הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בחינת המהירה דופמין Dynamics עם הסריקה מהירה Voltammetry המחזורי במהלך פנים הפה Tastant מנהל בחולדות ערה

12.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52468

⸱

12 באוגוסט 2015

 ,  ,  , 
1Interdepartmental Neuroscience Program, Yale University, 2Department of Biotechnical and Clinical Laboratory Sciences, School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, 3Department of Psychiatry, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

תנודות מהירות בדופמין חוץ-תאי (DA) מתווכות הן את עיבוד התגמול והן את ההתנהגות המונעת ביונקים. כתב יד זה מתאר את השימוש המשולב בוולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה (FSCV) ובמתן טסטנט תוך-אוראלי כדי לקבוע כיצד טסטנטים משנים שחרור מהיר של דופמין בחולדות ערות ונעות בחופשיות.

תקציר

שחרור מהיר ופאזי של דופמין (DA) במוח היונקים ממלא תפקיד קריטי בעיבוד תגמול, למידת חיזוק ושליטה מוטיבציונית. וולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה (FSCV) היא טכניקה אלקטרוכימית עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה (תת-שנייה) ששימשה לבחינת שחרור DA פאזי במספר סוגים של תכשירים. ניסויים במבחנה בתאים בודדים ובפרוסות מוח וניסויים in vivo במכרסמים מורדמים שימשו לזיהוי מנגנונים המתווכים שחרור וספיגה של דופמין בתנאים רגילים ובמודלים של מחלות. במהלך 20 השנים האחרונות, ניסויי FSCV in vivo במכרסמים ערים ונעים בחופשיות סיפקו גם תובנה של מנגנונים דופמינרגיים בעיבוד תגמול ולמידת תגמול. יתרון מרכזי אחד של ההכנה הערה והתנועה בחופשיות הוא היכולת לבחון תנודות מהירות של DA שנעולות בזמן לאירועים התנהגותיים ספציפיים או לתגמל או להציג. עם זאת, מגבלה אחת של ניסויי התנהגות משולבים ווולטמטריה היא הקושי לנתק את השפעות DA הספציפיות לגירויים מתגמלים או מרתיעים ראשוניים מתנודות DA המתרחשות במקביל המתווכות התנהגויות מוטוריות מכוונות תגמול או אחרות. כאן, אנו מתארים שיטה משולבת המשתמשת ב-in vivo FSCV ועירוי תוך-אוראלי בחולדה ערה כדי לחקור ישירות את תגובות DA לטעמים דרך הפה. בניסויים אלה, טעמים אוראליים מוזרקים ישירות לחיך של החולדה - תוך עקיפת התנהגות מכוונת תגמול והתנהגות שתייה מרצון - מה שמאפשר בחינה ישירה של תגובות DA לגירויים טסטנטיים.

מבוא

שחרור DA פאסי ממלא תפקיד חשוב בתיווך התנהגות מכוונת תגמול [1-3]. עם זאת, בידוד ולימוד כיצד תגמול ראשוני משנה שחרור DA פאזי מסובך לעתים קרובות על ידי תהליכים התנהגותיים או קוגניטיביים המתרחשים במקביל המסוגלים גם לשנות שחרור DA פאזי - כגון תהליכי קבלת החלטות או התנהגות מוטורית מכוונת תגמול כדי להשיג את התגמול. בעבודה הנוכחית, אנו מבודדים תגובות DA פאזיות לטעמים באמצעות שימוש בוולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה (FSCV) בשילוב עם העברת טסטנט דרך צינוריות תוך-אוראליות. טכניקה זו עוקפת בחירה ופעולה ומאפשרת לנו לבחון שחרור DA חוץ-תאי במהלך עירוי ישיר של טסטנט לחיך של חולדה.

FSCV היא טכניקה אלקטרוכימית עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה, המאפשרת מדידות של שחרור DA באזור מקומי בדיד (כ-100 מיקרומטר) בקנה מידה תת-שנייה (רזולוציה של 10 הרץ). השילוב של אספקה תוך-אוראלית ו-FSCV מספק את היתרון של התבוננות בתגובות DA מהירות 'בזמן אמת' לטסטנט, שלא ניתן לבחון בשיטות מיקרודיאליזה קונבנציונליות. יתר על כן, שחרור DA פאזי בתגובה לתגמולים או לרמזים הקשורים לתגמול מתרחש בריכוזים שבין 20-100 ננומטר, שהוא מעל סף הזיהוי של 10-20 ננומטר עבור FSCV [4]. הרזולוציה המרחבית הגבוהה של FSCV מאפשרת גם הקלטה מתת-אזורים של אזורי מוח קטנים, כגון ליבת גרעין האקומבנס (NAc). לפיכך, FSCV בשילוב עם עירויים תוך-אוראליים של טעמים הוא מודל אידיאלי לחקר האופן שבו טעמים או גירויים אחרים משנים את שחרור ה-DA הפאזי בבעלי חיים ערים ומתנהגים. ואכן, טכניקות אלה אפשרו ניסויים החוקרים כיצד טעמים מתגמלים ודוחים משנים שחרור DA חוץ-תאי [5].

