הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

12.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52353

⸱

4 במרץ 2015

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, 3Department of Education and Research, Taipei City Hospital

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו מאפשרת למניפולציה במבחנה של neurogenesis למבוגרים ומאפשרת היישום הישיר של סוכנים תרופתיים להיפוקמפוס התרבותי.

תקציר

כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס במוח המכרסם באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו שומרת על המורפולוגיה הטופוגרפית האופיינית של ההיפוקמפוס, ובמקביל לאפשר יישום ישיר של סוכנים תרופתיים לgyrus המשונן בהיפוקמפוס הפיתוח. בנוסף, יכולה להישמר תרבויות פרוסה לתקופה של עד 4 שבועות ובכך, לאפשר אחד כדי ללמוד את תהליך ההבשלה של תאי עצב גרגר יילוד. תרבויות פרוסה לאפשר מניפולציה תרופתית יעילה של פרוסות בהיפוקמפוס ואילו בניכוי משתנים מורכבים כגון אי ודאויות הקשורות למיקום האנטומי העמוק של ההיפוקמפוס, כמו גם את מחסום דם המוח. מסיבות אלה, אנו מבקשים לייעל את התרבויות פרוסה organotypic במיוחד עבור מחקר neurogenesis לאחר לידה.

מבוא

נוירוגנזה של מבוגרים בהיפוקמפוס של יונקים מייצגת דוגמה יוצאת דופן ליכולת המולדת של המוח להסתגל ולפלסטיות. תאי גרגיר משוננים (DGCs) נוצרים ממאגר מתחדש של תאי אב עצביים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס, שהוא אחד משני האזורים הנוירוגניים המאופיינים היטב כיום במוח היונקים, ונחשב לחשוב במיוחד ללמידה וזיכרון. ההיפוקמפוס הוא חלק מהמערכת הלימבית ויש לו מיקום עמוק בתוך מוח היונקים, מה שהופך אותו למטרה קשה למניפולציה פרמקולוגית מדויקת. בנוסף, נוירוגנזה חריגה הייתה מעורבת במצבים, כגון אפילפסיה, סכיזופרניה ומחלת אלצהיימר, מה שעורר עניין בהבנת השפעתם של גורמים פרמקולוגיים שונים במהלך ההתבגרות וההישרדות של נוירונים שזה עתה נולדו. ההבחנה בין נוירוגנזה לאחר לידה לנוירוגנזה למבוגרים מטושטשת ומחקרים קודמים הראו כי מאפיינים רבים של התפתחות עצבית in vivo בתקופה המוקדמת שלאחר הלידה ובבגרות דומים25. כאן אנו שמים דגש על נוירוגנזה לאחר הלידה ומציעים יישומים אפשריים לנוירוגנזה של מבוגרים.

תרביות פרוסות אורגנוטיפיות מספקות שיטה יעילה במבחנה לחקר תכונות פיזיולוגיות שונות של ההיפוקמפוס של היונקים. ניתן לסכם את הערך של תרביות פרוסות שהוכנו ממוחות מכרסמים בשלוש תכונות עיקריות: 1) הפרוטוקול פשוט ודורש חומרים זמינים; 2) תרביות פרוסות מאפשרות מחקרים פרמקולוגיים המבטלים משתנים מורכבים כגון המיקום האנטומי העמוק של ההיפוקמפוס ועוקפים את מחסום הדם-מוח1; ו-3) המבנה המאופיין היטב של ההיפוקמפוס והמעגל התלת-סינפטי נשמר2. חוקרים קודמים השתמשו בתרבית ההיפוקמפוס האורגנוטיפית כדי לחקור התפתחות סינפטית ופיזיולוגיה3,4, גליוגנזה5-7, נזק מוחי איסכמי8,9, הגנה עצבית ותיקון עצבי10-12 כמו גם אפילפסיה13-15. תרביות הפרוסות יכולות גם לספק מערכת מודל שימושית המאפשרת ניטור של התפתחות התאים בשילוב עם תיוג תאים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או סמנים חיוניים אחרים.

