ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בטכניקת מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS) כדי למיין סוגים ספציפיים של תאים עצביים לניתוח עוקב של ביטוי גנים ספציפיים לסוג התא, סמנים אפיגנטיים ו/או ביטוי חלבון.

Abstract

המוח מורכב מארבעה סוגי תאים עיקריים כוללים נוירונים, האסטרוציטים, מיקרוגלים וoligodendrocytes. למרות שהם לא סוג התא הנפוץ ביותר במוח, תאי עצב הם נחקרים ביותר של סוגי התאים אלה ניתנו תפקידם הישיר במשפיעים התנהגויות. סוגי תאים אחרים במוח גם להשפיע פונקציה והתנהגות עצביות באמצעות מולקולות האיתות שהם מייצרים. מדעני מוח צריך להבין את יחסי הגומלין בין סוגי התאים במוח כדי להבין טוב יותר איך אינטראקציות אלה משפיעות פונקציה ומחלות עצביות. עד כה, השיטה הנפוצה ביותר של ניתוח ביטוי חלבון או גן מנצלת את המגון של דגימות רקמה שלמות, בדרך כלל עם דם, וללא קשר לסוג תא. גישה זו היא גישה אינפורמטיבי לבחינת שינויים כלליים בגן או ביטוי חלבון שעשוי להשפיע על תפקוד והתנהגות עצביים; עם זאת, שיטה זו של ניתוח לא להשאיל את עצמה להבנה טובה יותר של תארווחים מסוג ספציפי ביטוי גנים וההשפעה של תקשורת תא אל התא בתפקוד עצבי. ניתוח של אפיגנטיקה התנהגות היה שטח של מוקד גדל שבוחן כיצד שינויים של החומצה דאוקסיריבונוקלאית ביטוי (DNA) השפעת מבנה לטווח ארוך גן והתנהגות; עם זאת, מידע זה עשוי להיות רלוונטי רק אם ניתח באופן תאים מסוג ספציפי נתון שושלת ההפרש וסמנים אפיגנטיים כך שעשויה להיות נוכחים בגנים מסוימים של סוגי תאים עצביים בודדים. תא הקרינה מיון פעיל טכניקה (FACS) המתוארת להלן מספק דרך פשוטה ויעילה לבודד תאים עצביים פרט לניתוח שלאחר מכן של ביטוי גנים, ביטוי חלבון, או שינויים אפיגנטיים של ה- DNA. טכניקה זו יכולה גם להיות שונה כדי לבודד סוגי תאים עצביים ספציפיים יותר במוח לניתוח שלאחר מכן תאים מסוג ספציפי.

