הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

סיכום

מטרת פרוטוקול זה היא להתוות גישה כירורגית כדי לספק גישה ישירה לגרעין השבלול הגבי במודל עכברי.

תקציר

חקירת השימוש בהעברת גני וירוס בתיווך לעצור או להפוך אובדן השמיעה במידה רבה נדחקה למערכת השמיעה ההיקפית. מחקרים מעטים בחנו העברת גנים למערכת השמיעה המרכזית. גרעין גב השבלול (DCN) של גזע המוח, המכיל נוירונים מסדר שני של המסלול השמיעתי, הוא אתר פוטנציאל להעברת גנים. בפרוטוקול זה, טכניקה לחשיפה ישירה ומקסימלי של DCN העכברי באמצעות גישה הפוסות אחורי מודגמת. גישה זו מאפשרת לאף אחד מניתוח אקוטי או הישרדות. בעקבות הדמיה ישירה של DCN, מארח של ניסויים אפשריים, כולל הזרקה של opsins לתוך גרעין השבלול ולאחר מכן על ידי הגירוי של סיבים אופטיים מצמידים את אור לייזר כחול. ניסויי נוירופיזיולוגיה אחרים, כגון גירוי חשמלי והעתקי מזרק עצביים הם גם אפשריים. רמת visualization ואת משך הזמן של גירוי השגה להפוך גישה זו ישימה למגוון רחב של ניסויים.

מבוא

העברת גנים בתיווך וירוס לאובדן שמיעה הפוך התמקדה בעיקר במערכת השמיעה ההיקפית. ¹ בהתמקדות בשבלול, החוקרים בחנו שורה של דרכי אספקה, כולל עירוי מיני משאבה^{אוסמוטית 2}, Gelfoam®² ספוג קומפלקס וקטור-טרנסגן או ספוג ג'לטין³, מיקרו-הזרקה ישירה⁴; וקטורים רבים להעברת גנים, כולל וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו^5,6, וקטורים לנטי-ויראליים⁷ וליפוזומים קטיוניים²; והפצת וקטורי העברת גנים מעבר לרקמת המטרה². לאחרונה, נגיף הקשור לאדנו-(AAV)-1 הוכנס לשבלול על מנת לטפל בחירשות בעכברים עקב אובדן טרנספורטר גלוטמט שלפוחית-3. ⁸ יתר על כן, לאחרונה תואר היישום של אופטוגנטיקה במערכת השמיעה ההיקפית. ⁹

עם זאת, מחקרים מעטים בחנו העברת גנים למערכת השמיעה המרכזית. גרעין השבלול הגבי (DCN) של גזע המוח מכיל נוירונים מסדר שני של מסלול השמיעה. בעוד שטכניקות העברת גנים בגרעין השבלול (CN) עשויות לשמש לשורה של חקירות, ניתן להשתמש גם בהעברת גנים של אופסינים, חלבונים רגישים לאור, ל-DCN כדי לאפשר טכניקות ניסוי מבוססות אופטוגנטיקה. בעקבות העברת גנים בתיווך וירוס של אופסין, כגון channelrhodopsin-2 (ChR2), הנוירונים של ה-DCN הופכים רגישים לגירוי אור. העברת גנים אופטוגנטית נוסתה בעבר במספר אזורים בגזע המוח, כולל גרעין הרטרוטרפז של החולדה, לוקוס קורולאוס של העכבר, קוליקולוס עליון של קוף ואזור הגחון של העכבר. ^10-14

לאחרונה, חוקרים בחנו את השימוש באופטוגנטיקה ב-DCN. ^15,16 ה-DCN הוא המיקום של מיקום שתלי גזע המוח השמיעתי בבני אדם, מה שהופך אותו לחלק אטרקטיבי של מערכת השמיעה למחקר למחקרים תרגומיים על תותבות עצביות שמיעתיות. עם זאת, בהתחשב במיקום ה-DCN, חשיפה כירורגית מאתגרת. הטכניקה המתוארת כאן מספקת פרוטוקול לחשיפה מקסימלית של ה-DCN באמצעות גישת פוסה אחורית כדי לאפשר העברת גנים וקטורית ויראלית וניסויים מבוססי אופטוגנטיקה במודל עכברים. מחקרים קודמים השתמשו במיקרו-הזרקה סטריאוטקטית לתוך ה-DCN עם channelrhodopsin-2. ¹⁶ הזרקות סטריאוטקסיות, לעומת זאת, עלולות להיות פחות מדויקות מהזרקות הנעשות על ידי הדמיה ישירה, במיוחד בגרעין קטן ועמוק לאורך גזע המוח כמו ה-DCN. עכברים טרנסגניים המבטאים חלבונים ספציפיים לרקמה ב-CN הם גם אופציה אטרקטיבית וימנעו את הצורך בהעברת גנים. הפרוטוקול שלנו לחשיפה של ה-DCN יעבוד גם בעכברים טרנסגניים מכיוון שה-DCN יצטרך להיחשף ישירות לגירוי אופטי. טכניקה זו לחשיפה כירורגית של ה-DCN מותאמת מפרוטוקולים קודמים הכוללים הקלטות מעצב השמיעה וגרעין השבלול במודלים של עכברים וחולדות. ^15,17-20

המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא לספק חשיפה ישירה ל-CN כדי לאפשר טכניקות העברת גנים. ליתר דיוק, הגישה תואמת הן לניתוח אקוטי והן לניתוח הישרדותי וניתן לחזור על ההכנה באותה חיה לבדיקות נוירופיזיולוגיות עוקבות. לחשיפה הישירה של פרוטוקול DCN יש השלכות על ניסויים מבוססי העברת גנים בתיווך אופטוגנטיקה ווירוסים בגרעינים אחרים של גזע המוח.

פרוטוקול

הערה: כל הליכי הניסוי מבוצעים בהתאם לועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בעיני מסצ'וסטס ומרפאת אוזן ובית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, שפועל לפי הנחיות טיפול בבעלי החיים לאומיות, ובכלל זה לבריאות ציבור שירות מדיניות על הומניות טיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, ILAR מדריך, ובעלי חי חוק צער. הפרוצדורות מפורטות להלן פירוט חשיפה של DCN השמאל. השתמש בכלים סטריליים בעת ביצוע ניתוח הישרדות.

1. היסודי Craniotomy וחשיפה הגבי שבלול Nucleus

1. הרדמה
   1. הרדימי עכבר, בגילי 8-12 שבועות, במשקל 18-24 גרם, עם 20 מ"ג / קילוגרם xylazine וקטמין 100 מ"ג / קילוגרם באמצעות ממשל intraperitoneal. אשר הרדמה תקינה על ידי קצב ניטור לב, קצב נשימה, כמו גם רפלקס נסיגת קמצוץ הבוהן. משחה וטרינר מקום על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. ברגע כראוי בהרדמה, לא מעל שיער גילוחהוא הקרקפת כדי לספק גישה ללא הפרעה לאתר כירורגית.
2. מיקום כירורגי
   1. מניחים את העכבר באופן מאובטח בבעל החיים קטן stereotaxic, שנערך במקום על ידי מהדק חוטם.
   2. ודא שמהדקים החוטם הוא רופף מספיק כדי לאפשר לנשימה נאותה אבל חזק מספיק כדי לשתק את הראש של העכבר לחלוטין. אם ראש העכבר הוא רופף, בעל החיים עלולים ליפול מבעל הראש במהלך חלק craniotomy של הליך.
   3. מניחים אלקטרודות שתל גזע המוח שמיעתיות באופנה סטנדרטית, המאפשרת לניטור קצב לב. קצב נשימה צריך להיות במעקב על ידי הדמיה. שים לב שקצב לב נורמלי וקצב נשימה משתנים בהתאם לגילו של העכבר.
   4. מדחום ממוקם וeuthermia מובטח באמצעות מיקום על שמיכת חימום homeothermic.
3. חתך בעור וחשיפה של עצמות interparietal והעורפיות של הגולגולת
   1. תחת microscאופ, לעשות חתך אנכי דרך העור מתחיל בקו האמצע, ישירות בין האפרכסת, והארכת לחלק הזנב של העורף. בעקבות חתך בעור קו האמצע, לעקור את העור רוחבי. דמיינו את השרירים המכסים את עזב את החלק האחורי של הגולגולת.
   2. הסר שריר שמעל השמאל הקודקודית, interparietal, ועצמות עורפיות של הגולגולת על ידי disarticulation של קבצים מצורפים שרירים לעצמות שלהם עם מספריים או אזמל איריס. שים לב במידה קטנה של דימום לאורך קצות שרירים לחתוך. למזער את זה על ידי לחץ עדין עם המוליך כותנה שקצה במשך 10-15 שניות.
4. שמעליה craniotomy השבלול Nucleus
   1. לזהות קווי תפר רלוונטיים, כולל קווי תפרים sagittal ולמבדה (איור 1, שמאל לוח).
   2. שימוש rongeurs, להפוך את פתיחת גולגולת על עצם interparietal, השמאלית של קו האמצע, ~ הזנב 2 מ"מ לקו התפר למבדה. אזור זה overlies DCN.
   3. Followincraniotomy g, להתבונן בשכבה דקה של דורה שoverlies המוח הקטן. באמצעות סכין אזמל, להסיר את הדורה. (איור 1, פנל באמצע).
      הערה: הסרת הדורה עלולה לגרום למידה קטנה של דימום. תהליך זה של שימוש בלהב סכין המנתחים כדי להסיר את הדורה נועד להפחית את כמות איבוד דם במהלך שאיפת המוח הקטן, שברכה על פני השטח של גזע המוח וזיהוי אלמוני של DCN. סה"כ נפח דם של עכבר הוא ~ 1.5 מיליליטר לא יעלה> מ -15%. אם הדימום עולה על סכום זה, העכבר צריך להיות מסופק עם עם תוספת נוזלים.
   4. הסר דם קרוש כיסה את המוח הקטן עם המוליך קצה כותנה. לחלופין, בעדינות לטפטף מי מלח באמצעות נקודת שיניים על המוח הקטן כדי לנקות דם משם דם.
5. המוח הקטן שאיפה
   1. באמצעות 5 יניקה צרפתית, לשאוב את החלק לרוחב-ביותר של המוח הקטן השמאלי מעל DCN עד DCN הוא מולרע"מ (איור 1, ימין לוח). הסר כ 1/4 עד 1/3 של המוח הקטן משמאל. ציון דרך העיקרי בסמוך לDCN הוא ampulla של התעלה חצי עגולה מעולה.
      הערה: שאיפה של המוח הקטן היא צעד מפתח לפרוטוקול. שאיפת בימוי של המוח הקטן מתבצעת ביותר בהצלחה אם היא מתרחשת בניסיון בודד ולא עם מעברים מרובים של היניקה כמו זה יגרום לדימום. כדי לסייע בשאיפה, להגדיר את מישור המוקד של המיקרוסקופ בעומק הצפוי של CN, שיהיה מעט דיסטלי אל פני השטח של המוח הקטן. הגדרת מישור המוקד לCN תשפר הדמיה ולהבטיח תמונה חדה.
   2. השאיפה הבאה, דימום נוסף, נוזל השדרתי (CSF) הצטברות, ועקירת המוח הקטן על DCN צפויים. להחדיר 0.5 סמ"ק של תמיסת מלח סטרילית במהירות לפתיחת הגולגולת כדי למנוע קרישת דם. שילוב של ספיגה עדינה עם נקודה ויניקת שיניים יכול להיות אזנהג לסלק דרך להדמיה ישירה של DCN. ישירות לא לפנות אל פני השטח של DCN.