תרביות פרוסות שימשו בעבר גם לחקר נוירוגנזה בהיפוקמפוס לאחר הלידה16-19, אך גורם חשוב אחד ברוב המחקרים הללו הוא הניוון המאופיין היטב הנובע מהשתלת רקמה מבעלי חיים בוגרים לאחר כשבועיים במבחנה20,21. מסיבה זו, תרביות פרוסות מוכנות בדרך כלל מעכברים או גורי חולדות מוקדמים לאחר הלידה (P5-P10), מה שמנצל את הכדאיות המשופרת של רקמת מוח מוקדמת לאחר הלידה לתרבית22. בעוד שמחקרים קודמים הראו כי ההיפוקמפוס המוקדם לאחר הלידה וההיפוקמפוס הבוגר שונים בכל הנוגע לפיזיולוגיה סינפטית ולביטוי של תת-סוגים נוירונים ספציפיים23,24, יש שימור משמעותי של תוכנית ההתפתחות הכוריאוגרפית שתאי גרגיר משוננים שזה עתה נולדו ממשיכים במהלך ההתבגרות25. בנוסף, מחקרים אחרונים הציעו כי המאפיינים הפיזיולוגיים של DGCs שזה עתה נולדו בתרבית דומים מאוד לנוירונים לא בשלים בהכנת פרוסת ההיפוקמפוס החריפה16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל נהלי בעלי החיים תאמו את הנחיות בריאות ורווחת בעלי החיים של החוג לרפואה באוניברסיטת טורונטו.

1. הכנת Slices בהיפוקמפוס

  1. לעקר את המכשירים הבאים באמצעות החיטוי היבש ב 125 ° C: ידית אזמל (# 3) (2), מלקחיים דפוס רגילים, (1), מספריים מבתר קטנים גדולים (זווית לצד) (1), כפית מיקרו (כף ושטוחה קצות מרית) (1), מיקרו-מריות (מעוגלות ומעוגלות קצוות מחודדים) (2), מכחול דק (1), אש מלוטשת פיפטה פסטר (2), ריבועי גזה, 2 x 2 אינץ '(5).
  2. כאשר סטרילי, לשים את המכשירים למכל סטרילי ולשמור מכוסה עד לשימוש. מייד לפני הנתיחה, לטבול את הכלים בפתרון אתנול 70%.
  3. הכן צלחת תרבות 6 היטב עם להכניס את התרבות לפני תחילת הליך הנתיחה על ידי הוספת 1 מיליליטר של מדיום התרבות / טוב ואחסון הצלחת בחממה ב 35 ° Cnd 5% CO 2.

2. מסדרים כלים Dissection בשכונת סטרילי זרימה למינרית

  1. לרסס את הזרימה למינרית עם אתנול 70% ולהסיר מכשירי נתיחה מעוקרות מאלכוהול. לאפשר למכשירים לייבוש בזמן מנוחה בצלחת פטרי סטרילי כדי למנוע מגע בין האלכוהול ורקמת המוח גזור.
  2. הפקדה 5-7 מיליליטר של תמיסה לנתח קר כקרח מעוקר ב 2 צלחות פטרי סטרילי גדולות. מנה אחת תהיה להירגע ולנקות את הראש (מלוכלך), והשני לקירור ושטיפת המוח גרף החוצה (הנקי). מניחים נייר סינון מעוקר באחד מהמכסים בצלחת פטרי ללנתח את המוח.
  3. מניחים נייר קטן, מעוקר מסנן באחד ממכסת צלחת פטרי הקטנה ללנתח את ההיפוקמפוס. הפקדה 3-5 מיליליטר של תמיסה לנתח קר כקרח מעוקר ב 2 מנות קטנות, סטרילי פטרי. צלחת אחת תחזיק היפוקמפוס גרף החוצה, אחד יחזיק חלקים בהפרדת סעיפים בהיפוקמפוסתחת מיקרוסקופ לנתיחה.
  4. הכן את מסוק הרקמה ידי מקליטה פיסת נייר סינון מעוקר לשלב הגזירה והרכבת סכין גילוח סטרילי. להרטיב את נייר הסינון עם פתרון לנתח מעוקר.
  5. תרסיס ביו-שקית נקייה עם אלכוהול ולמקם אותו בספסל נקי זרימה למינרית.

