Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית

סיכום

keratocytes דג הזברה להעביר בגיליונות תא מexplants ולספק מודל במבחנה לחקר המנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של ריפוי פצע אפיתל. פרטים אלה פרוטוקולי דרך יעילה להקמת תרבויות explant עיקריות לשימוש במבחני נדידת תאים קולקטיביים.

תקציר

בשל המאפיינים הייחודיים שלהם ניע, keratocytes הדגים ניתק מתרבויות explant כבר מזמן משמשות כדי לחקור את המנגנונים של נדידת תאים בודדת. עם זאת, כאשר explants הוקם, תאים אלה גם לנוע באופן קולקטיבי, שמירה רב של התכונות ההופכות את פרט keratocytes מודל אטרקטיבי ללמוד הגירה: שיעורים מהירים של תנועתיות, lamellae אקטין עשיר נרחב עם כבל אקטין בניצב, ומהירות קבועה יחסית ו כיוון ההגירה. בexplants המוקדם, הדדי המהירה של תאים נודדים באופן אישי עם אלה נודדים באופן קולקטיבי מאפשר הלימוד של התפקיד של הידבקויות תאי תאים בקביעת המצב של הגירה, ומדגיש את הקישורים המולקולריים בין שני המצבים של הגירה. תאים בexplants מאוחר יותר לאבד את היכולת שלהם לנוע במהירות ובאופן קולקטיבי כאפיתל מעבר mesenchymal מתרחש וגנים הקשורים לריפוי פצעים ודלקת באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי. לפיכך, explants keratocyte יכול לשמש כמודל במבחנה לreepithelialization המתרחש במהלך ריפוי פצע עורי ויכול לייצג את מערכת ייחודית ללמוד מנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של תכנית מוגדרת של שינויי ביטוי גנים. מגוון רחב של קווי דג הזברה מוטציה ומהונדסים זמין, המאפשר explants שיוקם מדגים עם רקע גנטי שונה. זה מאפשר את התפקיד של חלבונים שונים בתוך תהליכים אלה יש לטפל באופן ייחודי. הפרוטוקולים המפורטים כאן מתארים שיטה קלה ויעילה להקמת תרבויות explant אלה לשימוש במגוון רחב של מבחני הקשורים לנדידת תאים קולקטיבית.

מבוא

מחקרים של תנועתיות תא התמקדו בעיקר בתאים בנפרד נודדים. Keratocytes תרבית מדגים ודו-חי explants הוכיח להיות מערכת מודל רבת עוצמה כדי לחקור את המנגנונים של תנועתיות תא באמצעות מודלים מתמטיים והן ניסיוניים גישות ^1-6. עבודה ניסויית בתאים בנפרד נודדים נעזר בתנועה המהירה, חלקת הגלישה של התאים, תוך שמירה על צורה, מהירות, וכיוון אחיד. עם זאת, in vivo, תאים לעתים קרובות לעבור באופן קולקטיבי, תוך שמירה על צמתים תא-תא, במיוחד בעובר, ריפוי פצעים, וגרורות. לפיכך, נדידת תאים קולקטיבית הוא אזור גידול והבולט יותר ויותר של מחקר בתחום של נדידת תאים. לאחרונה ההגירה הקולקטיבית של תאים אלה תוארה ⁷ ויש לו תכונות ייחודיות רבות ההופכות אותו למערכת רבת עוצמה כדי לחקור נדידת תאים קולקטיבית במודל ריפוי פצע.