Introduction

מטרת הפרוטוקול המתואר להלן היא לבודד סוגי תאים בודדים מאוכלוסייה הטרוגנית של רקמה עצבית לצורך ניתוח עוקב של ביטוי גנים ספציפי לסוג התא, ביטוי חלבון או אפילו סמנים אפיגנטיים. המוח מורכב מסוגי תאים רבים שמקורם בתאי אב מובחנים, ושיש להם תכונות ותפקודים ספציפיים לסוג התא. למרות ההבדלים הללו, סוגי תאים עצביים מובהקים אלה יכולים לבטא קולטנים דומים ומולקולות איתות תוך-תאיות המקשות על הניתוח של חלבונים נפוצים יותר אלה למדידה או לפירוש באופן ספציפי לסוג התא בשיטות קונבנציונליות. מדעני מוח חייבים לזהות את התפקוד וההפעלה של סוגי התאים השונים הללו במוח וכיצד הם יכולים להשפיע באופן אינדיבידואלי על התנהגות מכיוון שבסופו של דבר זה יהיה הצעד הראשון לזיהוי תרופות ספציפיות יותר ומטרות טיפוליות למחלות נוירולוגיות ונוירו-פסיכיאטריות. למרות מטרת העל הזו של מחקר מדעי המוח, זה יכול להיות קשה לבודד סוגי תאים עצביים בודדים מהמוח לצורך ניתוח ביטוי גנים או חלבונים, הפעלת מולקולות איתות או שינוי סמנים אפיגנטיים על ה-DNA. מבין הטכניקות המשמשות כיום, אימונוהיסטוכימיה יכולה לזהות ביטוי של חלבונים באופן ספציפי לסוג התא בשילוב עם צביעה נוספת של סמן ספציפי לסוג התא, אם כי זה מסתמך על נוגדנים ספציפיים שיכולים לצבוע כראוי את החלבונים המעניינים וזה יכול להיות קשה לכמת. הכלאה באתרה יכולה לזהות את הלוקליזציה הספציפית של חומצה ריבונוקלאית שליח (mRNA) בתאים בודדים במוח, אך זהו תהליך מייגע שמגביל גם את הניתוח המשותף של סוגי תאים ספציפיים ומאפשר רק ניתוח של גן אחד או אולי כמה גנים מעניינים. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר משתמשת בלייזר כדי לבודד תת-אוכלוסיות של תאים המומחשים באמצעות מיקרוסקופיה; עם זאת, האופי הגוזל זמן של תהליך זה והתפוקה הנמוכה יחסית יכולים להגביל משמעותית את הניתוח הבא של חלבונים או רמות mRNA, במיוחד אם הביטוי של מולקולות אלו נמוך מלכתחילה. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) היא טכניקה חדשה יחסית בתחום מדעי המוח לבידוד סוגי תאים בודדים מהמוח לצורך ניתוח עוקב של ביטוי גנים¹ ו/או מטרות אפיגנטיות². תהליך זה יכול לשמש גם למיון סוגים ספציפיים של תאים עצביים לניתוח עוקב של ביטוי גנים ספציפי לסוג התא, ביטוי חלבון או סמנים אפיגנטיים. FACS שימש במספר תחומי מחקר רפואיים כגון סרטן ואימונולוגיה במשך עשרות שנים כדי לספור ולמיין תאים שונים על סמך מאפיינים פיזיקליים או ביוכימיים³. בנוסף, ציטומטריית זרימה שימשה באופן קלאסי לניתוח ביטוי חלבון על בסיס כל תא, באמצעות נוגדנים ספציפיים. ההליך המתואר להלן, מנצל טכניקות ציטומטריית זרימה קלאסיות כדי לבודד סוגי תאים בודדים לניתוח עוקב של נקודות קצה של ביולוגיה מולקולרית. ציטומטר הזרימה יכול לנתח כמה אלפי תאים בשנייה, מה שהופך אותו לחלופה מהירה ויעילה לטכניקות שתוארו לעיל. בנוסף, ניתן לבודד תאים על סמך ביטוי תאי של חלבון ספציפי (למשל קולטן נוירוטרנסמיטרים) או שילוב של שני חלבונים או יותר (קולוקליזציה של חלבונים מרובים בסוג תא ספציפי). זה מאפשר למשתמש לבודד סוגי תאים עצביים סלקטיביים מאוד על סמך התכונות המולקולריות שלהם כדי לזהות את תפקודם במוח.

כדי לבצע FACS, תאים עצביים מוכנים לתרחיף של תא בודד המועבר דרך תא זרימה הנושא ומיישר את התאים כך שהם עוברים קובץ יחיד דרך קרן אור ולייזרים לניתוח. מחשב רוכש את הנתונים מכל תא ומתווה אותם על היסטוגרמה לניתוח פרמטרים מוגדרים (גודל, גרעיניות ופלואורסצנטיות). על סמך פרמטרים אלה, ניתן למיין את התאים באופן מיידי לצינורות נפרדים לצורך זיכרונם וניתוח לאחר מכן של כל נקודת קצה רצויה. הפרוטוקול המתואר להלן משתמש בשלושה נוגדנים למיון נוירונים (באמצעות אנטיגן תימוציט 1, נוגדן Thy1), אסטרוציטים (באמצעות טרנספורטר גלוטמט גליה, נוגדן GLT1) ומיקרוגליה (באמצעות מקבץ של מולקולת התמיינות 11B, נוגדן CD11b). ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כמתואר להלן או לשנות אותו עם נוגדנים שונים בהתאם לסוג התא שאדם רוצה לבודד לניסויים שלו.