3. בהיפוקמפוס Dissection

  1. לרסס את גור החולדה P7 ספראג Dawley עם אתנול 70% מחוץ לספסל הנקי הזרימה למינרית ולערוף במהירות את בעל החיים באמצעות מספריים ניתוח סטרילי גדולים בתוך הזרימה למינרית הספסל. בואו ראש טיפה לפתרון לנתח קר כקרח באחד מצלחות פטרי.
  2. בצלחת פטרי, לשטוף את הדם ובמהירות להעביר את הראש לנייר סינון מעוקר, בצד הגחון למטה.
  3. באמצעות האזמל, לחתוך לאורך המשטח הגבי במטוס sagittal לחשוף את הגולגולת הבסיסית. חותך דרך העור, אך לא את עצם הבסיס, שהוא רך וקלות חדירה בחולדות של tבגילו. מניח בצד אזמל "מלוכלך" זה ולא להשתמש ברקמת המוח.
  4. בעזרת המספריים הקטנים המבתר (זווית לצד) ומלקחיים, לחתוך פתוחים הגולגולת לאורך תפר sagittal של הגולגולת לגבחת, הנקודה אנטומיים בגולגולת שבו תפר העטרה הוא הצטלבה בניצב על ידי תפר sagittal. שימוש במלקחיים כדי למשוך דשי גולגולת ומן קו האמצע של הגולגולת.
  5. הנח את כף מיקרו על החלק התחתון של המוח, מתחת לגזע המוח, כדי להרים בעדינות את המוח מהגולגולת. הרם את המוח כדי לחשוף את עצבי הראייה ונורת חוש הריח על פני השטח בסיס של מוח. חותך את המבנים האלה עם מספריים קטנים כדי לנתק את המוח באופן מלא מגולגולת. הסר ולהעביר את המוח שלם לצלחת פטרי הגדולה האחרות המכילה פתרון לנתח קר כקרח.
  6. שימוש בכפית מיקרו, להעביר את המוח למכסה צלחת פטרי קטן המכיל נייר סינון סטרילי. עם פיפטה פסטר סטרילי, יש לשטוף את המוח עם כמה טיפות של דיסsecting פתרון כדי לשמור על רקמה לחה.
  7. באמצעות סכין "נקי" אזמל לחתוך שתי ההמיספרות בנפרד. העבר את האונה השמאלית חזרה לצלחת פטרי גדולה עם כפית מיקרו ומניח את צד פיא חצי כדור למטה בפתרון לנתח קר כקרח לשימוש מאוחר יותר.
  8. הצג את הפנים המדיאלי של האונה הימנית ולזהות את fornix הקצה, להקה בולטת של חומר לבן בשולי המדיאלי של ההיפוקמפוס. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך sagittal דרך fornix, אבל דואג כי רק 0.5 סנטימטר של קצה האזמל יהיה מספיק כדי לחתוך את fornix.
  9. באמצעות 2 מיקרו-מריות, להסיר את ההיפוקמפוס הראשון מאונה ימנית על ידי הנחת יד-המרית ממש על גזע המוח והרמת הקליפה שמעליה עם יד שמאל המרית. רם בעדינות את הקליפה כדי לחשוף את החדר לרוחב ושטח המדיאלי של ההיפוקמפוס. קו מעוגל לבן, fimbria, צריך עכשיו להיות גלוי.
  10. יישר את העקמומיות של מרית עם Curvaטבעה של fimbria ולוחץ בעדינות המרית תחת fimbria. החלק את המרית עזבה ולרכב לאורך ציר מקורי, זנב ולאחר מכן הרם מרית בכיוון גב כדי להסיר היפוקמפוס.
  11. העבר את ההיפוקמפוס לצלחת 2 nd קטן פטרי עם פתרון לנתח קר כקרח. חזור על אותו ההליך באונה השמאלית כדי להסיר את ההיפוקמפוס השמאלי.
  12. בעזרת מרית מיקרו, להעביר בזהירות את hippocampi לבמה מסוק רקמות. מסדרים אותם צמודים ומקביל זה לזה וניצב לציר של להב המסוק. להשתמש במכחול כדי למקם את הרקמה ולהוסיף כמה טיפות של התמיסה לנתח על גבי hippocampi.
  13. חותכים את הרקמה ב400 מיקרומטר פרוסות בלי לעצור ולהסיר פרוסות בודדות (בדרך כלל הם לא ידבקו ללהב). אחרי כל ההיפוקמפוס נחתך, להשתמש במכחול כדי להעביר בעדינות את החלקים למנת 2 nd קטן פטרי עם פתרון לנתיחה.
  14. תחת מודעהissecting מיקרוסקופ, להפריד בזהירות את הפרוסות צף באמצעות amicro-מרית ומכחול.
  15. הסר את צלחת התרבות מוכנה מראש עם להכניס את התרבות מן החממה והמקום בזרימה למינרית.
  16. בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטשת, לצייר 4-5 פרוסות לפרוסות פיפטה והעברה למשטח הפסגה של קרום להכניס את התרבות. בשלב הבא, להתאים את המיקום עם מכחול ולהשאיר רווח בין חלקים בודדים והגבול של להכניס את התרבות.
  17. בעזרת פיפטה פסטר סטרילי, להסיר את הפתרון לנתח העודף ממשטח הפסגה של קרום.
    הערה: בעוד הסרת להימנע פתרון ציור סעיפי רקמות לתוך פיפטה. לחלופין, להשתמש פיפטה רגילה (P200 או P1000) עם טיפים פיפטה מעוקרים כדי להסיר פתרון לאט.
  18. מניחים את צלחת התרבות עם מדיום סרום המכיל תרבות והפרוסות בהיפוקמפוס בחזרה לתוך החממה ב 35 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    הערה: אם שיחות ניסויליצירת תרבויות מבעלי חיים רבים, לנקות ביסודיות את הספסל נקי הזרימה למינרית בין ניתוחים. חזור מכשירים לפתרון אלכוהול ולהחליף את כל פטרי-מנות, ניירות לסנן וסכיני גילוח סטרילי לפני לנתיחה שנייה.