במהלך העשור האחרון, ניתוחי FSCV שולבו בהצלחה עם מתן תרופות תוך ורידי [6] ופרדיגמות ניהול עצמי של חולדות [7, 8] כדי לזהות את תפקידם של מנגנוני DA פאזיים במודלים של התמכרות לסמים. בנוסף, נעשה שימוש במתן תוך-אוראלי משולב עם FSCV כדי לבחון כיצד רמזים טסטנטיים בשילוב עם זמינות קוקאין מווסתים שחרור DA פאזי ותגובות התנהגותיות המשקפות השפעה רגשית [3]. ניתן להשתמש במתודולוגיה משולבת זו תוך אוראלית ו-FSCV גם כדי לבחון תגובות DA פאזיות לחומרי טעם, כגון מנטול וממתיקים דרך הפה, המתווספים לסיגריות ולמוצרי טבק נמסים [9-11]. למרות שרבים מחומרי הטעם המוספים למוצרי טבק הם מעוררי תיאבון [9-11], לא ידוע אם חומרי טעם אלה מגבירים את שחרור ה-DA הפאזי באופן העולה בקנה אחד עם ערכיות נהנתנית מתגמלת. ואכן, חומרי טעם וריח המוספים לסיגריות ולמוצרי טבק נמסים עשויים להיות בעלי השפעות ישירות על מערכת התגמול DA ועשויים לפעול באמצעות מנגנונים דופמינרגיים כדי להשפיע על הערכיות המתגמלת של סיגריות ומוצרי טבק אחרים. לפיכך, אספקה תוך-אוראלית בשילוב עם FSCV יכולה לספק הבנה חדשה על האופן שבו חומרי טעם מווסתים שחרור מהיר של DA. השימוש במתודולוגיית FSCV משולבת תוך-אוראלית ו-in vivo, והנתונים המתקבלים ממחקרים כאלה, יכולים גם להקל על מחקרים עתידיים כדי לקבוע כיצד חומרי טעם וריח וניקוטין מתקשרים כדי לשנות את איתות ה-DA ולווסת את חיזוק הניקוטין. יתר על כן, ניתן להשתמש בנתונים המתקבלים ממחקרים כאלה כדי לקבל החלטות רגולטוריות מושכלות לגבי חומרי טעם למוצרי טבק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים שנערכו על פי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת אוניברסיטת ייל מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC).