"> כאשר מאזניים קטפו מדג זברה מבוגרת בהרדמה, כמה רקמות אפיתל נשארה מחוברת לחלק התחתון של הסולם. כאשר מדיום תרבית תאים הוא הוסיף, תאי האפיתל אלה, או keratocytes ove_content, להעביר במהירות כיחידה קולקטיבית מהסולם. ניתן לצפות בתרבות explant כמודל ריפוי פצע אפיתל, שבו התאים לנדוד הרחק מexplant כפי שהם היו על פני המטריצה ​​הזמנית של פצע המיטה כדי לבסס מחדש את האפיתל ללא פגע. נתונים אחרונים מצביעים על כך שvivo לשעבר זה מחקה תרבות תכונות רבות של in vivo ריפוי הפצע בדג זברה מבוגרת. שיעורי סגירת פצעים ⁸ לתרגם למהירות הגירה דומה לזה שנצפה במערכת vivo לשעבר ^7. בנוסף, בפצע in vivo ריפוי מודל, הטיפול בקומדין מצביע על כך שיש עצירה דימום אין כל השפעה על שיעור של ריפוי, בעוד שהטיפול בהידרוקורטיזון כדי להקטין את התגובה חיסונית לא לעכב reepithelialization ⁸ . כדג הזברה אינה לדמם כאשר קנה המידה היא להסיר את בעלי החיים, עצירת דימום הוא לא שחקן מרכזי. למרות שמצאנו תאים חיסוניים בexplants, יש לנו לא בחנו את ההשפעות שאולי יש להם בנדידת תאים קולקטיבית.

הפרוטוקול המובא כאן מתאר כיצד להקים תרבויות explant keratocyte דג הזברה שלהבטיח עקביות ושחזור לשימוש במבחנים רבים ביולוגיים. תרבויות explant אלה הן משכנעים במיוחד במודל חוץ גופית לנדידת תאים קולקטיבית מכמה סיבות. ראשית, keratocytes דג הזברה הם תאים ראשוניים בשימוש בתוך שעות של הקמת תרבויות explant. לכן, תאים אלה לא עברו שינויים מורפולוגיים וביטוי גנים הקשורים למעבר של תאים ראשוניים ^9-13. שנית, מערכת זו מהווה מודל לחקר reepithelialization בתגובה לפציעתם ¹⁴ ו, כחלק מהתגובה לפציעה, אפיתל לtr mesenchymalansition תהליך (EMT) הוא יזם כפי שמעיד שינויים בביטוי הגנים וארגון מחדש cytoskeletal ^14,15. לפיכך, השינויים בביטוי הגנים הרקע ותנועתיות המתרחשים בתאים שלא טופלו כבר מאופיינים ולספק הקשר לפרש שינויים בטיפול. יתר על כן, keratocyte הדגים וkeratinocyte האנושית הן תפקודיות שווי ערך; שניהם תאי האפיתל העיקריים של מיניהם ולשחק תפקיד מפתח בריפוי פצע אפיתל. דג הזברה שלישית, מבוגר זוכה להכרה כמערכת מודל עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם ^16-18 כוללים מלנומה וסוגי סרטן אחרים ^19-21, פצע cutaneous ריפוי ^8,14 ורקמות התחדשות ^22-24.

יתרונות טכניים של מערכת מודל זה הם פחות משכנעים. מספר הולך וגדל של קווים מוטנטים ומהונדסים זמינים ללא כוונת רווח, מתקנים מרכזיים. באופן ספציפי, דג הזברה מוטצית הפרויקט (ZMP) בWellcome Trust סנגר המכון שואף ליצור אלל נוקאאוט בכל חלבון קידוד גנטי בגנום דג הזברה. נכון לעכשיו, יש להם מוטציה 11,892 גנים, כ -45% מהגנום, עם 24088 אללים מאופיינים. בנוסף, ZMP מקבל הצעות ויפיק לדפוק outs ללא תשלום. השיטות האחרונות במציאת גן בדג זברה זחל והמבוגר ^25-28 לספק גמישות ללמוד את הפונקציה של גנים חשובים מבחינה התפתחותית שלגישות מהונדסים הן בעייתיות או לא מעשיות.

בשלהם שיעורים מאוד מהירים של תנועתיות ~ 145 מיקרומטר / hr זמן קצר לאחר הקמתה של תרבויות ^29, ניתן להשלים במהירות מבחני (בדרך כלל 24 שעות באו פחות). כפי שניתן הושלמו ניסויים במהירות ובתרבויות לגדול גם ב RT, כמה מהמכשולים הטכניים הקשורים למבחני נדידת תאי יונקים מעורבים מיקרוסקופיה וידאו נמנעים. בנוסף, בגיל של הידוק תקציבי מחקר, zebrafish נשמרים בקלות ובזול.