ישנן כמה אזהרות שיש לקחת בחשבון כאשר קובעים אם פרוטוקול זה מתאים לניסויים ספציפיים. אזהרה מרכזית אחת עשויה להתייחס לסוג התא הספציפי שרוצים לבודד. בפרוטוקול זה, שלושת הנוגדנים המשמשים הם נוגדנים חוץ-תאיים, המאפשרים לנסיין לשמור על סוגי התאים שלמים במהלך הליך הצביעה, ובכך לשמור על שלמות ה-RNA, ה-DNA והחלבונים שבתוכו. ייתכן שמישהו ירצה לבודד סוג תא עצבי ספציפי באמצעות נוגדן המזהה חלבון המתבטא רק בתוך אותו תא מסוים. לדוגמה, ייתכן שתרצו לבודד נוירונים דופמינרגיים באמצעות נוגדן לטירוזין הידרוקסילאז או לבודד נוירונים אצטילכולין באמצעות נוגדן לכולין אצטילטרנספראז. חלבונים אלה הם תוך-תאיים ולכן ידרשו קיבוע וחדירה של קרום התא לצביעה לאחר מכן עם הנוגדנים המתאימים. למרות שזה נעשה לפני ^4,5, תהליך זה עשוי להפחית משמעותית את תפוקת ה-RNA או ה-DNA מהתאים החדירים הללו. אזהרה נוספת עשויה להיות שלא כל הנוגדנים מתאימים ל-FACS. לדוגמה, ניתן כיום להשתמש בנוגדנים שעובדים טוב מאוד עבור כתם מערבי, טכניקה הדורשת דנטורציה של חלבונים. ייתכן שהנוגדן הזה לא בהכרח מתאים לזיהוי סוגי תאים אלה באמצעות FACS בהתחשב בכך שהחלבונים אינם עוברים דנטורציה בשום שלב בפרוטוקול זה ולכן ייתכן שלנוגדנים לא תהיה דרך להיקשר לאנטיגן הטבוע בו. חברות מספקות דפי מפרט המזהים את היישומים שעבורם אושר נוגדן. אם נוגדן לא אושר לזרימה ציטומטרית, זה לא אמור להרתיע אותך מלנסות את הפרוטוקול הזה עם נוגדן מסוים; עם זאת, יש להיות מודעים לכך שלא מובטח שזה יעבוד עבור FACS. אזהרה שלישית של פרוטוקול זה קשורה למספר התאים שמנסים לבודד. FACS היא טכניקה מצוינת להניב כמה שיותר תאים אפילו מחתיכה קטנה של רקמה, אבל ייתכן גם שאם רוצים לבודד אוכלוסייה דלילה יחסית של תאים מאזור קטן יחסית במוח, התפוקה של בעל חיים אחד תהיה נמוכה מטבעה. במקרה זה, ייתכן שיהיה צורך לאסוף את רקמת המוח מכמה בעלי חיים באותה קבוצת טיפול על מנת להניב את מספר התאים הדרושים לניתוח שלאחר מכן; עם זאת, פרסום שפורסם לאחרונה השתמש בהגברה מוקדמת ממוקדת גנים של cDNA לניתוח עוקב של ביטוי גנים ממספר קטן של נוירונים מופעלים (5-6%) מקבוצה גדולה יותר של נוירונים ממוינים, מה שמצביע על כך שניתן לנתח ביטוי גנים אפילו מתת-קבוצות קטנות של תאים עצביים מבלי לאגד מספר רב של בעלי חיים⁶אזהרה אחרונה של טכניקה זו היא שצריכה להיות גישה לממיין תאים שאינו רחוק מדי. סדרן התאים הוא מכונה מסובכת הדורשת הכשרה משמעותית על מנת להשתמש בה כראוי. לפיכך, מכונות אלו מופעלות לרוב על ידי טכנאי מוסמך במתקן ליבה. בנוסף, מטרת הליך זה היא לנתק את הרקמה העצבית, לצבוע אותה לנוגדנים ספציפיים, ולקחת מיד את הדגימות הללו לממיין תוך פרק זמן קצר (אולי חצי יום). מסגרת זמן זו תעזור להגדיל את ההישרדות והתשואה של תאים מבודדים ולשמור על שלמות התאים לעיבוד וניתוח לאחר מכן. אם כל הפרמטרים הללו שתוארו לעיל מתקיימים, FACS היא שיטה מצוינת לניתוח ביטוי ספציפי לסוג התא של גנים וחלבונים מרקמה עצבית.