הכנות 1) טרום-ניתוחיות

  1. הכנת פתרון אוראלית
    1. ליצור פתרונות של סוכרוז 10% ו0.005% L-מנטול במים ללא יונים (pH 7.4). אחסן את הפתרונים הללו במיכלים סגורים, ב RT, ולעצב מחדש כל 2 שבועות, כדי למנוע השפלה.
  2. פתרונות כיול אלקטרודה
    1. הפוך חיץ טריס (pH 7.4) בכל עת לפני הכיול. הפתרון מורכב מ12.0 מ"מ טריס HCl, 140 מ"מ NaCl, 3.25 מ"מ KCl, 1.20 מ"מ CaCl2, 1.25 מ"מ NaH2PO4, 1.20 מ"מ MgCl 2, ו2.00 מ"מ Na 2 SO 4.
    2. צור פתרון מניות של דופמין 10 מ"מ (DA; hydrochloride דופאמין) ב0.1 חומצת perchloric M. חומצת perchloric מסייעת במניעת חמצון של dopaminדואר. אחסן פתרון מניות זה ב -20 ° C ולהשתמש עד 6 חודשים. הפוך כמה aliquots של פתרון מניות DA לאחסון לשימוש כל aliquot רק פעם אחת.
    3. ממניות 10 מ"מ DA, לדלל פתרונות במאגר טריס לריכוזים של 1 מיקרומטר, 500 ננומטר, 250 ננומטר, 125 ננומטר, 62.5 ננומטר, ו31.25 ננומטר.
    4. לכיול pH, להכין פתרונות של טריס חיץ עם pH של 7.2, 7.3, 7.5, 7.6 ו. זה יספק פתרונות המחקים משמרות pH שעלול להתרחש במהלך ניסוי in vivo.
  3. ייצור אלקטרודה
    1. על ידי שאיבת אבק, לשאוב סיבי פחמן T-650 (7 מיקרומטר קוטר) לנימי זכוכית בורוסיליקט (אורך 10 מ"מ, קוטר 0.6 מ"מ חיצוני, קוטר פנימי 0.4 מ"מ).
    2. הנח נימי זכוכית מלאות בסיבי פחמן לחולץ אלקטרודה אנכי. לפרמטרים ראשוניים, הגדר את התנור ל55.0 ולכבות את המגנט. עם זאת, אופטימיזציה נוספת שתהיה דרושה כשני דוד והגדרות מגנטיות להשתנות frמעבדה אום למעבדה.
      הערה: אלקטרודה צריכה להיות לפחות 5.5 סנטימטר (כולל להתחדד), כך שהוא יכול להתאים בקלות לmicromanipulator ולהיות מוכנס לפחות 6.9 מ"מ מתחת דורה במוח החולדה. אם האלקטרודה הוא קצר מדי, הקלטות מחלק הגחוני של הגרעין נסמך לא תהיינה ברות השגה. מצד השני, הכולל את אורך אלקטרודה לא יעלה על 6.5 סנטימטר אחר זה יהיה יותר מדי זמן כדי להתאים את micromanipulator.
    3. באמצעות מיקרוסקופ אור, לחתוך החשוף סיבי פחמן, כך שהוא מרחיב 75-100 מיקרומטר מעבר לקצה של הזכוכית. ודא שיש לו את האלקטרודה חזק מאוד, בקושי אפשר להבחין, חותם בין אלקטרודת הזכוכית והסיבית פחמן, אשר תפיק רעש מינימאלי במהלך הקלטה שלאחר מכן. מחק את האלקטרודה אם יש סדקים בולטים בזכוכית או אם החותם הוא רופף, אשר מעיד על חותם עני. לקבלת הוראות מפורטות יותר ראו [12] ו [13].
  4. הרכבת אלקטרודה לתוך המיקרופוןromanipulator
    1. להשיג 3 ב, חוט 30G כי הוא מבודד לאורך מחצית אורכו של החוט ולהשתמש במברשת קטנה ללמרוח שכבה דקה של כסף לצבוע ישירות לחוט. מייד לאחר החלת צבע כסף, להכניס את החוט לתוך החור בחלק העליון של האלקטרודה לספק חיבור פיזי וחשמלי לסיב פחמן. תחת מיקרוסקופ, להבטיח כי חוט הכסף יוצר קשר עם סיבי פחמן.
    2. אבטח את חוט הכסף ואלקטרודה לmicromanipulator באמצעות חום להתכווץ.
    3. מניחים את האלקטרודה סיבי פחמן מוכן לאלכוהול איזופרופיל מטוהר (IPA) במשך לפחות 10 דקות כדי לנקות את שטח האלקטרודה וכדי להגביר את הרגישות לאחר דופמין. לאחר השרייה בIPA, לשטוף את סיבי פחמן במים ברז כדי להסיר את IPA.
  5. ייצור אלקטרודה התייחסות
    1. קח חוט 13 מ"מ כסף המכיל כ 6 מ"מ רשת Ag / Ag Cl (חוט כסף 7 מ"מ בלבד, 6 רשת מ"מ, קוטר 0.4 מ"מ),לחתוך את חלק הכסף עד כלמחצית אורכו המקורי ולרתך את החלק מכסף של החוט לסיכת זהב.
    2. החל אפוקסי על ההלחמה על הפין.
    3. טובלים את Ag / Ag Cl רשת הסוף לקופולימר של polytetrafluroethylene 5% וperfluoro-3,6-dioxa-4-מתיל-7octene-sulfonic חומצה 5 פעמים, לתקופות ייבוש אוויר 30 דקות בין כל טבילה.
    4. לאפשר Ag / Ag Cl המצופה רשת לO אוויר היבש / N.
    5. לרפא בתנור על 120 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.

2) ניתוח המשולב intraoral וניתוח תוך גולגולת Cannulation (כ -75 דקות)

