מאמר שיטה

דור של תאי גזע שומן האדם דרך Dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה

11.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52485

⸱

7 במרץ 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1IUCPQ Research Center, 2CHU de Québec Research Center, 3Laval University

במאמר זה

סיכום

אדיפוציטים בוגרים עשויים להוות מקור שופע לתאי גזע באמצעות דה-דיפרנציאציה, מה שמוביל לאוכלוסייה הומוגנית של תאים דמויי פיברובלסטים. עיכול קולגנאז משמש לבידוד אדיפוציטים בוגרים משומן אנושי. מטרת הפרוטוקול שלנו היא להשיג תאי שומן רב-עוצמתיים ומפורקים מתאי שומן בוגרים אנושיים.

תקציר

הוכח כי אדיפוציטים בוגרים הופכים את הפנוטיפ שלהם לתאים דמויי פיברובלסטים במבחנה באמצעות טכניקה הנקראת תרבית תקרה. ניתן לבודד אדיפוציטים בוגרים גם מרקמת שומן טרייה לצורך אפיון ספציפי למחסן של תפקודם ותכונותיהם המטבוליות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס היטב לבידוד אדיפוציטים בוגרים מרקמות שומן באמצעות עיכול קולגנאז, והשלבים הבאים לביצוע תרביות תקרה. בקצרה, רקמות השומן מודגרות במאגר קרבס-רינגר-הנסלייט המכיל קולגנאז כדי לשבש את מטריצת הרקמות. אדיפוציטים בוגרים צפים נאספים על המשטח העליון של המאגר. תאים בוגרים מצופים בבקבוק T25 מלא כולו במדיה ומודגרים הפוך למשך שבוע. גישה חלופית לתרבית צלחות של 6 בארות מאפשרת אפיון של אדיפוציטים העוברים דה-דיפרנציאציה. מורפולוגיה של אדיפוציטים משתנה באופן דרסטי עם הזמן של התרבות. ניתן לבצע אימונופלואורסצנציה בקלות על שקופיות המעובדות בצלחות של 6 בארות כפי שמודגם על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה FABP4. חלבון FABP4 קיים באדיפוציטים בוגרים אך מווסת באמצעות דה-דיפרנציאציה של תאי שומן. דה-דיפרנציאציה בוגרת של אדיפוציטים עשויה לייצג דרך חדשה לטיפול בתאים והנדסת רקמות.

מבוא

דה-דיפרנציאציה במבחנה של אדיפוציטים בוגרים מושגת באמצעות טכניקה הנקראת תרבית תקרה1. בגלל נטייתם הטבעית לצוף בתמיסות מימיות, אדיפוציטים בוגרים מבודדים נצמדים לפני השטח של בקבוק הפוך מלא במדיום תרבית. במשך כמה ימים, תאים משנים את המורפולוגיה הכדורית שלהם והופכים לתאים דמויי פיברובלסטים. התאים המתקבלים, הנקראים תאי שומן לא מובחנים (DFAT), הם מולטיפוטנטיים2. מאמרי מחקר על דה-דיפרנציאציה של אדיפוציטים, במיוחד על תאים אנושיים, מוגבלים. עם זאת, הם כבר סיפקו מידע מעניין לגבי מולטיפוטנטיות, פנוטיפ תאים ויכולת שכפול של תאי DFAT2. אדיפוציטים בוגרים שמקורם בתאי שומן שונים הובחנו בהצלחה, כולל אלה שמקורם ברקמות שומן קרביות ותת עוריותאנושיות 2-4. בנוסף למחסנים אלה, קישימוטו ומשתפי הפעולה דגמו רקמת שומן מרפידות השומן הבוקאלי ופירקו את האדיפוציטים לתאי DFAT5. מצומוטו ועמיתיו יצרו בהצלחה תאי DFAT תת עוריים מחולים המכסים טווח רחב של גילאים, ולרוב התאים היה שיעור שגשוג גבוה ופחות מ-6% הזדקנות גם לאחר 10 מעברים בתרבית2.

תאי DFAT התמיינו מחדש בהצלחה למספר שושלות, כולל שושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות, כונדרוגניות ונוירוגניות2,3,6. תאים אלה מבטאים מספר סמנים של תאי גזע עובריים כגון Nanog וארבעת הגורמים הפלוריפוטנטיים שזוהו Oct4, c-myc, Klf4 ו-Sox23. הם גם מבטאים סמנים ספציפיים לכל אחת משלוש שכבות הנבט7. בנוסף, תאי DFAT דומים לתאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (MSC שמקורו ב-BM) בהתבסס על החתימה האפיגנטית שלהם3. תוך ניצול קיבולת תאי הגזע של תאי DFAT, קבוצות רבות חקרו את הפוטנציאל שלהם לטפל או לשפר מחלות שונות8,9. שיפורים במצבים פתולוגיים, כגון רקמת לב שבורה, פגיעה בחוט השדרה ותפקוד לקוי של סוגר השופכה, נצפו עם הזרקות תאי DFAT במודלים של חולדות של מחלה10-12.

