עצמי הרכבה של צורות דו-ממדיות מורכבות מחד-גדילי דנ"א אריחים

Summary

ריצוף DNA היא גישה יעילה ליצירת ננו-מבנים ניתנים לתכנות. אנו מתארים את הפרוטוקולים לבניית צורות דו-ממדיות מורכבות על ידי הרכבה עצמית של אריחי DNA חד-גדיליים.

Abstract

השיטות הנוכחיות בננו-ארכיטקטורת DNA הנדסו בהצלחה מגוון מבנים דו-ממדיים ותלת-ממדיים תוך שימוש בעקרונות של הרכבה עצמית. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים כיצד לייצר צורות דו-ממדיות מתוחכמות באמצעות הרכבה עצמית של אריחי DNA חד-גדיליים הניתנים להתייחסות ייחודית הפועלים כפיקסלים מולקולריים על בד מולקולרי. כל אריח חד-גדילי (SST) הוא גדיל DNA של 42 נוקלאוטידים המורכב מארבעה תחומים מודולריים משורשרים הנקשרים לארבעה שכנים במהלך הרכבה עצמית. הבד המולקולרי הוא מבנה מלבן המורכב מעצמו מ-SST. צורה דו-ממדית מורכבת שנקבעה נוצרת על ידי בחירת הפיקסלים המולקולריים המרכיבים (SSTs) מבד מולקולרי של 310 פיקסלים ולאחר מכן הכפפת הגדילים המתאימים לחישול בסיר אחד. בשל האופי המודולרי של גישת ה-SST אנו מדגימים את המדרגיות, הרבגוניות והחוסן של שיטה זו. בהשוואה לשיטות אלטרנטיביות, שיטת SST מאפשרת מבחר רחב יותר של פולימרים ורצפי מידע באמצעות גדילי DNA קצרים שתוכננו ומסונתזים דה נובו.

Introduction

עבודת הרכבה עצמית קודמת חומצות גרעין ^1-25 הובילה לבנייה המוצלחת של מגוון רחב של מבנים מורכבים, לרבות DNA ^{2 - 5,8,10 - 13,17,23} או RNA ^{7,22 3,4,7 תקופתי, 22} ו ^-5 דו ממדים אלגוריתמיים חסימה, סרטים ^10,12 וצינורות ^4,12,13, גבישי 3D ^17, פאונים ¹¹ וסופיים, 2D מעצב ^7,8. שיטה יעילה במיוחד היא מלווה בתמיכת אוריגמי DNA, לפיה גדיל פיגום אחת מקופל על ידי רב גדילי מצרך עזר קצרים ליצירת צורה מורכבת ^{9,14 - 16,18 - 21,25.}

לאחרונה דיווחו שיטה לבניית ננו הדיסקרטי עם צורות 2D נקבעו באמצעות אריחים חד-גדילים (SST), והפגינו מבנים עם מורכבות דומה לאוריגמי DNA ^26. articl זהדואר הוא עיבוד של העבודה הקודמת שלנו ²⁶ ומתאר מפורט פרוטוקולים להסדרת טמפרטורת פני הים מיעון בנפרד לצורות 2D סופיות מתוחכמות עם ממדים שנקבעו בדיוק (רוחב ואורך) ומורפולוגיות. יתרון מרכזי אחד של שיטת SST הוא המודולריות שלה. כל SST המרכיב של מבנה משמש כיחידת בנייה מודולרית בהרכבה, וקבוצות משנה שונות של טמפרטורת פני הים אלה לייצר צורות שונות. כך, הקמנו פלטפורמה כללית לבניית ננו עם גדלים וצורות שנקבעו מגדילי דנ"א קצרים, סינטטיים.