  1. ייצור קטטר שבעל פה
    1. הפוך את הצנתר דרך הפה, ולעקר על ידי עיקור אתילן אוקסיד, לפחות 10 ימים לפני הניתוח.
    2. חותך צינורות PE 100 ל6 סנטימטר מגזרים ארוכים.
    3. באמצעות מלחם, להמס קצה אחד של צינור PE וקש מייד על משטח מוצק כדי לקרר את צינורות PE. התוצאה צריכה ליצורדיסק קטן, שטוח בקצה אחד של צינור PE ולא צריך להיות טבלת מנגנון. שימוש במחט (18 G) או לדחוף סיכה כדי ליצור חור במרכז של הדיסק הזה.
    4. בצד השני של צינור PE, בנוחות להכניס את הקצה הקהה של מחט G 18 לתוך הצינור.
    5. באמצעות אגרופן חור נייר סטנדרטי, אגרוף כמה חתיכות עגולות של גיליון polytetrafluroethylene (3.18 מ"מ עובי, 6 מ"מ קוטר) כדי ליצור מנקי polytetrafluroethylene.
    6. ליצור חור במרכז של מכונת הכביסה. קח את המחט מחוברת לצינורות PE ולדחוף אותו לחלוטין באמצעות מכונת הכביסה. ברגע שהמחט היא דרך, להחליק את מכונת הכביסה לתחתית צינורות PE, כך שהוא סומק נגד מכונת הכביסה.
  2. אוראלי ניתוח
    1. לאחר חיטוי כלים כירורגיים, הצינורית (גזוזות עד 2.5 מ"מ מתחת הכן לפני העיקור), והאלקטרודה התייחסות, להרדים את העכברוש עם זריקת intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם).
      1. אפter 5 דקות, להחיל מבחן גירוי מזיק (רגל או קמצוץ זנב) כדי להעריך את הרמה של הרדמה. אם הנושא מראה כל תגובה פיזית למבחן הגירוי המזיק (נרתע תגובה, עלייה בקצב נשימה או לב), לנהל דחיפה קטמין של 10% עד 15% מהמינון המקורי ולחזור על פרוטוקול הגירוי המזיק לעיל.
    2. לאחר העכברוש הוא בהרדמה מלאה ולא מראה תגובה למבחן הגירוי המזיק, להשתמש קוצץ שיער בעלי חיים לגלח הפרווה של החולדה מהעיניים כ 2 מ"מ מאחורי האוזניים. לאחר מכן מניח את החולדה על כרית חימום הסירקולציה המחודשת מים דקה כדי לשמור על טמפרטורת גוף במהלך ניתוח. החל סיכה עין. לנהל את התרופה אנטי דלקתי שאינם סטרואידים (NSAID), carprofen (5 מ"ג / קילוגרם), על ידי הזרקת intraperitoneal לפני ביצוע כל חתכים ולפני החדרת קנולות intraoral. השתמש בטכניקת ספטית בכל העת.
    3. החל בטאדין ואחריו אתנול 70% כדי לנקות את העור. חזור 3 פעמים.
    4. Plaהספירה החולדה על הגב שלה, ולפתוח את הפה באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי. מצא טוחנת העליון הראשונה.
    5. הכנס את המחט לתוך הרקמה בין הלחי וטוחן העליונים הראשונה עד המחט יוצאת ממש מאחורי והמדיאלי לאוזניים.
    6. פירס המחט דרך העור עד צינורות PE יוצא העור ונגיש.
    7. משוך על הצינורית (מרתקת על ידי הצינורית עצמו ולא את המחט) ולאבטח את מכונת הכביסה polytetrafluroethylene לטוחנות כך שהצנתר נשאר במקום.