כל הניסויים בוצעו בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת דלאוור ומדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

Protocol

1. הכנה לאיסוף רקמות (15 - 30 דקות)

1. מלטשים באש שלוש סטים של פיפטות פסטר מזכוכית בקטרים הולכים ופוחתים ומספרים אותם "1" = קוטר של כ-1 מ"מ, "2" = קוטר של כ-0.75 מ"מ ו-"3" = קוטר של כ-0.50 מ"מ.
2. השעו מחדש את אנזים A שעבר ליופיליזציה עם כל Buffer A בהתאם לפרוטוקול המסופק עם ערכת הדיסוציאציה העצבית (ראה טבלת חומרים). אין מערבולת. יש לצטט את התמיסה ל-50 מיקרוליטר ולשמור ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
3. הכינו 1 ליטר של מאגר להסרת מיאלין ומסנן ואקום לעיקור [מאגר להסרת מיאלין = 1,000 מ"ל של 0.1 M תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS), 2 מ"ל של 500 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), ו-10 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA)].
4. חותכים יריעת רשת ניילון לריבועים קטנים בגודל 1 x 1 אינץ' (2.5 x 2.5 ס"מ) שישמשו לסינון פסולת סלולרית וחיטוי בכוס קטנה מכוסה בנייר אלומיניום.
5. הכן 1 ליטר של מאגר כביסה [מאגר כביסה = 1,000 מ"ל של 0.1 M PBS, 2 מ"ל של 500 מ"מ EDTA ו-10 גרם BSA].

2. איסוף רקמות

1. הפעל את אמבט המים ל -37 מעלות צלזיוס.
2. הכן את Buffer X מערכת הדיסוציאציה העצבית על ידי הוספת בטא-מרקפטואתנול ל-Buffer X לריכוז סופי של 0.067 מ"מ (עבור 4 דגימות, הוסף 13.5 מיקרוליטר של 50 מ"מ בטא-מרקפטואתנול ל-10 מ"ל של Buffer X).
3. הכן את Enzyme Mix 1 על ידי ערבוב של 50 מיקרוליטר של אנזים P עם 1,900 מיקרוליטר של Buffer X עבור כל דגימה כמתואר בפרוטוקול של ערכת הדיסוציאציה העצבית לדוגמה, עבור 4 דגימות, ערבב 200 מיקרוליטר של אנזים P עם 7,600 מיקרוליטר של Buffer X.
4. יש להניח את Buffer X באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
5. הנח 2 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת קרה של האנק (HBSS) (ללא Ca⁺⁺ ו-Mg⁺⁺) לבאר אחת של צלחת תרבית סטרילית של 6 בארות עבור כל דגימה שתיאסף ותשמור על קרח לדיסקציה של רקמות.