בנוסף לתכונות תאי הגזע של תאי DFAT, הם עשויים לייצג מודל תאי חדש למחקרי פיזיולוגיה של אדיפוציטים. קו התאים 3T3-L1 משמש לעתים קרובות למטרה זו מכיוון שתאים אלה מתמיינים לאדיפוציטים דבקים ואוגני שומנים תחת גירוי אדיפוגני13. עם זאת, תאים אלה מקורם ברקמת עובר עכבר13. כמו כן, לא ניתן לחקור את הספציפיות של הדפו באמצעות מודל זה וייתכן שהוא אינו משקף באופן מלא את הפיזיולוגיה של השומן האנושי14. מעבדות אחרות עובדות עם תאי שומן מבודדים ממאגרי שומן עכברים, אך פיזור השומן אינו דימורפי בעכברים והתצורה האנטומית של חלל הבטן של המכרסם מונעת אקסטרפולציה ישירות לבני אדם15. על מנת לחקור אדיפוציטים בהקשר של הפיזיופתולוגיה של השמנת יתר אנושית, התחשבות בחלוקת השומן בגוף והבדלים ספציפיים למאגר השומן הפכה חיונית16. מגבלות מסוימות של תרביות קדם-אדיפוציטים ראשוניות, כולל כמויות תאים המתקבלות מדגימות ביופסיה של רקמת שומן והזדקנותן לאחר מספר מעברים בתרבית, יצרו את הצורך במודלים חלופיים. פריני ועמיתיו חקרו את הספציפיות של מחסן בביטוי גנים של תאי DFAT שמקורם בשומן קרביים ותת-עורי והשוו אותם לתאי גזע שמקורם בשומן (ASC) מאותו מצבור שומן. הם הראו כי הבדלים בביטוי הגנים ובתפקודם נמצאו בעיקר בין מחסנים מאשר בין סוגי תאים, מה שמרמז על כך שתאי DFAT קרובים מבחינה פיזיולוגית ל-ASC מאותו מחסן. תאי DFAT עשויים להוות אלטרנטיבה מעניינת למודלים זמינים למחקרים על התפלגות שומן בפתופיזיולוגיה של השמנת יתר אנושית. יתרה מכך, תרבית תקרה היא שיטה מבטיחה להשגת תאי גזע בוגרים למטרות הנדסת רקמות.

כאן, אנו מתארים את עיכול הקולגנאז, טכניקה בשימוש נרחב לבידוד אדיפוציטים בוגרים מדגימות השומן התת-עוריות ו/או הקרביים17, ואת השלבים הבאים לביצוע תרבית תקרה ודה-דימינציה של תאים אלה לתאים רב-פוטנטיים, דמויי פיברובלסטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: הפרויקט אושר על ידי ועדת האתיקה של מחקר IUCPQ לפני גיוס חולה. לצורך המאמר / הווידאו הזה, שהשגנו רקמות מ2 חולים: 1) מטופל זכר 62 שנים ישנות עם BMI של 50.7 קילוגרם / מ 2 ו- 2) מטופלת בת 35 עם BMI של 57 קילוגרם / M 2. ניתן לעשות ניסויים עם שני תאי השומן, אך היו מוגבלים לתא אחד שומן לצורך זה וידאו. היבטים טכניים של הווידאו בוצעו עם מטופל 1 וimmunofluorescence FABP4 בוצע בתאי dedifferentiated מחולה 2.

עיבוד 1. לדוגמא

  1. שאל מנתחים לאסוף רקמת שומן מתאי השומן תת עורי וomental בעת הניתוח בריאטרי לפרוסקופי.
  2. במהירות להביא דוגמאות שומן למעבדה בRT ולעבד באופן מיידי.
  3. בצע עיכול במעבדה, באווירה שאינה סטרילי.תאי סופו של דבר הועברו לחדר התרבות וטיפחו בתנאים סטריליים. כדי למנוע זיהום, להכין חיץ KRH עם מים מזוקקים וfiltrated ומעקב על ידי סינון (מסנן 0.22μM) לפני העיכול. צינורות לנקות ביסודיות עם העברה לפני אתנול במכסת מנוע תרבית תאים לבקבוק והכנת צלחת.
  4. הנח רקמת שומן במנה משוקללת מראש ומשקל שיא. תקן את חתיכה קטנה של כל דגימת רקמה (סנטימטר פחות מ 1 2) ב 10% חיץ פורמלין ב RT לפחות 24 שעות לפני הטבעת פרפין. השתמש בדוגמה זו הגלומה לניסויי אימונוהיסטוכימיה (טכניקה לא מוצגת).
  5. מניחים חתיכה בצינור 50 מ"ל ובזק-הקפאה בחנקן נוזלי אחרת לפני האחסון ב -80 ° C למחקרים נוספים ברקמות שומן שלמות (למשל, ביטוי גנים - טכניקה לא מוצג).