המבנה וההתנהגות של explant הוא מורכב. כדגים לא לדמם כאשר קנה המידה מוסר, אין זה סביר כי הרבה יותר משכבות אפידרמיס השטחיות יוסרו עם הסולם. Keratocytes נראה סוג התא הדומיננטי בexplant כאשר קשקשים לראשונה הוסרו מהדגים כמו הרוב המכריע של תאים מופיעים להכתים עם נוגדן אנטי E-cadherin ^14. יתר על כן, אין ראיות של fibroblasts בתרבות הראשונית כמו להישפט על ידי העדר כתמי vimentin על ידי immunofluorescence ^14. עם זאת, עם הסרת קנה מידה חוזרת ונשנית, נראה שיש מספר רב של נויטרופילים בexplant (ראה וידאו 1). אנו זיהינו תאים אלה כנויטרופילים המבוססים על תצפיות מורפולוגיים לגודל שלהם, במהירות תנועתיות, והגירתם אל מחוץ לגיליון התא בעת החשיפה לLPS (מידע לא מוצג). בנוסף, תאים אלה כתם בהיר שנינותh נוגדנים לגורם cytosolic נויטרופילים, כמו גם עם מגוון רחב של נוגדני IgG משניים, אשר מציין כי יש להם בשפע FcRs על פני השטח שלהם (מידע לא מוצגים). שכבות תאים מרובות נמצאות בתוך explant. מיקרוסקופיה Confocal חושפת את הנוכחות של שכבה אחת ליד הקצה המוביל ליותר משתי שכבות של keratocytes ליד קנה המידה עם נויטרופילים נראים מעל, מתחת, ובין סדיני keratocyte התא.

בנקודות זמן מוקדמות, תאים בקצה לקטב explant הרב שכבתי, ייזום הגירה קולקטיבית של keratocytes מexplant בשיעורים ראשוניים של ~ 145 מיקרומטר / hr. האזור המכוסה על ידי explant מגדיל במהירות, מה שמוביל לתא התפשטות, מתח בתוך גיליון, ושיעור ירידה במראש של הקצה קדמי. interconversions המהיר בין תאי מנהיג וחסיד הם נצפו בקצה המוביל במהלך ההיווצרות וסגירת חורים שנוצרו באופן ספונטני בתוך גיליון ^7. כתהליך EMT יזם עם explant ממשיך, הברים וכו 'וkeratocytes לאבד תנועתיות מיוחדת, המהירה. ביטוי גנים ושינויים מורפולוגיים בקנה אחד עם EMT, ריפוי פצעים, ותגובות דלקתיות להתרחש תוך 7 ימים של תרבות עם explants נשקלים קיימא עבור כ 10 ימים ^14.

פרוטוקול

פרוטוקול זה תואם את עקרונות הרווחה AVMA בעלי החיים לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה ואושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטה במערב התיכון.

1. הכנת ההרדמה, הציוד, ומדיה

1. Dechlorinate כ -1.5 ליטר של מים ברז או באמצעות סוכן מסחרי dechlorinating (זמין בחנויות לחיות מחמד) או על ידי ומאפשר עמדת מים למשך 24 שעות. להשיג שלוש 1 כוסות L ולמלא כל אחד עם 500 מיליליטר מים dechlorinated. תווית אחת להחזקת דגים לפני כל הליך ואחד להתאוששות. לכוס השלישית, להוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר של methanesulfonate tricaine; זה הופך את הכוס שבדגים יהיו בהרדמה.
2. מלא מגש רדוד עם קרח, לחמם את מדיום התרבות (1640 RPMI, 10% FBS (בסרום שור עוברי), 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, 100 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 25 מ"מ HEPES) לRT, ולאסוף פינצטה של ​​צורף נקי. פינצטה נקייה על ידי immerלשיר הטיפים באתנול 70% ועוברים דרך מבער בונזן, המאפשר אתנול לשרוף.
3. להחליט אם ההליך יבוצע ללא הגדלה, עם זכוכית מגדלת מסחרית, טבלה עליונה מואר עם 2 - 10X הגדלה, או לנתח מיקרוסקופ (תלוי לחלוטין בהעדפה אישית).