3. דיסקציה של רקמות (45 דקות - שעה)

1. יש להזריק לבעל החיים נפח מתאים של תמיסת המתת חסד (תמיסת ברביטורט מסחרית, למשל, Euthasol), בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC), ולהזרים את כל הדם בתמיסת מלח קרה של 0.9%.
   1. תן חולדות עם מנת יתר של תמיסת המתת חסד.
   2. יש לעקוב אחר ההרדמה באמצעות נשימה ובאמצעות צביטה בבוהן. כאשר החיה מורדמת מספיק (אין תגובה לצביטה בבוהן ולנשימה עמוקה ואיטית), ניתן לחלחל את החולדה.
   3. כדי לחלחל את החולדה, חתכו את חלל החזה בעזרת מספריים כבדים. חותכים את הסרעפת כדי לאפשר גישה עד הלב. חותכים את הצלעות משני הצדדים עד לכיוון החלק העליון של החזה, כדי לאפשר גישה מלאה ללב. בשלב זה, ניתן להחזיק את כלוב הצלעות הצידה באמצעות זוג המוסטטים.
   4. בצע זלוף לב על ידי החדרת מחט 18 גרם (לחולדות בוגרות) המחוברת למשאבה חשמלית לחדר השמאלי של הלב. המשאבה שואבת תמיסת מלח קרה של 0.9%.
   5. לאחר מכן חתכו את האטריום הימני עם מספריים קטנים כדי לאפשר לדם ולנוזל להתנקז מהגוף.
   6. להחדיר חולדות עם כ-10 מ"ל (לחולדות בוגרות) של 0.9% מלח כדי להסיר את כל התאים והגורמים החיסוניים ההיקפיים.
2. נתח את החלק הרצוי של אזור המוח באמצעות סכיני גילוח סטריליים ודיסקציה מתאימה, ולאחר מכן הנח את חלקי הרקמה לתוך HBSS הקר ללא Ca²⁺ ו- Mg²⁺.
   הערה: הפרוטוקול דורש HBSS ללא Ca²⁺ ו-Mg²⁺ בשלבים המוקדמים של הפרוטוקול מכיוון שיונים אלה עלולים להפריע לאנזימים הנדרשים לדיסוציאציה עצבית.
3. לאחר איסוף כל דגימות הרקמה, חזור לספסל הנקי או למכסה המנוע הסטרילי לעיבוד רקמות.

4. דיסוציאציה עצבית (1 שעה)