4. האכלה ושמירת Organotypic Slices

  1. תרבויות Feed בספסל נקי זרימה למינרית סטרילי.
  2. בצע את ההאכלה הראשונה של הסעיפים בתרבית 2 ימים לאחר נתיחה. מדיום תרבות הישנה לשאוב באמצעות פיפטה זכוכית מעוקרת.
  3. השתמש 5 מיליליטר סטרילי פיפטה סרולוגיות להוסיף 1 מיליליטר של מדיום חדש, סטרילי, סרום המכיל את הבארות.
  4. בעדינות להחליף להכניס את התרבות ולטפל כדי להסיר בועות אוויר שאולי נוצרו מתחת לפני שטח קרום.
  5. לאחר שההנקה הראשונה, לשנות בינוני בכל יום אחר.

5. Slices רקמות דוגרים עם אנלוגים תימידין לייבל יילוד נוירונים

  1. על מנת ללמודההתבגרות והאינטגרציה של תאי גרגיר המשונן בהיפוקמפוס, דגירה את פרוסות organotypic עם אנלוגי thymidine, כגון Bromodeoxyuridine (BrdU) או Chlorodeoxyuridine (CldU). כאן, אנו משתמשים CldU בגלל מסיסותו הגבוהה בתמיסת מלח.
  2. לאחר 3DIV, להוסיף 1 μl של 10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות CldU מלוחים עד 1 מיליליטר של מדיום התרבות לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. אם BrdU משמש, לתקן את הריכוז להבדלים במשקל מולקולרי. הוסף בינוני עם CldU לבארות תרבות ודגירת רקמה עם CldU המכיל בינוני לשעה 2 ב 35 ° C.
  3. בעקבות 2 שעות של דגירה על 35 ° C, להסיר את מדיום CldU המכיל ולהחליף עם מדיום האכלה קבוע כדי לחדש את לוח הזמנים האכלה רגיל (שתואר לעיל).