      הערה: חיתוך מכונת הכביסה לצורת טרפז ומאבטח אותו נגד הטוחנות עם הצד השטוח מול הלחי עושה צעד זה קל יותר.
    8. קח מכונת כביסה polytetrafluroethylene אחרת והחלק אותו על המחט החשופה, את צינורות הפלסטיק, וניגש נגד החתך.
    9. כדי לאבטח את מכונת הכביסה polytetrafluroethylene, להשתמש בקלטת מעוקרת ליצור "דגל" משולש כך שמכונת הכביסה לא להחליק למעלה. Secure לשטוףאה נגד העור של החולדה והקלטת מעוקרת.
    10. חותך את הקטטר החשוף כדי לאפשר 2-4 סנטימטר של צינורות להיחשף מעל הראש של החולדה.
    11. חזור על השלבים 2.2.1 באמצעות 2.2.10 לצד של הפה האחר.
  3. ניתוח תוך-גולגולתי לvoltammetry
    1. מניחים את החולדה במסגרת stereotaxic ולנקות את הקרקפת של החיה באמצעות שני לשפשף שלב (לשפשף בבטאדין ואחריו לשפשף אתנול 70%, לבצע עם חזרת 3 מחזור).
    2. השתמש פינצטה מעוקרת מחט האף ומספריים כירורגיות כדי לחתוך קטע 15 x 15 מ"מ של רקמת קרקפת.
    3. נקה בעדינויות את פני השטח של הגולגולת באמצעות החלת קצה כותנה מעוקרת. נוסף לנקות את הגולגולת על ידי יישום 2-3 טיפות של מי חמצן 3%.
    4. השתמש תרגיל stereotaxic לעשות 3 חורים קטנים (בקוטר 1 מ"מ) בגולגולת להכנסה הבאה של ברגים, חור 1 לצינורית המדריך, חור 1 להאלקטרודה מגרה, וחור 1 לנבחר ההתייחסותרכב.
    5. להקלטות בליבת NAC, מקמו את צינורית המדריך ב1.2 מ"מ קדמי ו -1.4 מ"מ לרוחב גבחת. מנמיכים את מנגנון הצינורית עד בסיס הפלסטיק הוא מיושר עם הגולגולת.
    6. מניחים את האלקטרודה ההתייחסות מעוקרת בחצי הכדור הנגדי לצינורית המדריך. מנמיכים את ההתייחסות כ 2 מ"מ מתחת הדורה.
    7. מקם את האלקטרודה מגרה על 5.2 מ"מ אחורי ו1.0 מ"מ לרוחב גבחת והוריד 8.0 מ"מ מתחת דורה למקד אזור הגחון tegmental (VTA).
    8. השתמש במברג כירורגית קטן מעוקר כדי לאבטח ברגים לגולגולת. לאחר מכן, הכנס את האלקטרודה ההתייחסות, גירוי אלקטרודה, ולהנחות את הצינורית. לבסוף, לאבטח את כל הרכיבים באמצעות מלט cranioplastic.
    9. במשך 48 השעות הראשונות של טיפול שלאחר ניתוח, לנהל את התרופה אנטי דלקתית (NSAID) carprofen שאינו סטרואידים בהזרקה תת עורית (5 מ"ג / קילוגרם). לאפשר לפחות השבוע 1 להתאוששות כירורגית מלאה לפני ביצוע voltamהקלטת "חג.
      1. במהלך טיפול שלאחר ניתוח, צנתרים אוראליים סומק יומי עם מים. לספק מזון רווי במים במשך 2 ימים כדי לסייע לבעלי החיים בלעיסה ואכילה. לספק ניטור יומי לסימנים אפשריים של לחץ של כאב (עקב זיהום או התייבשות קל) ולספק התערבויות מתאימות במידת צורך (כולל ניהול של נוזלים, ממשל מקומי של חיטוי, וממשל או NSAID carprofen בשעה 5 מ"ג / קילוגרם).