1. חותכים כל דגימת רקמה לקוביות קטנות בעזרת סכיני גילוח סטריליים על מכסה צלחת התרבות בת 6 הבארות. פרוטוקול זה שימש לדגימות רקמה של כ-30 - 100 מ"ג, אך מאושר לדגימות רקמה של עד 400 מ"ג. עבור דגימות רקמה גדולות מ-400 מ"ג, יש להגדיל את נפחי המגיב בהתאם.
2. השתמש ב-1 מ"ל של HBSS טרי ללא Ca²⁺ ו-Mg²⁺ כדי להעביר את חתיכות הרקמה החתוכות לקוביות עם פיפטה לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 2 מ"ל. חזור על שלבים 4.1 ו-4.2 עבור כל הדגימה עד שכל הדגימות הועברו לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל.
3. צנטריפוגה את הדגימות ב-300 x g למשך 2 דקות ב-RT ושאיבה סופרנטנט.
4. הוסיפו 1,900 מיקרוליטר של תערובת אנזימים חמה 1, כפי שהוכן בשלבים 2.2 ו-2.3, לכל דגימה וסגרו את הצינורות.
5. דגרו את הדגימות למשך 15 דקות באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס, והפכו את הצינורות מספר פעמים כל 5 דקות כדי להשעות מחדש את פיסות הרקמה המיושבות.
6. בינתיים, הכינו את Enzyme Mix 2 על ידי ערבוב של 20 מיקרוליטר של Buffer Y עם 10 מיקרוליטר של אנזים A מופשר (עבור 4 דגימות, ערבבו 80 מיקרוליטר של Buffer Y עם 40 מיקרוליטר של אנזים A מופשר).
7. הוסף 30 מיקרוליטר של Enzyme Mix 2 לכל דגימה והפוך בעדינות. אין מערבולת.
8. נתק כל דגימת רקמה עם פיפטה פסטר "1", טריטורציה למעלה ולמטה 30 פעמים.
9. דגרו את הדגימות למשך 15 דקות באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס; הפכו את הצינורות מספר פעמים כל 5 דקות כדי לתלות מחדש את פיסות הרקמה המיושבות.
10. נתק כל דגימת רקמה עם פיפטה פסטר "2", טריטורציה למעלה ולמטה 30 פעמים. הימנע מיצירת בועות.
11. נתק כל דגימת רקמה עם פיפטה פסטר "3", טריטורציה למעלה ולמטה 30 פעמים. הימנע מיצירת בועות.
12. דגרו את הדגימות למשך 10 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס; הפכו את הצינורות מספר פעמים כל 5 דקות כדי לתלות מחדש את התאים המיושבים.
13. יש למרוח תרחיף של תא בודד על זן תאים של 80 מיקרון המונח על גבי שפופרת בז של 15 מ"ל כדי להסיר חתיכות גדולות של פסולת ולשטוף את המסנן והתאים עם 10 מ"ל של HBSS (עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺) כדי לעצור את תגובות האנזים. חזור על הפעולה עד שכל דגימה מועברת לתוך שפופרת בז נקייה של 15 מ"ל.
14. צנטריפוגה את הדגימות ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-RT ושואבות מהסופרנטנט.

5. דלדול מיאלין (45 דקות)

1. השעו מחדש ביסודיות את כדור התאים עם 400 מיקרוליטר של מאגר להסרת מיאלין.
2. יש להוסיף כמות מוגדרת של חרוזי הסרת המיאלין ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.
   הערה: נפח חרוזי הסרת המיאלין שנעשה בהם שימוש יהיה תלוי בגודל הרקמה, בגיל החיה ובכמות המיאלין הצפויה באותו אזור מסוים במוח. למשל, עבור דגימת היפוקמפוס של חולדה בוגרת (כ-300 מ"ג), דגרו על הדגימה עם 100 מיקרוליטר של חרוזים להסרת מיאלין.
3. דוגרים למשך 15 דקות במקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס.
4. שטפו כל דגימה עם 5 מ"ל של מאגר להסרת מיאלין.
5. צנטריפוגה את הדגימות ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-RT.
6. בזמן צנטריפוגה של הדגימות, הנח עמודה אחת לכל דגימה בשדה המגנטי של הסדרן המגנטי והנח מסנן נקי של 80 מיקרון על גבי כל עמודה.
7. הכן את העמודות וסנן על ידי שטיפת כל עמודה עם 1 מ"ל מאגר להסרת מיאלין, 3 פעמים (סה"כ 3 מ"ל). אסוף את כל הזרימה במיכל פסולת כגון תחתית קופסת קצה ריקה.
8. מקם צינור תחתון עגול מפוליסטירן 5 מ"ל ישירות מתחת לכל עמודה כהכנה לאיסוף הדגימות.
9. כאשר התאים סיימו את הצנטריפוגה, שאפו סופרנטנט והשעו מחדש ביסודיות 500 מיקרוליטר של מאגר הסרת מיאלין. החל מיד תרחיף תאים על העמודה ואסוף את התאים בצינור שמתחת.
10. שטפו את המסנן והעמודה עם מאגר להסרת מיאלין של 1 מ"ל, 4 פעמים (סה"כ 4 מ"ל).
11. צנטריפוגה את אוסף התאים ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-RT.
12. שאפו את הסופרנטנט והתאים מוכנים כעת לצביעה.

