כאן אנו מתארים מבחן כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HPLC-MS/MS) בעל ביצועים גבוהים לכימות הטקרולימוס המדכא את מערכת החיסון בכתמי דם מיובשים באמצעות שלב ידני פשוט של משקעי חלבון וחילוץ עמודות מקוון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS
במאמר זה
סיכום
תקציר
Tacrolimus מעכב calcineurin הוא אבן הפינה של רוב פרוטוקולי טיפול מדכא חיסון לאחר השתלת איברים מוצקה בארצות הברית. Tacrolimus הוא תרופת מדד טיפולית צרה וכגון דורש ניטור תרופה טיפולי והתאמת מינון המבוסס על ריכוזי שוקת דם כולה. כדי להקל על תרופה טיפולית בית וניטור דבקות, האוסף של כתמי דם יבשים הוא מושג אטרקטיבי. אחרי אצבע מקל, המטופל אוסף טיפת דם על נייר סינון בבית. אחרי הדם מיובש, הוא ישלח למעבדה אנליטית שבי tacrolimus הוא לכמת באמצעות ספקטרומטר מסת כרומטוגרפיה הנוזלי-טנדם ביצועים גבוהים (HPLC-MS / MS) בשילוב עם צעד פשוט מדריך למשקעי חלבון ומיצוי טור מקוון.
לניתוח tacrolimus, דיסק 6 מ"מ אגרוף מהמרכז הרווי של נקודת הדם. נקודת הדם הומוגני באמצעות בלנדר כדורND אז חלבונים הם זירז עם מתנול / 0.2 M 4 ZnSO מכיל הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus. לאחר vortexing וצנטריפוגה, של supernatant 100 μl מוזרק לתוך עמודת חילוץ מקוונת ונשטפה עם 5 מיליליטר / דקה של 0.1 חומצה / אצטוניטריל פורמית (7: 3, v: v) עבור 1 דקות. מכאן והלאה, שסתום המיתוג מופעל וanalytes-סמוק בחזרה על טור אנליטי (ומופרד באמצעות 0.1% שיפוע חומצה / אצטוניטריל פורמית). Tacrolimus הוא לכמת במצב החיובי רב התגובה (MRM) באמצעות ספקטרומטר מסת טנדם.
Assay הוא ליניארי 1-50 ng / ml. שונות הבין-assay (3.6% -6.1%) ודיוק (91.7% -101.6%) כפי שהוערכו על 20 ימים עומדים בקריטריוני קבלה. התאוששות החילוץ הממוצעת היא 95.5%. אין לשאת על, הפרעות מטריצה ואפקטי מטריצה רלוונטיות. Tacrolimus הוא יציב בכתמי דם יבשים ב RT ובמעלות צלזיוס +4 לשבוע 1. דגימות שחולצו בautosampler יציבה במעלות צלזיוס +4 לפחות 72 שעות.
מבוא
Tacrolimus הוא immonosuppressant חזק 1-7 שיש לו מבנה macrolide 8 (איור 1). בשל חבר העמים - איזומרים טרנס של אגרות חוב CN הוא יוצר שתי rotamers בפתרון 9 שיכולים להיות מופרד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים שלב הפוך (HPLC) Tacrolimus הוא lipophilic ומסיס באלכוהול (מתנול: 653 גר '/ ל', אתנול: 355 g / L), פחמימנים הלוגנים (כלורופורם: 573 גר '/ ל') ואתר. זה במשורה מסיס בפחמימנים אליפטי (הקסאן: 0.1 גר '/ L ומים (pH 3:. .0047 G / L) 9 המולקולה אינה מכילה chromophore ומקסימום UV-הקליטה שלו הוא 192 ננומטר מעשי Tacrolimus באמצעו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגימות דם שזוהו-דה מאנשים בריאים היו מאוניברסיטת קולורדו בבית החולים (אורורה, קולורדו). השימוש בדגימות בנק דם-מזוהה דה ללימודי אימות, כמו גם להכנת כיול דגימות בקרת האיכות נחשבה "פטור" על ידי המועצה לביקורת קולורדו רב-המוסדית (COMIRB, אורורה, קולורדו).
1. הכנת הערות ופתרונות
- tacrolimus רכישה והתקן הפנימי D 2, 13 C-tacrolimus מהספקים המופיעים ברשימת חומרים.
- הכן פת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
chromatograms יון נציג של מדגם ריק, מדגם זינק בגבול התחתון של כימות ומדגם חולה מוצג באיור 3.