Microinjection לחץ 2. להעברת גנים בתיווך וירוס ושחזור כירורגי

1. לאחר DCN הוא חופשי של דם וCSF שמעליה ונראים בבירור, להפוך microinjections לחץ לDCN באמצעות מזרק המילטון 10 μl על פני תקופה 2 דקות.
2. להציג את המחט עם micromanipulator עד הקצה הוא כבר לא נראה לעין מתחת לפני השטח של DCN.
3. לקבלת ביצועים מיטביים, השתמש במחט 33 או 34 מד (להשתמש במזרק gastight עם מחט 34 מד) עם שיפוע רדוד, כגון 45 מעלות, כדי למזער את הטראומה קהה ולמקם את עוצמת הזריקה בתוך DCN, שהוא דק ו מבנה גזע המוח רדוד (<300 מיקרומטר עבה).
   הערה: מכשירי microinjection אחרים עשויים להיות מבוססים מנוצלים. באופן אידיאלי, מכשיר ההזרקה צריך להיות גמיש כדי לאפשר לכמה בן קלד, נחוץ אם לפנות ישירות לקהל DCN. יתר על כן, כפי שהעכבר זז מעט לאורך כל ההליך בשל נשימה, המכשיר צריך להיות חזק מספיק כדי לעמוד בכמויות קטנות של תנועה.

שחזור כירורגי 3.