6. רקמות קיבוע ואחסון

  1. הקמת ציר זמן ליישום טיפולים ותיקון דגימות רקמה לפני תחילת ניסויי תרבות (איור 2).
  2. בהודעה לנתיחה-יום שנקבע מראש, להכין את הדברים הבאים במנדף מעבדה: כוס 10-50 מיליליטר המכילה paraformaldehyde 4% (PFA) בופר פוספט (PBS); כוס ריקה למדיום התרבות הושלך; מלקחיים קטנים; ופיפטה 1000 מיליליטר עם טיפים חד פעמי.
  3. הסר את צלחת התרבות (שניות) מתא דגירה והעברה למנדף. הטה את הצלחת מוסיף גם הבודד עם מלקחיים. בשלב הבא, להשתמש פיפטה להסיר מדיום תרבות והעברה לכוס לרשות. הטה את צלחת התרבות בזווית כדי להבטיח שכל מדיום התרבות מוסר.
  4. לסיים הסרת בינונית לצלחת תרבות אחת בכל פעם. כאשר בינוני הוסר, להוסיף 1 מיליליטר של 4% PFA לכל תרבות היטב ולאטום היטב צלחת עם parafilm. חזור על פעולה עבור צלחות תרבות רבות כמו צלחות צורך והעברה למקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
  5. לאחר 24 שעות, להכין את הדברים הבאים במנדף: 10-50 כוס מיליליטר מכילה 0.1% יזידו הנתרן בPBS; ריקכוס לPFA מושלך (בהתאם לצעדי בטיחות כאשר השלכת חומרים רעילים); מלקחיים קטנים; ופיפטה 1000 מיליליטר עם טיפים חד פעמי.
  6. בצע את ההליך מתואר ב6.4 להוספת PFA, אבל להוסיף 1 מיליליטר של PBS עם אזיד הנתרן במקום. ברגע שהועבר לחלוטין, צלחות גם חותם לשימוש עתידי על ידי עטיפת קצוות בparafilm ואחסון במקרר ב 4 מעלות צלזיוס.

7. חתך רקמות לאימונוהיסטוכימיה

  1. לבצע רקמת חתך באמצעות vibratome. שורה של צעדים הבאים לסייע למקסם את התשואה של קטעי רקמה שמישים מתרבויות organotypic.
    הערה: מייד לאחר נתיחה וציפוי של פרוסות בהיפוקמפוס, יש רקמת עובי של כ 400 מיקרומטר. עם זאת, לאחר 2-3 שבועות בתא הדגירה, פרוסות רקמה תתחיל לשטח, וכתוצאה מכך עובי חלק אחרון של 150-300 מיקרומטר.
  2. הכן את הפריטים הבאים לרקמה תרבותית סעיף: # ב 11 אזמללְהַעֲמִיס ולהתמודד, צלחת פטרי זכוכית המכילה PBS קרח קר, מלקחיים מיקרו לנתיחה, ושלב גזירת vibratome נקי לעלות רקמות.
  3. השתמש באזמל כדי לחתוך בזהירות לאורך ההיקף של קרום להוסיף המעגלי כך שיכול להיות מנותק זה מדיור סוגר הפלסטיק. השאר שטח נרחב בין פרוסה התרבותית והאזמל.
  4. העבר את הקרום להוסיף המנותק לצלחת פטרי המכילה PBS. לאחר השטיפה בPBS, להשתמש במלקחיים כדי להעביר את הקרום לשלב ההרכבה vibratome.
  5. בשלב הבא, להשתמש באזמל לחסל קרום עודף סביב פרוסות תרבותיים ולחתוך משם חומר עודף כדי ליצור קצוות נקיים. צעד זה יבטיח את הקרום שטוח ובקלות יכול לדבוק במשטח החיתוך.
  6. מניחים 1-2 טיפות של דבק על הבמה חיתוך vibratome והתפשט באפילו שכבה באמצעות מחט 22 G. מורחים דבק לצורה מלבנית עם מקביל קצה הארוך ללהב החיתוך של vibratome. לבצע שלב זהבמהירות, כדי למנוע הדבקה מייבוש.
  7. שימוש במלקחיים כדי להעביר את הקרום המכיל גזוז פרוסות בהיפוקמפוס לשלב הגזירה ועדינות למקם את הקרום בדבק ולהבטיח שאין בועות אוויר.
  8. כדבק המגע מתייבש, להעביר את שלב vibratome עם הקרום מודבק חזרה לצלחת פטרי המכילה PBS. הכן את להב vibratome ויזיד הנתרן המכיל 48 צלחת גם לאחסן קטעי רקמה.
  9. השתמש בvibratome להפקה 30 מיקרומטר חלקים של הרקמה הפרוסה organotypic והעברה ליזיד הנתרן המכיל 48 צלחת גם לאחסון ומכתים immunohistochemical שלאחר מכן.
  10. עיין מראש קיימים פרוטוקולים ל26,29 מכתים immunohistochemical.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