2. הקמת תרבויות explant

1. לתפוס את המספר הרצוי של דגים ומקום בכוס אחזקה. העבר את דג בודד לכוס ההרדמה; עדיף להרדים דגים בנפרד.
2. לעקוב אחר ההשפעות של הרדמה על ידי התבוננות תנועת שחייה וזימים של הדג. כהרדמה מתקדמת, תנועת זימים מאטה והדגים ישחו בצורה לא יציב ולעתים קרובות במהופך; לשקול דגים הרדימו בהקדם תנועת זימים מפסיקה. אל תשאירו את הדגים לתקופות ארוכות יותר באמבטיה ההרדמה כמו זה עלול לגרום למותם של הדגים.
3. הסר דגים מכוס ההרדמה וההעברהלקרח, הצבת הדגים אופקי עם הזנב מול מחזיקה פינצטה ביד. אם חווה עם הטכניקה ואם דגים מרובים לשמש כדי להפוך את explants, לשקול הצבת הדגים הבאים בכוס ההרדמה בשלב זה.
4. כדי להסיר קשקשים, פינצטה עמדה במקביל לדג עם קצה בקצה קנה המידה. לדכא צד שטוח של פינצטה מעט לצדו של הדג כדי לגרום לקנה המידה לרומם מהגוף של הדג. אחוז בקנה מידה עם פינצטה, למרוט, ומקום (ללא היפוך) בצלחת תרבית רקמה. חזור על התהליך, הסרת מקסימום של 12 קשקשים ממבוגרים גדולים (6 מכל צד), הימנעות אזור הזימים, קו הרוחב, וסנפירים.
5. מניחים את הדגים לתוך כוס ההתאוששות ולפקח כדי להבטיח שהיא מתאוששת מההשפעות של הרדמה. בשלב זה, ניתן להעביר בחזרה לדגי טנק בודד. לאפשר לדגים להתאושש במשך לפחות 21 ימים כדי לאפשר להתחדשות בקנה מידה מלאה.
6. בהתאם לעיצוב ניסיוני, למקם עד 20 סולמות לכל צלחת שטופלה תרבות פלסטיק 35 מ"מ רקמה או 4-6 קשקשים לכל צלחת זכוכית תחתונה. לאפשר קשקשים לדבוק בצלחת לפני הוספה בעדינות תקשורת כדי לא לנתק את הקשקשים מהצלחת.
   הערה: עם ניסיון, יכולים להיות מעובד דגים מרובים לפני התקשורת מתווספת למנה הראשונה.
7. להוסיף 1.2 מיליליטר של מדיה מלאה (ראה 1.2 לעיל) לכל מנה 35 מ"מ.
8. רצוי דגירה תרבויות explant על ​​28 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ לתקופה הרצויה של זמן, עם או בלי טיפול נוסף. לחלופין, דגירה תרבויות על במה מיקרוסקופ מחוממת או בתוך חדר תרבות תא חי למיקרוסקופיה וידאו.

