ"ל) | Gibco | 14025-092 | חנות ב-4 מעלות; C |
| סרום סוסים מושבת בחום (500 מ"ל) | Gibco | 16050-122 | מכינים 50 מ"ל ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות; C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| פיפטות זכוכית מעוצבות (החלק התחתון של פיפטת פסטר הוסר והקצה הוחלק בלהבת בונסן ) | |||
| צלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) ו-(60 מ"מ x 15 מ"מ) | המותג פישר | FB0875712 ו-FB0875713A | |
| 11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| ידית אזמל #3 | בסדר Science Tools | 10003-12 | |
| פיפטות סרולוגיות | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| מלקחיים דפוס סטנדרטי | Fine Science | Tools 11000-12 | |
| מסנן ואקום סטרילי | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| מספריים כירורגיים | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| יחידת סינון מונעת מזרק | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| קוצץ רקמות עם שלב נע | Stoelting& נ.ב.פ; | 51425 | |
| מברשת |
מקורות
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