3) הקלטות Voltammetric בערים, עכברוש באופן חופשי על העברה

  1. הורדת האלקטרודה ורכישת סט אימון DA.
    1. ביום של הניסוי, לבדוק את הפתיחות של הצינורית דרך הפה על ידי יציקת 200 μl מים והתבוננות תגובות orofacial (כדי לוודא שהעכברוש הוא טועם את המים).
    2. צרף את headstage FSCV לחולדה על ידי החדרת אלקטרודה המגרה (על headstage) לcannu האלקטרודה מגרה דו קוטבילה (בחולדה). לפיכך, headstage (מיניאטורי ממיר נוכחי למתח) מתחברת ישירות לאלקטרודה דו קוטבי גירוי.
    3. הסר את צינורית הדמה ממנגנון הצינורית ולהחיל שתי טיפות של 50% פתרון הפרין לצינורית. ואז בעדינות להכניס צינורית דמה (מעט יותר שצינורית הדמה שהוסרה בעבר) כדי לנקות כל קרישי דם או צלקות גליה אשר ייתכן שאירעו, שישברו אלקטרודות סיבי פחמן שיהיה בהמשך להיות מוכנס במהלך הניסוי. להאריך את הצינורית המשמשת לניקוי קרישים 3-4 מ"מ מתחת לגולגולת (לפחות 2 מ"מ מעל אתר ההקלטה).
    4. הכנס את micromanipulator, עם אלקטרודה, לצינורית המדריך ולמקם את טבעת האומגה במצב "נעול".
    5. חבר את חוט האלקטרודה ההתייחסות מheadstage לסיכה המתאימה. אז לחבר את חוט האלקטרודה העבודה מmicromanipulator לחוט המתאים בheadstage.
    6. מנמיכים את ELECtrode כ 4-4.5 מ"מ מתחת גולגולת.
    7. השתמש potentiostat ליישם צורת גל משולשת (400 V / s, ל-0.4 1.3 V). החל הגל לאלקטרודה בתדר 60 הרץ לפחות 10 דקות, ולאחר מכן לשנות את תדר יישום צורת גל עד 10 הרץ להקלטות ניסיוניות שלאחר מכן.
      הערה: צעד יישום גל 60 הרץ מייצר משטח סיבי פחמן יציב ויסייע למנוע סחיפה חשמלית
    8. החל גירוי חשמלי לVTA באמצעות תדרים שונים (10 עד 60 הרץ) קטניות (10 עד 30 פעימות) וזרמים (50 עד 150 מיקרו-אמפר) כל עם רוחב פולס של 2 MS / שלב, לעורר ריכוזים שונים של שחרור DA ו- pH משמרות. לרכוש לפחות 5 ריכוזים שונים של שחרור DA ו -5 משמרות pH שונות. חכה (2 - מינימום 3 דקות) בין גירויים כדי לאפשר העמסת לפוחי [14].
      הערה: חשוב לקבל גירויים המייצרים ריכוזי DA על פני כל הטווח שייאסף במהלך שלאחר מכןניסוי שכן הם ישמשו כמערכת הכשרה לקרן רכיב ניתוח (ראה סעיף 5.1).
    9. מנמיכים את האלקטרודה לתוך ליבת NAC (הגחון 6.3 מ"מ לדורה). לאחר מכן מנמיך את האלקטרודה בבתוך ליבת NAC 100 מיקרומטר מרווחים עד אירועי שחרור DA חולפים הם נצפו בתדרים של לפחות 1 לדקה.
    10. חבר את צינורות (הקוטר פנימי 1/32 ", קוטר חיצוני 3/32") למזרק 20 מיליליטר, מחובר למשאבת מזרק. בצד השני של הצינור, להשתמש במחט 23 G משופע להתחבר צינורות לצינורית של החולדה. ודא שהצינור מלא לחלוטין עם tastant הרצוי ולוודא שאין בועות קיימות בצינור.
      הערה: בדרך כלל, לנהל כמות קטנה של tastant לתוך הפה של העכברוש לפני ההקלטה על מנת להבטיח כי העירוי הראשון להקלטה מספק את מלוא סכום עירוי ולא כל מים או אוויר שיורית בצינור. יתר על כן, זה מאפשר לבעלי החיים כדי לקבל קצת שנינות ניסיון קודמתh tastant מאז tastants רומן, גם תיאבון אלה, יכול להיות מרתיע בתחילה בשל החידוש שלה.
    11. לאיסוף נתונים, להחדיר 200 μl של tastant (6.5 שניות באמצעות משאבה וצינורות שתוארו לעיל). להשרות tastant כל דקות 1-3. להשרות כולל של 25 פעמים בtastant. כל עירוי מספק 200 μl של פתרון.
    12. אם tastants מרובים מועבר בניסוי אחד, לשטוף את הפה עם מים קטטר לאחר איסוף נתונים לtastant אחד ולחכות לפחות 20 דקות לפני יציקת tastant החדש.
    13. לאחר הקלטת DA, להתכונן לאימות היסטולוגית על ידי יצירת נגע קטן באתר ההקלטה. כדי לשמר את האלקטרודה סיבי פחמן לכיול הבא, לחזור בי ראשון האלקטרודה ולהסיר את micromanipulator. לאחר מכן השתמשתי micromanipulator חדש עם microelectrode זכוכית ותיל טונגסטן (הארכת 100 מיקרומטר מעבר לקצה של הכוס) לאותו עומק (להלן דורה) כF פחמן המקוריmicroelectrode iber.
    14. לאימות היסטולוגית, ליצור נגע קטן על ידי יישום 3 V בחוט טונגסטן והגדלת המתח במרווחים 1 V, כל 10 שניות, עד שתגיע ל- 10 V ההגדרה.
    15. אם עקומת ריכוז סטנדרטית כבר נוצרה באמצעות אלקטרודות פחמן סיבים מרובות, לבצע את צעד הנגע לעיל (3.1.14) על ידי יישום הפוטנציאל ישירות האלקטרודה סיבי פחמן.
      הערה: שיטת נגע זה יגרום ניזק לסיבי פחמן ולמנוע הכיול הבא עם שאלקטרודה הספציפית.
    16. להרדים את החיה באמצעות pentobarbital קטלנית הזרקה (150 מ"ג / קילוגרם, IP).
    17. לעקור את headcap עם cannulae באמצעות צבת ידי משיכת ישירות כלפי מעלה על headcap. אל תסובב headcap מאז זה יגרום נזק מיותר למוח ולגרום לזה מאתגר כדי לזהות את המיקום של האלקטרודה בהיסטולוגיה.
      1. הסר את המוח ואת המקום בפורמלין 4% במשך 3 ימים ואחריו 30% sucrose לשבוע 1. צור 30 מיקרומטר פרוסות באמצעות cryostat, לעלות על מכסה מחליק ולבחון פרוסות תחת מיקרוסקופ אור כדי לזהות את המיקום של סיבי פחמן או נגע טונגסטן.
        הערה: זלוף הוא אופציונאלי עבור 3.1.17.