3. Brightfield ומיקרוסקופי וידאו

1. מנות עמדה המכילות גיליונות תא לבמה מיקרוסקופ ותחילה להתמקד באמצעות העדשה האובייקטיבית 4X.
   ניתן להשתמש בהגדלות גדולות יותר, תלוי בניסוי: הערה. סימון המיקום שלכל גיליון תא ו / או נטייה של המנה על הבמה יקל לקחת תמונות לאורך זמן עם הגיליונות בערך באותו הכיוון.
2. הסר מנות מהחממה ולצלם בנקודות זמן שונות, על פי כל פרוטוקול ניסוי ואת המקום בחזרה לתוך החממה ולו רק תמונות סטילס נדרשות על מסגרת זמן הניסוי.
3. בעת ביצוע מיקרוסקופיה וידאו, לשים לב לדברים הבאים:
   1. מקם את קנה המידה / גיליון התא מתפתח בתוך שדה הראייה כך שגיליון התא הנודד נשאר בשדה הראייה למשך הווידאו.
      הערה: זה עשוי לקחת קצת ניסיון בהתבוננות כיצד תאים להעביר מתחת לקנה המידה. לקטעי וידאו קצרים, זה פחות דאגה מאשר לקטעי וידאו ארוכים יותר.
   2. למסגרות זמן קצרות יותר, דגירה על RT. למסגרות זמן ארוכות יותר (18 + שעות), להשתמש בבמה מחוממת או תא דגירה כדי לשמור על טמפרטורה, איזון pH, וכדי למזער את האידוי של התרבות מ 'edium.

4. קיבוע לImmunofluorescence מיקרוסקופית

1. הכן מראש חמים כל הפתרונות לC ° 28. על מנת לצפות בkeratocytes תחת הקרינה, לגדול תרבויות explant כפי שתואר לעיל באמצעות כלים תרבית רקמת 35 מ"מ זכוכית תחתונה. לחלופין, להשתמש בשקופיות קאמריות זכוכית.
2. להוסיף 0.8 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב1.1x PBS לכל מנה. אל תסיר את התקשורת והתרבות ראשונה. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון.
3. להוסיף 0.8 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב1.1x PBS לכל מנה. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון.
4. אלא אם כן משתמש בligands החיצוני או epitopes החיצונית, תאי Permeabilize על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של 0.2% Triton X-100 ב 1X PBS. לדגור על RT במשך 5 דקות לאחר מכן לשאוב כדי להסיר את הפתרון.
5. הוסף 0.5 מיליליטר BSA של 1% ב1x PBS ו דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C).
   הערה: בהתאם לתנאי ניסוי, PHAlloidin ניתן להוסיף בשלב זה.
6. לאחר דגירה, לשאוב כדי להסיר את הפתרון ולהמשיך במכתים נוגדן. לחלופין, לאחסן את הכלים התרבות על ידי הוספה לפחות 1-2 מיליליטר של BSA 1% ב1x PBS ל3-4 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס.