6. צביעת תאים חיים עבור FACS (שעה אחת לצביעה)

1. מערבולת קצרה (2 שניות) את התאים כדי להפריד את הגלולה ולהוסיף מיד 5 מיקרוליטר של בלוק Fc (אנטי-אשכולות של התמיינות 32, CD32), מערבולת שוב, ולדגור במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
2. בינתיים, הכינו את תערובת הנוגדנים העיקרית על ידי הוספת שלושת הנוגדנים העיקריים במאגר הכביסה באופן הבא: 0.125 מיקרוליטר של נוגדן CD11b מצומד (APC) (1:800), 1 מיקרוליטר של נוגדן נגד GLT1 (1:100), ו-0.4 מיקרוליטר של פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) - נוגדן Thy1 מצומד (1:250) לכל 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה. כל דגימה תקבל 100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים ראשונית לדגירה; עם זאת, אם הדגימה שלך גדולה בהרבה מ-400 מ"ג רקמה, ייתכן שתרצה לשקול להגדיל את נפח תערובת הנוגדנים העיקרית שלך בהתאם
3. הכן צינורות לבקרות צביעה בודדות על ידי הסרת 2 מיקרוליטר תאים בלבד מכל צינור דגימה והוספתו לכל צינור בקרת כתמים בודד. בקרות "הכתם הבודד" כוללות: APC-CD11b בלבד, GLT1 בלבד, FITC-Thy1 בלבד, נוגדן משני PE בלבד, והבקרה ה"ריקה" או הלא מוכתמת.
   הערה: יש לייצג את כל הדגימות בכל בקרות הצביעה, ולכן יש להוסיף 2 מיקרוליטר תאים מכל דגימה לכל צינור בקרת צביעה.
4. מערבל בקצרה את הצינורות (2 שניות) והוסף 100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים ראשונית לכל צינור דגימה ו-100 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מתאים לכל צינור בקרת מכתים, מערבל שוב את הצינורות, מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום כדי להגן על הנוגדנים הפלואורסצנטיים מכל אור, ודוגרים את הצינורות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. יש לשמור את הדגימות קרירות (בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס) למשך שארית ההליך כדי לשמור על שלמות הדגימות והנוגדנים.
5. מערבל בקצרה את הצינורות והוסף 2 מ"ל מאגר כביסה לכל צינור.
6. צינורות צנטריפוגה ב-350 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
7. בינתיים, הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית על ידי הוספת 0.2 מיקרוליטר של נוגדן משני נגד ארנב מצומד PE לכל 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה. כל דגימה תקבל 100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים משנית; עם זאת, אם הדגימה שלך גדולה בהרבה מ-400 מ"ג רקמה, ייתכן שתרצה לשקול להגדיל את נפח תערובת הנוגדנים העיקרית שלך בהתאם.
8. לאחר השלמת הצנטריפוגה, זרוק את הסופרנטנט מכל דגימה לכיור ומחק את הצינורות הפוכים על מגבת נייר.
9. מערבל בקצרה את הצינורות והוסף 100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים משנית לכל צינור דגימה ואת הנוגדן המשני המתאים לכל בקרת צביעה, מערבל שוב את הצינורות, מכסה את הצינורות בנייר אלומיניום ודוגר את הצינורות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות><. הערה: צינור בקרת הצביעה GLT1 בלבד אמור לקבל את תערובת הנוגדנים המשנית.
10. לאחר הדגירה, מערבל בקצרה את הצינורות והוסף 2 מ"ל מאגר כביסה לכל צינור.
11. צנטריפוגה את הצינורות ב -350 x גרם למשך 5 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.
12. לאחר השלמת הצנטריפוגה, זרוק את הסופרנטנט מכל דגימה לכיור ומחק את הצינורות הפוכים על מגבת נייר.
13. מערבל את הצינורות והוסף 0.25 מ"ל PBS סטרילי לכל צינור. הדוגמאות מוכנות למיון.
    הערה: תאים נוספים עשויים לדרוש 0.5 מ"ל של PBS סטרילי; עם זאת, עדיף להתחיל בנפח נמוך יותר מכיוון שתמיד ניתן לדלל את הדגימה אם היא מרוכזת מדי בתאים.
    הערה: אופציונלי להוסיף DNase לצינור כדי למנוע גוש של התאים ובכך סתימת הממיין. ניתן גם לסנן דגימות באמצעות פילטר סטרילי של 80 מיקרון ממש לפני המיון על מנת למנוע סתימת הממיין.
14. קח תאים לממיין על קרח. אסוף את אוכלוסיות התאים בצינורות צנטריפוגה נטולי נוקלאז של 2 מ"ל עם 0.5 מ"ל PBS סטרילי בכל צינור.
15. לאחר המיון, סובב את התאים כלפי מטה ב-300 x g למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את רוב ה-PBS והקפיא את התאים במקפיא -80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף למיצוי RNA (ראה 1 לפרטי פרוטוקול נוספים), מיצוי DNA (ראה 2 לפרטי פרוטוקול נוספים) או ליזיס תאים לניתוח חלבון.