טמפרטורת פני הים מכילים ארבעה תחומים, כל אחת (איור 1 א) באורך 10 או 11 נוקלאוטידים. טמפרטורת פני הים להיקשר כך שהסלילים המקבילים שלהם ליצור סריג DNA מוחזק ביחד על ידי קשרים מוצלבים. כל מוצלב הוא פוספט בין תחומים 2 ו -3 פוספט נמתח באופן מלאכותי בתרשימים לבהירות חזותית. הצלבות מרווחים שני סיבובי סליל (21 בסיסים) מזה (<1B strong> איור). המלבנים מרוכבים מכונים על ידי ממדיהם במספר הסלילים וסיבובי סליל. לדוגמא, מלבן שרוחבו שישה סלילים ושמונה סליל הופך ארוך הפניה כ6H × מלבן 8T. ניתן להשאיר את טמפרטורת פני ים החוצה, הוסיפו, או מחדש בדרך אחרת כדי ליצור מבנים של צורות וגדלים (איור 1 ג) שרירותיות. לדוגמא, עיצוב מלבני ניתן התגלגל לתוך צינור באורך רצוי ורדיוס (1D איור).

לחלופין, סריג SST המלבני ניתן לראות כבד מולקולרי המורכב מפיקסלים SST, כל ננומטר 3 על ידי 7 ננומטר. במחקר זה, אנו משתמשים בבד מולקולרי של 310 טמפרטורת פני הים פנימית באורך מלא, 24 טמפרטורת פני הים באורך מלא המרכיבות את גבולות ימין ועל השמאל, וטמפרטורת פני ים 28 חצי אורך להרכיב את הגבולות העליונים ותחתונים. יש הבד 24 סלילים כפולים מקושרים על ידי הצלבות וכל סליל מכיל 28 סיבובי סליל (294 בסיסים), ולכן הוא מכונה24H × בד מלבני 28T. 24H × בד 28T יש משקל מולקולרי דומה לזה של מבנה אוריגמי DNA שנוצר מפיגום הפאג M13.

Protocol

1. ה- DNA רצף עיצוב

1. השתמש בתוכנת UNIQUIMER ²⁷ לתכנן מבנה SST-סופי על ידי ציון מספר הסלילים כפולים, האורכים של סליל העליון ותחתון לכל סליל כפול, ואת התבנית המוצלב ליצור 24H × בד 28T. לאחר הגדרת פרמטרים אלה, הארכיטקטורה הכוללת (הרכב גדיל וההסדר המשלים) מודגמת בצורה גרפית בתכנית.
2. צור רצפים לגדילים של המבנה שצוין לפגוש ההסדר המשלים ודרישות נוספות (אם בכלל). עיצוב רצפי DNA על ידי מזעור הסימטריה רצף ²⁸ (עבור רוב המבנים).
   1. צור נוקלאוטידים (A, C, G ו- T) באופן אקראי האחד אחד.
   2. נוקלאוטידים התאמה משלימים לאלו שנוצרו בעקבות שלטון בסיס שיוך: לT ולהיפך; C לG ולהיפך.
   3. אל תשתמשו במגזרים חוזרים מעבר לשמונה או תשעה נוקלאוטידים. כאשר נציג כזהאכילת פלחים לצוץ במהלך עיצוב, להשתנות נוקלאוטידים נוצרו לאחרונה עד הדרישה לחזור המגזר זה הנה מרוצה.
   4. אל תשתמשו בארבעה בסיסים, C, G או T ברציפות.
   5. השתמשו נוקלאוטידים מראש שצוין בנקודות ההצמדה חד-גדילים (למשל T ו- G כמו נוקלאוטידים העשרים ואחת ועשרים ושניים, בהתאמה, עבור רוב הגדילים), כדי למנוע החלקת בסיסים סביב נקודות ההצמדה (למשל, אם שני נוקלאוטידים העשרים ואחת ועשרים ושתיים היו T, זה היה אפשרי עבור נוקלאוטיד עשרים ואחת להיקשר לנוקלאוטיד שנוקלאוטיד בעשרים ושתיים אמור להיקשר ל).
3. לשנות רצפי DNA באופן ידני לתיוג streptavidin, את הפיכתו של מלבנים לתוך צינורות, ההיווצרות של מלבנים וצינורות על פני קני מידה שונות שונים, וכדי למנוע צבירה נגרמת על ידי תחומים נחשפו בSST.
   1. החלף את התחומים נחשפו על הגבול של הבד המולקולרי עם tra פולי-TCTS.
   2. לתיוג streptavidin, לעצב את מגזרי ידית (קטע הנוסף יצורף לגדיל הרכיב שיכול להיקשר לעמית משלים כגון גדיל אנטי-ידית) כך שהם יכולים להכיל גדיל אנטי-ידית עם 3 שינוי ביוטין '.
   3. להמרה של מלבן לתוך צינור, להסיר את השורות העליונה ותחתונים מהמלבן ולהכניס שורה חדשה טמפרטורת פני הים שיש לי השלמה ספציפית לאריחים המתאימים בשני לשורה העליונה והשני לשורה תחתונה.
   4. לתחום גדילים חשוף של צורות שונות, להחליף עם מגזרי פולי-T של אורך נוקלאוטידים 10-11, או לכסות על ידי מגיני קצה, כי הם משלימים לתחום החשוף ולסיים עם מגזרי פולי-T 10-11 נוקליאוטידים ארוכים.