1. מייד ההזרקה הבאה, מחדש משוערת העור ולאפשר העכבר כדי להתאושש להליך התאוששות סטנדרטי. רקמת המוח הקטן וצלקת שנותרה למלא את החלל שנגרם על ידי שאיפה של המוח הקטן. כל הזמן לפקח על בעלי חיים עד תודעה מספיק הוא חזר כדי לשמור על כיבה sternal. לעקוב אחר קצב לב, קצב נשימה, כמו גם יכולת להאכיל.
   הערה: אין חיה שעברה ניתוח חזר לכלוב עם בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין.
2. אם עכבר מתחיל ללכת במעגלים לאחר ניתוח (<5% מהמקרים), בדרך כלל 2-4 שעות לאחר סגירת החתך בעור, להקריב מייד העכבר, כפי שהוא עלול להביא להאכלת תקופה קשה. Tתופעת הלוואי שלו היא כנראה עקב שאיפה של המוח הקטן. בעלי החיים צריכים להיות במעקב לכאב לאחר הניתוח, ויש לתת סמים מתאימים כדי להבטיח נוחות בעלי חיים המבוססים על תקנים מוסדיים. אנטיביוטיקה עשויה להיות נחוצה, אם עדות לזיהום.

4. חשיפה Craniotomy והשבלול Nucleus משנית

1. לאחר 2-4 שבועות של ריפוי ודגירת העברת גני וירוס בתיווך, מחדש להרדים זמן דגירה אופטימלית הזריק בעבר צעד עכבר וחזור על 1.1-1.5 משתנה בהתאם לסוג של גן הועבר.
2. הסרה של רקמת צלקת על אתר craniotomy על ידי שילוב של פינצטה, אזמל, וrongeurs.
3. לאחר לדמיין את פתיחת הגולגולת, לזהות שילוב של רקמת המוח הקטן ונותר צלקת מעל DCN. השתמש 5 יניקה צרפתית כדי לשאוב המוח הקטן שמעליה / רקמת צלקת (בדומה לשאיפת המוח הקטן הקודמת).
4. בעקבות שאיפה, מצפה דימום נוסף, ב CSFuild-אפ, וחתיכות הנותרות של המוח הקטן. במהירות להציג מלוח לפתיחת הגולגולת כדי למנוע קרישת דם. השתמש בשילוב של ספיגה עדינה שיניים נקודה ויניקה כדי לנקות את הנתיב להדמיה ישירה של DCN.
5. שים לב פני השטח של DCN. לבצע ניסויי פיזיולוגיה מבוסס optogenetics כDCN נגיש כעת. להציג את גירוי אור, למשל עם סיב אופטי (איור 2), לנהוג ניסוי מבוסס optogenetics.

5. היסטולוגיה

1. בעקבות מסקנה של ניסויים, להרדים את העכבר עם מנת יתר של קטמין. Perfuse העכבר עם מלח רגיל ואחריו paraformaldehyde 4%.
2. חלץ את גזע המוח מהגולגולת ופוסט-התיקון לשעה 2. Cryoprotect גזע המוח בסוכרוז 30% במשך 24-48 שעות. סעיף גזע המוח באמצעות cryostat סטנדרטי באמצעות 60 מיקרומטר חלקים.

תוצאות

חלקית המוח הקטן שאיפה מדגימה גישה לגרעין השבלול

לאחר העור והשרירים שמעל הגולגולת יוסרו, ציוני דרך פני גולגולת, כגון קווי תפר העטרה ומדא, מדגים את הלוקליזציה המשוערת של פתיחת הגולגולת. בעקבות פתיחת גולגולת עם rongeurs, המוח הקטן הוא מדמיין. שאיפה זהירה של החלק הקטן של המוח הקטן מדגימה הדמיה של CN, אז מה שיכול להיות מוזרק (איור 1).

דיון

מאמר זה מתאר את הטכניקה של הדמיה הישירה של DCN במודל העכברי למניפולציה של מערכת השמיעה המרכזית. הגישה המתוארת של הדמיה ישירה מספקת יתרונות משמעותיים על פני החלופה המרכזית, שהם גישות stereotaxic. בעיקר, להדמיה ישירה של DCN מאפשרת לאישור מיידי של האתר של גזע המוח, ואילו גישות stereotaxic לא להרשות לעצמו להדמיה ישירה. בניסויים שמחייבים ממושכים תקופות דגירה, כמו במקרה של העברת גנים בוירוס בתיווך, יש פוטנציאל ליעילות זיהום נמוך אם ההזרקה "מתגעגעת" מיקום היעד. יתר על כן, גישה ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחזיק סטריאוטקסי	Stoelting	51500
שמיכה הומותרמית	507214		הרווארד
#11	כלים כירורגיים עדינים	10011-00
מספריים קשתית	כלים כירורגיים עדינים	14084-08
5 יניקה צרפתית	סימטריה כירורגית	2777914
נקודות שיניים	הנרי Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 µ l מזרק המילטון	המילטון	7633-01
מד 34, מחט	המילטון
כלים כירורגיים משובחים	Rongeurs	16021-14