עקומות כיול
הגבול התחתון של זיהוי היה 0.5 ng / ml והגבול התחתון של כימות היה 1.0 ng / ml. חמישים ng / ml נבחר ככיל הגבוה ביותר כריכוזים גבוהים יותר צפויים להגיע במרפאת בנסיבות רגילות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אמנם, כאמור, את הרעיון של תרופה טיפולית ומעקב דבקות של tacrolimus מבוסס על כתמי דם יבשים הוא אטרקטיבי, יש אתגרים אנליטיים שהולכים מעבר לאלו שבדרך כלל קשורים לניתוח LC-MS / MS של tacrolimus בדגימות דם כל EDTA ורידים. אלה כוללים, אך לא רק, את העובדה שהמטריצה היא כל נימי הדם נספג חומר linters הכותנה של חומר כרטיס המסנן משמש כאן והנמוך נפח הדם (20 μl). עם זאת, ניתוח תפוקה גבוהה במעבדה מרכזית דורש שיטת חילוץ מהירה ואמינה כי תוצאות דגימות שאין הפרעות מטריצה ואפקטי מטריקס בשילוב עם a.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי HHSF223201310224C החוזים של מינהל התרופות הפדרלי של ארצות הברית (FDA) ומענק 1U01FD004573-01 של המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית / ה-FDA.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 | |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | ||
| תאי דם אדומים | בית החולים של אוניברסיטת קולורדו | W20091305500 V | |
| פלזמה | בית החולים של אוניברסיטת קולורדו | W2017130556300Q | |
| אצטון CHROMASOLV, HPLC ≥ 99,9% | סיגמא-אולדריץ' | 439126-4 ליטר | |
| אצטוניטריל אופטימה LC/MS, UHPLC-UV | תרמו פישר סיינטיפיק | A955-4 | |
| איזופרופנול 99.9%, HPLC | פישר סיינטיפיק | BP2632-4 | |
| מתנול אופטימה LC/MS | תרמו פישר סיינטיפיק | A452-4 | |
| אופטימה מים LC/MS, UHPLC-UV | תרמו פישר סיינטיפיק | W6-4 | |
| חומצה פורמית | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| אבץ גופרתי | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 | |
| 0.5 – 10 – l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 | |
| 1.5 מ"ל שפופרת Eppendorf | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| 10 – 100 – l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 | |
| 10 μ l קצות פיפט עם פילטר, נפטון סטרילי | BT 10XLS3 | ||
| 100 – 1,000 & מיקרו; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 | |
| 100 μ l קצות פיפט עם פילטר, נפטון סטרילי | BT 100 | ||
| 1,000 μ l קצות פיפט עם פילטר, סטרילי | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 ומיקרו; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 | |
| 2 מ"ל שפופרת Eppendorf | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| 20 – 200 ומיקרו; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 | |
| 20 μ l קצות פיפט עם פילטר, סטרילי | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μ l קצות פיפט עם פילטר | Multimax | 2938T | |
| 200 μ l קצות פיפט עם פילטר, סטרילי | Multimax | 2936J | |
| 50 מ"ל שפופרת פלקון | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μ l מוסיף לבקבוקוני HPLC | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 | |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 | |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 | |
| צנטריפוגה Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 | |
| מגבונים | חד פעמייםPDI | Q55172 | |
| בקבוקוני זכוכית, 4 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| בקבוקוני זכוכית, 20 מ"ל | כפפות Thermo Fisher Scientific | B7800-20 | |
| מותג ניטריל | טיטאן | 44-100S | |
| בקבוקוני HPLC, 9 מ"מ, 2 מ"ל, שקוף | Phenomenex | ARO- 9921-13 | |
| מכסים לבקבוקוני HPLC | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| מחט, 18 גרם 1.5 | דיוק גלישה | 305196 | |
| מתלה לצינורות אפנדורף | תרמו פישר מדעי | 03-448-11 | |
| מתלה לבקבוקוני HPLC | תרמו פישר סיינטיפיק | 05-541-29 | |
| חרוזי פלדה 0.9 – 2 מ"מ | הבא מתקדם | SSB14B | |
| קופסאות אחסון למקפיאים / מקררים | תרמו פישר Scientific | 03-395-464 | |
| מערבולת רב-צינורית סטנדרטית | VWR Scientific Products | 658816-115 | |
| נייר Whatman, 903 שומר חלבון ארה"ב 100/PK | GE Whatman | 2016-05 | |
| דגימה אוטומטית | CTC PAL | פאל. משאבה בינארית HTCABIx1 | |
| , משאבה בינארית Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| , Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| מסיר ואקום מיקרו, תנור עמודים Agilent 1260 | G13798 | ||
| Agilent 1290 עם 2 מצבים | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| תא עמודים תרמוסט עם שסתום מיתוג משולב עם 6 יציאות | HPLC של Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| , Zorbax XDB C8 (5 ומיקרו; גודל חלקיקים מ'), 4.6 · 12.5 מ"מ | Phenomenex | 820950-926 | |
| עמודה אנליטית HPLC, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 ומיקרו; גודל חלקיקים מ'), 4.6 · 150 מ"מ | Phenomenex | 993967-906 | |
| ספקטרומטר | |||
| API5000 MS/MS עם מקור TurboIonspray | AB Sciex | 4364257 | |
| תוכנת ספקטרומטריית מסה | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
מקורות
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