2. הכנת הבד המולקולרי

1. להשיג גדילי DNA רכיב של רצפים צוינו מומסים במי RNase ללא מoligonucleotiיצרן דה ב 96 צלחות גם תחתונה V עם oligonucleotides מסונתז בקנה מידת 10 ננומול עם desalting הסטנדרטי. צנטריפוגה 96 הצלחות גם עם גדילי דנ"א לבערך 10 שניות ב 600 x גרם.
   1. פיפטה 1 μl מכל אחת מהבארות 362 עם גדילי דנ"א ל24H × מלבן 28T (איור 3 א) בשעה לכל גדיל 100 מיקרומטר (מפרט יצרן) למבחנת 2 מיליליטר. להוסיף 138 μl של H deionized מזוקק ₂ O לצינור 2 מיליליטר המבחן כדי להפוך את פתרון מניות של תערובת הגדיל בריכוז של 200 ננומטר לכל גדיל.
2. הוסף 50 μl של פתרון 200 מניות ננומטר של תערובת גדיל, 10 μl של חיץ 10X חישול (50 מ"מ טריס, pH 7.9, 10 מ"מ EDTA, 250 מ"מ MgCl _2), ו -40 μl של H deionized מזוקק ₂ O 0.2 צינור מיליליטר PCR. זה עושה את מדגם 100 μl של הבד המולקולרי במאגר חישול 1X (5 מ"מ טריס, pH 7.9, 1 mM EDTA, 25 מ"מ MgCl _2).
3. לחשל samplדואר במשך 17 שעות בCycler תרמית קירור מ -90 מעלות צלזיוס עד 25 מעלות צלזיוס. תכנית Cycler התרמית כדלקמן: רמפה למטה מ -90 ° C עד 61 ° C במהירות קבועה של 5 דקות לכל מעלות צלזיוס; רמפה למטה מ 60 מעלות צלזיוס עד 25 מעלות צלזיוס במהירות קבועה של 20 דקות לכל מעלות צלזיוס; דגירה על 4 מעלות צלזיוס עד המדגם ניתן לקחת מCycler התרמית.
4. הכן 2% agarose ג'ל ילידים.
   1. למדוד 2.4 גרם של agarose לתוך כוס 600 מיליליטר. להוסיף 120 מיליליטר של חיץ 0.5x TBE (44.5 מ"מ טריס-Borate, pH 8.3, 1 mM EDTA) ו -30 מיליליטר מים מזוקקים deionized לכוס.
   2. מיקרוגל במשך 3 דקות (או 40 - 60 שניות יותר לאחר הרתיחה). לחדש את המים איבדו במהלך אידוי על ידי תוספת של 30 מיליליטר של מים, מה שעוזר לשמור על הריכוז של agarose בג'ל על 2%.
   3. מערבולת את התוכן של כוס דקות 1 באמבט מים קר. הוסף 1 מיליליטר של 1.2 מ 'MgCl ₂ (לעשות ₂ ריכוז 10 מ"מ MgCl בג'ל) וטרום-להכתים את שנינות ג'ל6 μl שעות של צבע SYBR הבטוח (1: 20,000).
   4. יוצקים את פתרון ג'ל לתיבת ג'ל יבש ולהכניס 1.5 מ"מ מסרק ג'ל אלקטרופורזה גם 12 עבה. תן הפתרון לחזק במשך 15 - 30 דקות על אף פלטפורמה.