4) אלקטרודה כיול

  1. שימוש בתא הזרימה כדי ליצור גורם המרה נוכחי-ריכוז.
    1. על מנת לקבוע את רגישות אלקטרודה, לכייל אלקטרודות לאחר כל ניסוי באמצעות מנגנון "T-cell" זרימה. מנמיכים את האלקטרודה לתוך "T-cell" בעוד חיץ טריס, פתרונות pH, או פתרונות DA נשטפים על פני האלקטרודה (בשיעור של 2 מיליליטר / דקה). השתמש מפעיל סולנואיד האוויר שש-עמדה כדי לעבור קדימה ואחורה בין החיץ וpH או פתרון DA.
    2. לכל כיול, לאסוף נתונים voltammetric במהלך 5 שניות יישום של חיץ טריס (בסיס) ואחרי 5 שניות של יישום ה- pH או פתרון DA, ואחרי 20 שניותpplication של חיץ טריס (קובץ כולל של 30 שניות). חזור על כל ריצה 3 פעמים עבור כל ריכוז סטנדרטי כיול, כמשקל נגד בין ריכוזים השונים של כל תקן.
    3. לכל אוסף מדגם, למדוד את השיא DA או נוכחי עורר pH. ממוצע נוכחי השיא פני כל ניסוי כדי להשיג ריכוז לעומת מערכת יחסים הנוכחיות לשיא. לקבלת הוראות מפורטות יותר ראו [12] ו [13].

5) ניתוח נתונים

  1. באמצעות אימון שנקבע בניתוח מרכיבים עיקרי (PCA)
    הערה: במהלך ניסוי voltammetry, פלט מופק כנוכחי, שהוא התוצאה של חמצון דופאמין והפחתה, משמרות pH, ורעש אלקטרוכימיים. PCA מאפשרת הפרדה של גורמים אלה, כך שניתן לבודד את המרכיבים הרצויים (DA ו- pH) ולהסיר רכיבים נוספים שעשויים לעוות את האותות הרצויים (לתיאור מפורט יותר, ראה 15, 16).
    1. הקצאת גורם כיול התפוקה נוכחית דואר (כ 5-10 Na / מיקרומטר) לאחר PCA כדי לאפשר ערכי ריכוז של analytes שייקבעו.
    2. השתמש בערכת ההדרכה שהושגה במהלך ניסוי ל" רכבת "מודל PCA להפריד את התובע, pH, וגורמים אחרים. PCA לוקחת אימון להגדיר voltammograms המחזורית (שנאסף בסעיף 3.1.8) וקובעת שמאפיינים מהותיים של voltammogram יכולים לשמש כדי לזהות כל אנליטי שנאסף במהלך הקלטות voltammetry in vivo.
    3. כדי לקבוע את מספר המרכיבים העיקריים כדי לשמור, להשתמש מלינובסקי F-מבחן. בדרך כלל, לשמור רק 2 או 3 מרכיבים עיקריים אשר בדרך כלל להסביר על 95-99% מהשונות בנתונים. לדיון נוסף ביישום מלינובסקי F-הבדיקה, לראות 17.
      הערה: לאחר מספר הרכיבים נקבעים, ניתוח PCA יעילות יהיה פרויקט voltammograms נמדדה מהתובע והכשרת pH קובעת על המרכיבים העיקריים שנשמרו.התוצאה היא סדרת הנתונים שסונן כך שהנתונים רק DA (או pH) נשאר ונתונים השייר שאינו דומה DA או pH מוסר (ראה תוצאות נציג לתוצר צפוי). להסבר מפורט יותר וצעד צעד לפי הוראות לשימוש בPCA עבור ניתוח voltammetric לראות גיליון חומרים ו -16, 17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

FSCV בשילוב עם השתלת צנתר intraoral שימש לבחון כיצד סוכרוז, tastant תיאבון, מודולציה שחרור DA phasic בליבת NAC. לפני עירוי tastant, גירוי חשמלי (150 מיקרו-אמפר, 60 הרץ, 24 פעימות; שצוין על ידי בר האדום) של VTA מייצר עליות חזקות בשחרור DA phasic בNAC (איור 1) איור 1 מציג עלילת צבע עם פוטנציאל ב. ציר y, זמן על ציר x, ונוכחי (מיוצג כצבע שווא) על ציר z. מתחת לעלילת הצבע הוא ריכוז DA לעומת עקבות זמן. ריכוז לעומת הזמן נקבע באמצעות העקבות הנוכחיות לעומת זמן בפוטנציאל החמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