פרוטוקול 5. Immunofluorescence

1. הכן פתרונות נוגדן ראשוניים ומשניים לפי המלצות היצרן.
   הערה: אם המלצות יצרן אינן זמינות, דילול טוב התחלה של נוגדנים ראשוניים (בBSA 1% ב 1x PBS) היא 1: 500 לpolyclonal ו1: 1,000 לנוגדנים חד-שבטיים; דילול התחלה טוב לנוגדנים משני הוא 1: 1,000. התאם דילולים של המניה המקורית שהתקבלה מהיצרן גבוה יותר אלה אם האות חלש, נמוך יותר אם האות חזק ורקע הוא בעיה.
2. לשאוב BSA 1% בפתרון 1x PBS. הוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת נוגדן ראשונית דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C).
3. הסר את פתרון הנוגדן הראשוני, מקום לתוך נקי ושכותרתו 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge, ולהקפיא ב -20 ° C.
   הערה: זה מאפשר לשימוש החוזר של הנוגדן הראשוני, במידת צורך.
4. לשטוף את הצלחת 3 - 5 פעמים עם PBS 1x, הסרת ושלכת PBS לאחר כל שטיפה.
5. הוסף 0.5 מיליליטר של פתרון נוגדנים משני. אם תרצה, להוסיף phalloidin fluorescently שכותרת (להלן הריכוז המומלץ של כל יצרן) בשלב זה. דגירה עבור שעה 1 (ב RT) או O / N (4 ° C).
   הערה: שימוש בfluorescently שכותרתו phalloidin מאפשרת הדמיה של סיביים אקטין; מצאנו כי phalloidin 488 שכותרתו עובד הכי טוב בkeratocytes דג הזברה שלנו, אבל יכולה לשמש fluorophores אחרת.
6. הסר וזורקים את פתרון נוגדנים משני.
7. לשטוף את הצלחת 3 - 5 פעמים עם PBS 1x, הסרת ושלכת PBS לאחר כל שטיפה.
   הערה: המנה יכולה להיות מאוחסנת, מכוסה מהאור, ב 4 ° C אם אין אפשרות להתחרותw באופן מיידי; ודא 1x PBS מתווסף לתוך הצלחת לפני האחסון על מנת להבטיח את התאים לא יתייבשו אבל חם לRT (20 - 30 דקות), ולאחר מכן להסיר PBS רק לפני שתמשיך לשלב הבא.
8. כאשר מוכן להתבונן, להוסיף 2-3 טיפות של הרכבה בינונית, עם או בלי DAPI, בהתאם לצרכים הניסיוניים, לתוך הצלחת ולתת לשבת במשך 10 דקות ב RT.
   הערה: אנו משתמשים במדיום זמין מסחרי, המבוסס על גליצרול הרכבה עם DAPI, אך ניתן להשתמש בי תקשורת הרכבה אחרת. המאפשר 10 דקות להרכבה בינונית לשבת בצלחת מאפשר הסרה קלה של coverslip הזכוכית מתחתית הצלחת.
9. לאחר דגירה, ללחוץ בעדינות על צידי הצלחת כדי לשחרר ולהסיר את coverslip. להוסיף טיפה נוספת של תקשורת הרכבה על גבי זכוכית ולמקם את coverslip, תאים למטה, לשקופית.
   הערה: שקול איטום coverslip לשקופית באמצעות ציפורניים ברורות אם השקופית צריכה להיות כל הזמן ליותר מ1-2 ימים.
10. שים לב לשקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    הערה: רוב התמונות שלנו נלקחו באמצעות עדשה אובייקטיבית 40X או 63X תחת טבילת שמן, אבל העדשה האובייקטיבית הספציפית המשמשת יהיו תלויה בפרוטוקול הניסוי.

תוצאות

כפי שמודגם באיור 1, גיליונות של keratocytes ניתן לצפות נודדים החוצה מתחת לקנה המידה בתוך שעות של הקמת תרבות explant. מדי פעם, יכול להיות שנצפה keratocyte בנפרד נודדת שהתנתק מהגיליון הנודד באופן קולקטיבי. בנוסף, כexplant הוקם מדגים שנתלשו בעבר, יש בשפע נויטרופילים הנודדים דרך גיליון. בתקופות ארוכות יותר תרבות, הברים וכו 'keratocyte כתאים עוברים EMT ^14.

שיעוריו הראשוניים של קידום גיליון ...

דיון

השלב הקריטי ביותר להצלחה של תרבות explant keratocyte מאפשר קנה המידה לדבוק בתרבות הצלחת כ 2-3 דקות לפני תוספת של מדיום התרבות. כ -75% מקשקשים ידבק ולגדול גיליונות (מספר התרבויות שנקבעו לגבי כל ניסוי צריך להיות מותאם בהתאם). גיליונות Keratocyte לא יוצרים סביב כל קנה מידה הוסרה מהדגים והניחו בתרבות מכמה סיבות. ראשית, מכתים DAPI של explants מגלה כי כמה קשקשים יש כמה תאים מחוברים ובכך צפוי שהקשקשים אלה לא יהיו לי גיליונות של keratocytes. שנית, היכולת של explants לדבוק בצלחת תרבית הרקמ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כלי תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ (מצופה ליזין Poly-D)	עובי MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 מ"מ הוא הטוב ביותר להסרת כיסוי. קוטר 14 מ"מ מספק שטח תרבות גדול יותר.
מלקחיים בסגנון תכשיטנים שוויצריים, אינטגרה, Miltex 17-303	VWR	21909-460	אנו מוצאים כי מלקחיים צרים ועדינים עובדים בצורה הטובה ביותר להסרת אבנית.