Results

החשיבות של דלדול מיאלין וזלוף רקמות

איור 1 מתאר את החשיבות של דלדול המיאלין. דלדול המיאלין (שלבים 5.1 עד 5.12 של הפרוטוקול לעיל) מתרחש כאשר התרחיף החד-תאי מודגר בחרוזי הסרת המיאלין, נשטף ולאחר מכן מועבר דרך העמודה על הסדרן המגנטי. מטרת השלבים הללו היא להפחית את כמות הפסולת הסלולרית הקיימת בכל דגימה. כאשר נוירונים מנותקים ומשולשים, הוא יכול לגזור תהליכים שהם בדרך כלל מיאלינים, ובכך עלול להכתים חיובי עם נוגדן Thy1. התוצאה היא פסולת מיאלינית שעלולה בסופו של דבר להפריע לצביעת הנוג...

Discussion

בדומה לרקמות ומערכות רבות אחרות, המוח מורכב מאוכלוסיית תאים הטרוגנית המתפקדת יחד כדי להשפיע על התנהגות. לניתוח ביטוי גנים, ביטוי חלבונים או שינויים אפיגנטיים מתאים בודדים בתוך אותה אוכלוסייה הטרוגנית יש פוטנציאל לחשוף מידע על תפקוד המערכת בכללותה, לזהות תהליכים תאיים המווסתים הן התנהגות נורמלית והן תהליכי מחלה, ולספק מטרות ספציפיות לסוג התא לטיפולים פוטנציאליים. ייתכן שבעתיד, שינוי התפקוד של סוג תא בודד במוח עשוי לפתוח את המפתח לטיפול מוצלח בהפרעות ניווניות או נוירו-פסיכיאטריות באופן ספציפי יותר, ולהפחית תופעות לוואי לא ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ערכת דיסוציאציה עצבית (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
חרוזים להסרת מיאלין II	Miltenyi Biotec	130-096-733
עמודות LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
מפריד QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
גיליון רשת ניילון	אמזון	CMN-0074-10YD	רוחב 40 אינץ', רשת בגודל 80 מיקרון
Fc Block / anti-CD32	BD Biosciences		תגובתיות BDB550270 לחולדה
נוגדן CD11b מצומד APC	תגובתיות 201809 לחולדה
ארנב אנטי-GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	תגובתיות לחולדה או לאדם
מצומד PE אנטי ארנב נוגדן משני	eBioscience	1037259	נוגדן משני לאנטי-GLT1
מצומד FITC נוגדן נגד עכברים CD90 (Thy1)	תגובתיות 202504 Biolegend לחולדה