   5. יוצקים חיץ ריצת ג'ל (44.5 מ"מ טריס-Borate, pH 8.3, 1 mM EDTA, ו -10 מ"מ MgCl ₂₎ בתיבת ג'ל. טען 2-3 μl של סולם ה- DNA 1 KB לתוך באר של agarose ג'ל. לערבב 4 μl של צבע 6X bromophenol הכחול (0.25% bromophenol הכחול, 5 מ"מ טריס, 1 mM EDTA, 10 מ"מ MgCl גליצרול ₂ ו -30%) עם 20 μl של המדגם של הבד המולקולרי ולטעון את הפתרון לטוב נוספת של agarose ג'ל.
5. הפעל את agarose 2% הילידים לשעה 2 ב 100 V באמבט מים קרח (bromophenol הכחול, מוצגת בכחול, פועל מהר יותר מגדילי רכיב כך שהוא יכול לשמש כאינדיקציה שאם זמן ריצת 2 שעות מתאים).
6. תמונת ג'ל באמצעות סורק ג'ל עם מסנן מתאים לכתם הבטוח SYBR (איור 2 ).
7. על transilluminator אור כחול, בלו הלהקה הדומיננטית עם ניידות דומה ללהקה של 1,500 זוגות בסיסים של סולם ה- DNA 1 KB באמצעות סכין גילוח נקי חד. מניחים את החתיכה הרצויה ג'ל (ים) בטור ספין ואז לרסק את הג'ל לחתיכות דקות באמצעות העלי microtube. צנטריפוגה ב 438 XG במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
8. למדוד את הריכוז של ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר אולטרה הסגול ב 260 ננומטר.
   1. השתמש 2 μl של DNase ultrapure מים / RNase ללא מזוקקים כריק כדי לכייל את המכשיר.
   2. השתמש היקף שווה ערך של המדגם שנאסף מעמודת הספין כדי לקבל אומדן של ריכוז ה- DNA. הערך שנמדד הריכוז ("" = ng / μl) שהושג בקליטת UV של 260 ננומטר יסייע לקבוע את הגורם לדילול ולAFM הדמיה TEM.
   3. להמיר את הריכוז שנמדד מ( ng / μl) "" ל "B" ב הבא (ננומטר) = 10 × ⁶ / (330 &215 #; מספר נוקלאוטידים).
      הערה: המשקל המולקולרי של נוקלאוטיד הוא 330 g / mol. ערך הריכוז טוחנת מחושב יקבע את הגורם לדילול הדמיה AFM וTEM. באשר למקרה של 24H × מלבן 28T, המדידה המשותפת למדגם המטוהר היא סביב 10-60 ng / μl. ככל שמספר נוקלאוטידים למבנה כזה הוא 14616 דא, הריכוז טוחנת הוא כ 2-12 ננומטר. הריכוז הסופי נקבע על ידי תשואת האוסף (~ 20 - 50%) מצנטריפוגה והנפח של להקת ג'ל נכרת החוצה (הגבוה הנפח, יותר לדלל את המדגם המטוהר).