2. Collagenase עיכול

  1. מניחים את פיסת רקמת שומן שנותרה במיליליטר tu 50להיות לעיכול.
  2. הוסף 4 מיליליטר של KRH-WB בתוספת collagenase (350 U / ml) לגרם של מדגם בצינור העיכול.
  3. ברר ברקמת שומן במספריים.
  4. מניחים השעיה רקמת שומן טחון שייקרה, 37 ° C, 90 מקסימום סל"ד, לדגירה של 45 דקות (שעה 1 המרבית).

3. טיהור של תאי שומן וPreadipocytes

  1. יוצקים את הפתרון השקוף עם כמה נתחי השומן באמצעות ניילון 400 מיקרומטר רשת לתוך כוס פלסטיק.
  2. עם פינצטה, לשפשף את הכנת התא ברשת הניילון ולשטוף עם 5 מיליליטר של KRH-WB.
  3. בעדינות להעביר את ההשעיה תא filtrated לתוך צינור 50 מיליליטר עם צינורות פלסטיק בזה ומזרק 60cc המצורף בקצה הצינור.
  4. בואו ההשעיה עם adipocytes הבוגרת עומדת על כ 10 דקות, שמאפשרת לתאים כדי להגיע לחלק העליון של המאגר על ידי ציפה.
  5. לאט לאט לשאוב החיץ בחלק התחתון של הצינור באמצעות syrin 60ccיניקת ge.
  6. להוסיף 20 מיליליטר של KRH-WB לשטוף. חזור מצעד 3.4 ל -2 שוטף נוסף.
  7. לאסוף את החיץ להביא את ההשעיה adipocyte לנפח סופי של 5 או 10 מיליליטר, בהתאם לכמות תאים. להמשיך עם שלבים בסעיף 5.
  8. לשחזר את חלק סטרומה וכלי דם למאגר שנאסף עם מזרק 60cc ידי צנטריפוגה (3,000 סל"ד, RT, 5 דקות) לתרבית תאים עיקריות נוספת אם תרצה בכך (טכניקה לא מוצגת).

ספירת תאים 4. למבוגרים adipocyte

  1. טען 10 μl של ההשעיה adipocyte מזועזעת בעדינות בתא ספירה (haemocytometer). לבצע ספירת תאים ארבע פעמים.
  2. לחשב מספר התאים בוגרים מבודדים.

5. מבוגרים adipocyte Dedifferentiation לT-25 Flask

  1. מלא בקבוק תרבות 2 רקמה 25 סנטימטרים עד ¾ מההיקף עם / F12-20% בסרום עגל DMEM.
  2. , על פי ספירת תאים לשפוך 500,000 תאים בוגרים לתוך הבקבוק.
  3. למלא את הבקבוק באמצעות צינור 50 מ"ל עם מדיום לחלוטין ולהסיר בועות רבות ככל האפשר.
  4. לדפוק את כובע unvented על הבקבוק.
  5. נקה את הבקבוק עם אתנול לפני דגירה, כדי למנוע זיהום.
  6. דגירה הבקבוק הפוך במשך שבוע מבלי לגעת בו כדי למנוע תנועה בתרבות שעלולה לשבש את הדבקות סלולרית.
  7. לפני היפוך הבקבוק ב 7 ימים של תרבות ההפוכה, בעדינות לתפעל את הבקבוק ולהסיר את כל המדיום בבקבוק על ידי שאיפה, הימנעות תנועות פתאומיות.
  8. להוסיף 12 מיליליטר של סרום עגל% DMEM-F12-20 ולטפח תאים עם טכניקות סטנדרטיים. כובע מסונן, פרק ניתן להוסיף לבקבוק.