משלוח tastant intraoral בשילוב עם FSCV מאפשר ניתוח של תגובות DA "בזמן אמת" לflavorants האוראלי. ישנם שלושה שלבים קריטיים בפרוטוקול הנדרשים למדידות DA מוצלחות. ראשית, השתלה תקינה של הצנתר דרך הפה היא קריטית לאספקת flavorants. על מנת להבטיח כי קטטר מוכנס מאחורי טוחנת הראשונה ותקוע במקום מונע את הקטטר מלאבד פתיחות ומונע הסרת בשוגג על ידי בעלי החיים. שטיפת הצנתר בימים הראשונים שלאחר ההתאוששות היא גם חשובה, שכן המזון הרך הניתן לבעלי החיים במהלך 2 או 3 הימים הראשונים שלאחר נית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים של NSF (RJW) ועל ידי המכון הלאומי לשימוש בסמים של המכונים הלאומיים לבריאות ומרכז ה-FDA למוצרי טבק (CTP) תחת פרס מספר P50DA036151(EJN ו-NAA). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפה הרשמית של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלקטרודת גירויPlasticsOneMS303/2-A/SPCבעת ההזמנה, בקשו חיתוך של 22 מ"מ מתחת לפדסטל (pedestal)
קנולה עבור אלקטרודהמערכות ביו-אנליטיותMD-2251
ניבוב זכוכיתמערכות A-M624503
סיב פחמןThornelT650
מכשיר למשיכת אלקטרודותNarishige InternationalPE-22
מבודד גירויים של Neurologfigure-materials-1 Digitimer Ltd.DS4
בידוד מתכווץ בחום3MFP-301
חוטים מבודדים עבור אלקטרודותSquires electronicsמותאם אישיתL 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
מיקרומניפולטוראוניברסיטת אילינוי בשיקגו, סדנת ההנדסה למכונות
אפוקסיITW Devcon14250דבק אפוקסי של 5 דקות
קו-פולימר של פרפלורו-3,6-דיוקסה-4-מתיל-7-אוקטן-חומצה סולפונית וטטראפלואורואתילןכוח יוניLQ-1105כלומר, Nafion
צבע כסףאלקטרוניקה של כרומטוגרפיה גזית (GC Electronics)22-023
ספק כוחBK Precision9110
צינוריות עבור קטטרים תוך-פה (intra-oral)Intramedic427426PE 100, קוטר פנימי (I.D.) = 0.86 מ"מ; קוטר חיצוני (O.D.) = 1.52 מ"מ
צינור להזרקה תוך-הפית (intra-oral)Fischer Scientific02-587-1Aקוטר פנימי 1/32"; קוטר חיצוני 3/32"
משאבת מזרקים עבור תא זרימהPump Systems Inc.NE 1000
צמנט כירורגיDentsply Caulk675571 ו-675572
מפעיל פנאומטיVICIA60ממשק שסתומים דיגיטלי בעל 6 מיקומים
ממשק שסתום דיגיטליVICIDVI230 VAC
ראש-חיישן מרובע (Quad headstage)אוניברסיטת צפון קרוליינה, מתקן האלקטרוניקה
ספק כוח UEIאוניברסיטת קרוליינה הצפונית, מתקן האלקטרוניקה
תיבת פריצה (Breakout box) של UEIאוניברסיטת צפון קרוליינה, מתקן האלקטרוניקה
ספק כוח למשאבת מזרקים למתן חומרי טעם (tastant syringe pump)Med AssociatesSG-504
משאבת מזרקים TastantMed AssociatesPHM-107
מיקרו-אלקטרודת טונגסטןמיקרו-גששים (MicroProbes)WE30030.5A3
אלקטרודת ייחוס של חוט כסף עם AgClמדד InVivoE255A
סוכרוזסיגמא80497
מגנזיום כלורידסיגמאM8266
נתרן כלורידסיגמאS7653
חומצה פרכלוריתסיגמא244252
חומצה הידרוכלורית (4 M)סיגמא54435
נתרן הידרוקסידסיגמא306576
מימן פéroקסידסיגמאH1009
דופמין הידרוכלורידסיגמאH8502
תוכנת TarHeel HDCVאוניברסיטת צפון קרוליינה-צ'פל היליש לבקש את התוכנה: לחצו כאן להגעה לדף בקשת התוכנה

מקורות

  1. Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
  2. Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
  3. Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
  4. Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
  5. Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
  6. Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
  7. Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
  8. Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
  9. Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
  10. Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
  11. Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
  12. Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  13. Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
  14. Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
  15. Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
  16. Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
  17. Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
  18. Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
  19. Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
  20. Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
  21. Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
  22. Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
  23. Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
  24. Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

null

תגיות

בחינת המהירה דופמין Dynamics עם הסריקה מהירה Voltammetry המחזורי במהלך פנים הפה Tastant מנהל בחולדות ערה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.