הדמיה 3. מיקרוסקופית כוח אטומי

1. לקלף נציץ מצורף לדיסק מתכתי דגימה באמצעות סרט דביק כדי לקבל משטח שטוח והכנס את דיסק הדגימה על הבמה ההדמיה.
2. הוסף 40 μl של חיץ חישול 1X ואחרי 5 μl (2-5 ננומטר) של המדגם המטוהר של 24H × 28Tמלבן אל פני השטח נציץ טרי ביקע. אפשר התערובת להסתפק בכ 2 דקות.
3. התקן שבב סיליקון ניטריד שלוחה AFM על בעל שלוחה. השתמש קצה C משולש (תדר תהודה, F ₀ = 40-75 קילוהרץ; אביב קבוע, K = 0.24 Nm ^-1) להדמיה.
4. תמונה לדוגמא במצב הקשה-הנוזל. השתמש בפרמטרים הבאים ההדמיה לסריקה: סריקת גודל של 2 מיקרומטר, 1024 קווים לפתרון, וקצב סריקה של 0.5-1 הרץ (איור 2 ג).
5. במידת צורך, להוסיף 10 μl או יותר של 10 מ"מ פתרון NiCl ₂ להגדיל את כוחו של ה- DNA נציץ מחייבים ^29.

לדוגמא הכנה 4. לתיוג streptavidin

1. ידני לעצב 24H × מלבן 28T כך שגדילי ידית במקומות מסוימים משולבים להיות משלימים לגדילים אנטי-ידית עם שינוי ביוטין, אשר בתורו יכולים להיקשר לstreptavidבאופן ספציפי.
   1. לשנות את הבד המולקולרי על ידי הצמדת קטע 3 '17-נוקלאוטיד שמורכבת מרצף של שני נוקליאוטידים (TT) כspacer וידית 15 נוקליאוטידים (GGAAGGGATGGAGGA) לאריחים 14 בשורה העליונה ו -14 אריחים בתחתית שורה של המלבן (איור 3 א) לתייג את הגבול. רצף זה הוא משלים לגדיל ביוטין '3 שונה נגד ידית (TCCTCCATCCCTTCC ביוטין).
2. לתיוג פנימי, לצרף את קטע 3 17 נוקליאוטידים '8 אריחים פנימיים ו -6 אריחי גבול של המלבן (איור 4 א).
   1. מערבבים את הגדילים 28 עם ידיות (תיוג גבול) עם שאר גדילי הרכיב של 24H × מלבן 28T (334 גדילים) כדי להפוך את פתרון מניות ננומטר 200. מערבבים את הגדילים 14 עם ידיות (תיוג פנימי) עם שאר גדילי הרכיב של 24H × מלבן 28T (348 גדילים) כדי להשיג פתרון מניות ננומטר 200.
3. לboתיוג undary, להוסיף 50 μl של פתרון מניות ננומטר 200 של הגדילים, 6 μl של 100 מיקרומטר הגדילים אנטי-ידית ביוטין שונה, 10 μl של חיץ חישול 10X, ו -34 μl מים ללא יונים מזוקקים ל0.1-0.2 מבחנת מיליליטר PCR. הריכוז הסופי של גדיל הרכיב הוא 100 ננומטר והריכוז הסופי של הגדיל שונה ביוטין אנטי-הידית הוא 6,000 ננומטר. שים לב כי 28 מולקולות של אנטי-לטפל לאגד גדיל ביוטין שונה כדי 24H × מלבן 28T כך הגדיל שונה ביוטין לטפל אנטי-הוא בעודף של 100% על מנת להפוך את מחייב חיובי.
4. לתיוג פנימי, להוסיף 50 μl של פתרון מניות ננומטר 200 של הגדילים, 3 μl של הגדיל הפנימי אנטי לטפל ביוטין שונה ב 100 מיקרומטר, 10 μl של חיץ חישול 10X, 37 μl מים ללא יונים מזוקקים ל0.1 - 0.2 מיליליטר מבחנת PCR. הריכוז הסופי של גדיל הרכיב הוא 100 ננומטר והריכוז הסופי של modifi ביוטין אנטי-הידית אד גדיל הוא 3,000 ננומטר. שים לב כי 14 מולקולות של לאגד גדיל ביוטין אנטי-ידית שונה ל24H × גדיל ביוטין כל כך אנטי-28T להתמודד מלבן שונה היא בעודף של 100% על מנת להפוך את מחייב חיובי.
5. לחשל שני הדגימות בCycler תרמית במשך 17 שעות באמצעות השלבים מתוארים ב2.3.
6. הכן 2% agarose ג'ל ילידים כמתואר בצעדים 2.4.
7. לטהר שתי הדגימות כפי שמתואר בצעדים 2.5.
8. מדוד את הריכוז של מבני DNA הרצויים כמתואר בצעדים 2.6.