קביעה אם תרבויות organotypic תהיה מתאימות למחקר neurogenesis למבוגרים נדרש כי הם לספק שני קריטריונים עיקריים: 1) שפרוסות לשמור על תכונות מורפולוגיות אופייניות לפרוסות בהיפוקמפוס לאחר 10-21 ימים במבחנה (DIV), ו -2) שניתן לכמת DGCs היילוד תוך שימוש בטכניקות immunohistochemical סטנדרטית המועסקות בדרך כלל במחקר neurogenesis למבוגרים. בנוגע לקריטריון הראשון, איור 1 א ו -1 B להדגיש את המורפולוגיה בהיפוקמפוס השתמרה. תכונות אופייניות כגון gyrus ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעקבות ממשל CldU (או BrdU), ניתן לבחור את ציר הזמן של יישום של סוכנים תרופתיים למקד DGCs יילוד בחלונות התפתחות מסוימים. לדוגמא, סוכן היפותטי ניתן ליישם במהלך הזרקת שבוע שלאחר CldU השני, שמוצע בקנה אחד עם הגיל של נוירונים בוגרים שנמצאים בשלב ההתפתחותי שבו GABA הוא depolarizing. מחקרים עתידיים תוך שימוש בפרוטוקול זה יכול להתאים את הסוכן התרופתי וחלון חשיפה ל" חייט "הגישה לשאלת הניסוי הספציפית של עניין.

קר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר MOP 119271 ל-JMW על ידי המכון הקנדי לחקר הבריאות. המחברים רוצים להודות לגב' יאו פאנג טאן על הסיוע הטכני יוצא הדופן שלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5-כלורו-2'-דאוקסיורידין (CldU)MP ביו-רפואי105478מסוכנות, מסרטנות
, קוטר 30 מ"מ, 0.4 ומיקרו; m גודל נקבוביותתרמו מדעי 140660ציפוי דלתא Nuclon על תוספות אלו מספק הידבקות רקמות טובה יותר ומשפר את איכות הפרוסה.
צינורות צנטריפוגה חרוטיים (סטריליים)Fisher Scientific14-432-22
מספריים דיסקטור (בזווית לצד)כלי מדע עדין 14082-09
מינימום בינוני חיוני (MEM)Gibco11095; נוזלאחסן ב-4 מעלות; C
Eclipse Ni-U מיקרוסקופ פלואורסצנטידבק ניקון
לרקמותדבק KrazyKG585השתמש בכמות מינימלית של דבק כדי להשיג הידבקות מכיוון שכל רקמה שנחשפה לדבק לא תהיה שמישה עבור IHC.
האנק' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) (500 מ"ל)Gibco14025-092חנות ב-4 מעלות; C
סרום סוסים מושבת בחום (500 מ"ל)Gibco16050-122מכינים 50 מ"ל ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות; C
KimwipesKimberly-ClarkeTW 31KYPBX
פיפטות זכוכית מעוצבות (החלק התחתון של פיפטת פסטר הוסר והקצה הוחלק בלהבת בונסן )
צלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) ו-(60 מ"מ x 15 מ"מ)המותג פישרFB0875712 ו-FB0875713A
11Fine Science Tools10011-00
ידית אזמל #3בסדר Science Tools10003-12
פיפטות סרולוגיותSorfa Medical Plastic Co.P8050
מלקחיים דפוס סטנדרטיFine ScienceTools 11000-12
מסנן ואקום סטריליThermo-Scientific565-0020
מספריים כירורגייםFine Science Tools14054-13
יחידת סינון מונעת מזרקMillipore-MillexSLGP033RS
קוצץ רקמות עם שלב נעStoelting& נ.ב.פ;51425
מברשת
תוספות תרבית תאים להבי אזמל של # צבע עם קצה דק

מקורות

  1. Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
  2. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  3. Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  4. Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
  5. Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
  6. Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
  7. Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
  8. Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
  9. Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
  10. Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
  11. Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  12. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  13. Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
  14. Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271(2012).
  15. Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
  16. Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
  17. Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
  18. Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Molecular And Cellular Neurosciences. 26 (2), 241-250 (2004).
  19. Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
  20. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  21. Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
  22. Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
  23. Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
  24. Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
  25. Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409(2006).
  26. McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
  27. Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
  28. Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
  29. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
  30. Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
  31. Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
  32. Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
  33. Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
  34. Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
  35. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
  36. Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
  37. Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תרבית פרוסות אורגנוטיפיתנוירוגנזה בהיפוקמפוסגיירוס דנטט (Dentate Gyrus)סימון סמנים מיטוטייםצביעה אימונוהיסטוכימיתחיתוך רקמותחיתוך בוויברטוםאנליזת ספירת תאיםמניפולציה פרמקולוגיתהבשלה פוסטנטלית של נוירונים
תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.