6. למבוגרים adipocyte Dedifferentiation לתוך צלחת 6-גם

  1. מניחים coverslip על החלק התחתון של כל טוב של 6-גם צלחת
  2. הוסף "תותב פלסטיק ½ על גבי כל coverslip.
  3. מלא בארות עם 8 מיליליטר של 20% בינוניים עגל סרום-DMEM.
  4. שים coverslip על כל תותב פלסטיק.
  5. הכנס קצה pipet בין השקופיות והצינור להזרמת תאים שמתחת לסליידר (50,000 תאים לכל טוב).
  6. דגירה צלחות בתרבית תאי חממה סטנדרטית על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך שבוע.
  7. coverslip ההפוך עם תאים מצורפים לכל תרבות היטב המכיל 2 מיליליטר של תקשורת בתוספת 20% בסרום עגל ולהמשיך.
  8. השתמש coverslip עם התאים עוברים dedifferentiation למספר מטרות כוללים immunofluorescence (טכניקה לא מוצגת).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שינויים מורפולוגיים גדולים נוצרים להתבגר adipocytes במהלך dedifferentiation (איור 1). כפי שניתן לראות באיור 2, תאים עוברים dedifferentiation הוכתמו נוגדן אנטי FABP4 לניתוח הקרינה. תאים עם מורפולוגיה עגולה הביעו חלבון FABP4 בעוד רוב התאים כמו פיברובלסטים-לא. לאחר dedifferentiation, יכולים להיות מעובד תאי DFAT עם נהלים סטנדרטיים לכמה קטעים. אנחנו כבר יכולים להגיע ליותר מ -15 קטעים לomental אדם ושורות תאי DFAT תת-עורי (מידע לא מוצג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Dedifferentiation של תאי שומן בוגרים עם טכניקת תרבות התקרה היא גישה חדשה להשגת תאי גזע שומן ממדגם קטן של רקמת שומן מקומית. בהתבסס על הניסיון שלנו ושל אחרים 2, גרם אחד של רקמה מספיקה לצלחת בקבוק 2 25 סנטימטר ולהשיג אוכלוסייה של תאי DFAT שהומוגניות הודגמה על ידי Poloni ומשתפי פעולה 3. dedifferentiation adipocyte נראה אפשרי עם תאים מכל תורם, באופן בלתי תלוי בגיל, המין והמאפיינים אחרים שלהם. בקרב האוכלוסייה של DFAT הושג התוצאה, נותר כמה עגול תאים מוארכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענק דיסקברי של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (371697-2011, AT). המחברים רוצים להודות לעזרתם של המנתחים הבריאטריים ד"ר ס. בירון, F-S. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau וכן כריסטין רסין וקרוליין גניון מבנק הרקמות של IUCPQ. אנו מודים למר ז'אק קדורט מהשירותים האודיו-ויזואליים של מחב"א על צילום ועריכת וידאו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרום בקר אלבומיןסיגמאA7906
אדנוזיןסיגמאA4036
חומצה אסקורביתסיגמאA0278
NaClניתן להשתמש בכל מותג
KClניתן להשתמש בכל מותג
CaCl2להשתמש
בכל מותגניתן להשתמש בכל מותג MgCl2להשתמש בכל מותג
KH2PO4להשתמש בכל מותג
HEPESניתן להשתמש בכל מותג
גלוקוזניתן להשתמש בכל מותג
I קולגנאזWorthington Biochemical CorpLS-004196
DMEM/F-12, HEPES, ללא פנול אדוםGibco-Life Technologies11039-021הוסף לבינוני: 20% סרום עגלים, גנטמיצין (50 ומיקרו; גרם/מ"ל) ו-Fungizone (2.5 ומיקרו; גרם/מ"ל)
סרום עגלים, תוסף ברזל, מעגלים שניזונו בפורמולהSigmaC8056-500 מ"ל
1/2 בתותב פלסטיקIberville2704-CPמק"ט:1000120918 (הום דיפו)
חנקן נוזליLinde
פורמלין סולוטון, ניטרלי חומצי, 10%SIGMAHT501128
פינצטה סטרילית
מספריים
60 סמ"ק מזרקיםBD מזרק
פלסטיק
Krebs-Ringer-Henseleit מאגר מלאי (KRH)הכן מאגר מלאי כדלקמן: 25 מ"מ HEPES pH 7.6, 125 מ"מ NaCl, 3.73 מ"מ KCl, 5 מ"מ CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 מ"מ K<תת>2HPO4. התאם את ה-pH ל-7.4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)הוסף את הרכיבים הבאים טריים למאגר KRH: 4% אלבומין בסרום בקר, 5 מ"מ גלוקוז, 0.1 ומיקרו; M אדנוזין, 560 ומיקרו; חומצה אסקורבית
M KRH-WB בתוספת קולגנאזהוסף 350 U/ml של קולגנאז מסוג I
T25 בקבוק תרבית רקמות כובע לא מאווררSarsted או מותג
צלחת תרבית רקמות 6 בארותBD Falcon או מותג
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ 22x22Fisherbrand12-542-B
כוסות סטריליות
ניתן ניתן ניתן מסוג סטרילייםצינורות מסוג I אחראחר

מקורות

  1. Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
  2. Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
  3. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  4. Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892(2013).
  5. Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
  6. Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
  7. Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
  8. Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
  9. Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
  10. Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
  11. Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
  12. Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
  13. Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
  14. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  15. Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
  16. Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
  17. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
  18. Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FABP4

מאמרים קשורים