5. במיקרוסקופ כוח אטומי לתיוג streptavidin

1. תמונה כל דגימה באמצעות AFM כמתואר בשלב 3 (3B דמויות ו4B).
2. לאחר הסיבוב הראשון של הדמיה, להוסיף 40 μl של חיץ חישול 1X אחרי 1 μl של streptavidin ב 10 מ"ג / מיליליטר למדגם. אפשר התערובת להסתפק בכ 2 דקות לפני reimaging (3C דמויות ו4C).

_כותרת "> 6. המרת מלבן לתוך צינור

1. כדי לעצב צינור מבוסס על המלבן, לשמור את כל הטמפרטורות פני הרכיב במקום מלבד השורות העליונה ותחתונים. להציג את השורה חדשה שטמפרטורת פני ים מתוכננים על ידי שרשור חצי אריחים העליונים ותחתונים של הטורים שלהם לcyclize המלבן המקורי לקונפורמציה צינור (איור 5 א ').
2. מערבבים את השורה החדשה של גדילים (14 גדילים) עם גדילי הרכיב של 24H × מלבן 28T לא כולל שורות העליונים ותחתונים (336 גדילים) כדי להשיג פתרון מניות ננומטר 200.
3. בצע את טיהור ג'ל צעדים 2.2-2.7 (איור 5).

7. הילוכים אלקטרונים מיקרוסקופים הדמיה

1. שוקל 0.06 גרם של formate uranyl ב 3 מיליליטר של מים מזוקקים להכין פתרון כתם formate uranyl המימי 2%. סנן את פתרון כתם formate uranyl המימי 2% באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן מצורף מזרק.
   1. הוסף 5 μl של5 N NaOH למ"ל 1 של פתרון כתם מסונן. בקצרה מערבולת הפתרון צנטריפוגות ב 20,000 x ז.
2. זוהר לפרוק את הרשתות מצופים פחמן (צד מצופה כלפי מעלה) עם ההגדרות הבאות: 25 מילי-אמפר, 45 של, 0.1 mbar, וקוטביות מתח גבוה שלילית.
3. שימוש במלקחיים סגירה עצמית כדי לתפוס את רשת טופלה פורק לזוהר מהקצה.
4. פיפטה 3.5 μl של מדגם על הרשת למשך 4 דקות. השתמש פיסת נייר סינון לפתיל את המדגם על ידי הבאת נייר הסינון במגע עם הרשת מהצד.
5. מייד להוסיף 3.5 μl של פתרון הכתם על הרשת 1 דקות.
6. פתיל את הכתם כמו ב7.4 ולהחזיק את נייר הסינון נגד הרשת 1 - 2 דקות.
7. העבר את הרשת לבעל דגימת TEM ותמונה באמצעות JEM-1400 JEOL מופעלים ב 80 kV עם הגדלה נעה בין 10 K 80 K (איור 5 ג).

8. בניית צורות שרירותיות שימוש Molecular בד

1. לזהות צורה ובחר את הגדילים שמתאימים לצורה על הבד המולקולרי. לצורה משולש לדוגמא, בחר 206 מתוך 362 גדילים לבד המולקולרי.
2. החלף את תחום החשוף (כלומר, לאורך האלכסון של המשולש) עם קטע פולי-T 10-11 נוקלאוטידים ארוך (עיצוב 1 באיור 6 א), או להוסיף מגן קצה שהוא משלים לתחום החשוף ולסיים אותו עם 10 - קטע 11 נוקליאוטידים פולי-T הארוך (עיצוב 2 באיור 6 א) כדי למנוע צבירה.
   הערה: כל שעליך לעשות צריפת טמפרטורת פני הים שמתאימה לפיקסלים של המשולש (ללא שימוש בחוטי מגן) תוביל לצבירה ולא היווצרות להקת המוצר ייחודית על ג'ל. השתמש בעיצוב מגן קצה לצורות שונות כפי שהוא יעיל יותר במשאבים; זה דורש רק ארבע קבוצות נוספות של גדילים (איור 6 ג) בהשוואה ל -14 קבוצות נוספות בעיצוב החלפה (Figurדואר 6B).
3. יצירת ספריית גדיל לבד המולקולרי 310 פיקסלים הכולל סט הליבה (בד 362 SST), 1 * סט (מגיני קצה אשר נקלטים על תחום 1 של SST), סט 2 * (מגיני קצה אשר נקלטים על תחום 2 של SST), הגדר 3 * (מגיני קצה אשר נקלטים על תחום 3 של SST), וקבעת 4 * (מגיני קצה אשר נקלטים על תחום של 4 SST) לתת כולל של 1,344 מגיני קצה.
4. צנטריפוגה הצלחות גם 96 לקבוצות השונות לבערך 10 שניות. Pipet את הגדילים הרצויים מהצלחות על מנת להפוך את פתרון מניות לצורה מסוימת.
   1. לצורה משולש עם מגיני קצה, פיפטה 1 μl של 206 גדילים מקבוצת הליבה, 0 מ * 1 סט, 0 מסט * 2, 0 מסט 3 * 24 וגדילים מקבוצה 4 * לצנטריפוגות 2 מיליליטר צינור. הוסף 20 μl מים ללא יונים מזוקקים לצינור כדי להפוך את פתרון מניות ננומטר 400 של גדילי דנ"א.
5. הוסף 50 μl של פתרון 400 מניות ננומטר של stra DNA NDS, 10 μl של חיץ חישול B 10X (50 מ"מ טריס, pH 7.9, 10 מ"מ EDTA, 125 מ"מ MgCl ₂₎ פתרון מניות ו -40 μl H deionized מזוקק ₂ O לצינור PCR 0.2 מיליליטר. זה עושה את מדגם 100 μl של המשולש במאגר חישול B 1X (5 מ"מ טריס, pH 7.9, 1 mM EDTA, 12.5 מ"מ MgCl ₂₎ עם גדילים בריכוז של כ -200 ננומטר לכל גדיל.
6. לחשל את התערובת בCycler תרמית במשך 17 שעות כמתואר בשלב 2.3.
7. הכן 2% agarose ג'ל ילידים כמתואר בשלב 2.4.
8. לטהר את המדגם כמתואר בשלב 2.5.
9. למדוד את הריכוז של ה- DNA כמתואר בשלב 2.6.
10. תמונת המדגם תחת AFM כמתואר בשלב 3 (איור 7C ו7D).
11. פיק ולערבב גדילים לצורות שונות תוך שימוש באותה ספריית גדיל. לחשל את הפתרונות השונים ולשלב דגימות מטוהרת של צורות שונות כדי לחסוך זמן במהלך ההדמיה AFM.

jove_title "> 9 אופציונאלי:. אוטומציה רובוט של עיצוב צורה וערבוב נוזלים

1. השתמש בתכנית MATLAB המותאם אישית כדי לסייע לעיצוב של צורות מורכבות.
2. להשתמש בתוכנה כדי לספק הוראות בצורה של רצף pipetting למטפל נוזלי רובוט. השתמש במטפל הנוזלי הרובוט כדי לבחור ולערבב את הגדילים המהווים את צורת היעד.
   הערה: ערבוב עיצוב צורה וגדיל היה אוטומטי כדי לצמצם טעויות אנוש ולהפוך את הבנייה פחות עבודה אינטנסיבית.

10. מלבנים וצינורות מעבר סולמות שונים

1. לבנות מלבנים בגדלים שונים (איור 10), פשוט על ידי שינוי מספר הסלילים מקבילים (H) ומספר סיבובי סליל (T).
2. בצע שלב 3 למלבן בגודל מסוים.
3. בצע שלב 6 לצינור גודל מסוים.

Results

ההרכבה העצמית של טמפרטורת פני הים (איור 1) תניב 24H × מלבן 28T, כפי שמודגם באיור 2. רצפי DNA לטמפרטורת פני הים השונים יכולים להיות שונה / מותאם כדי לאפשר תיוג streptavidin (איור 3 ו -4), את הפיכתו של מלבן לתוך צינור (איור 5), הרכבה העצמית הניתנת לתכנות של טמפרטורת פני הים כדי ליצור צינורות ומלבנים בגדלים שונים (איור 10), והבנייה של צורות שרירותיות 2D באמצעות הבד המולקולרי ...

Discussion

בשלב היווצרות מבנה, חשוב לשמור על ריכוז מתאים של קטיונים מגנזיום (למשל., 15 מ"מ) בתערובת גדיל DNA לDNA ננו העצמי להרכיב. כמו כן, בשלב אפיון agarose ג'ל / טיהור, חשוב לשמור על ריכוז קטיון מגנזיום מתאים (למשל., 10 מ"מ) בג'ל וחיץ ריצת ג'ל לשמור DNA ננו במהלך אלקטרופורזה. ל24H × מבנה מלבן 28T, בדקנו חישול בריכוזים שונים Mg ⁺⁺ ומצאתי כי המבנה שנוצר בדרך כלל בטווח של 10-30 מ"מ Mg ⁺⁺ (עם התשואה הטובה ביותר עם ​​ההיווצרות ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
גדילי DNA	טכנולוגיית		משולבת סעיף 3.1
SYBR כתם ג'ל DNA בטוח	Invitrogen	S33102	סעיף 3.4.2
עמודות ספין לחילוץ ג'ל DNA להקפיא	BIO-RAD	731-6166	סעיף 3.6
בדיקות מנוף ניטריד חד של ברוקר	בדיקות AFM	SNL10	סעיף 4.3
צילום בטוח 2.0 אור כחול Transilluminator	Invitrogen	G6600	סעיף 3.6
צנטריפוגה 5430R	Eppendorf	5428 000.414	סעיף 3.6
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור	Jeol	Jem 1400	סעיף 7.4
Multimode 8	Veeco		קטע 4
טייפון FLA 9000 סורק לייזר	GE Heathcare Life Sciences	28-9558-08	סעיף 3.5
מים מזוקקים טהורים	במיוחד Invitrogen	10977-023	סעיף 3.7.1
דיסק נציץ	SPI Supplies	12001-26-2	סעיף 4.1
דיסק הרכבה מפלדה	טד פלה, בע"מ	16218	סעיף 4.1
רשת נחושת מצופה פחמן	למדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	FCF400-Cu	סעיף 7.2
פינצטה	Dumont	0203-N5AC-PO	סעיף 7.31
מערכת פריקת זוהר	Quorum Technologies	K100X	סעיף 7.2
מנוע DNA Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler	BIO-RAD	PTC– 0240G	סעיף 3.3
ינשוף Easycast B2 מיני ג'ל מערכות אלקטרופורזה	ThermoScientific	B2	סעיף 3.4.3
Seekam LE Agarose 500G	Lonza	50004	סעיף 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus סולם DNA, מוכן לשימוש 75-20000bp	ThermoScientific	SM1333	סעיף 3.4.4
Nanodrop 2000c UV-vis ספקטרופוטומטר	ThermoScientific		סעיף 3.7
מסנן 0.2 אום	קורנינג בע"מ	431219	סעיף 7.1.2