מאמר שיטה

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

DOI:

10.3791/52551

⸱

22 באפריל 2015

 ,  ,  , 
1Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר וידאו זה מדגים פרוטוקול מקיף לאיתור וכימות של כל שלבי הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים באותו קטע רקמה. פיתחנו שיטה להתגבר על המגבלות של אימונופלואורסצנציה מרובה עקיפה המתעוררת כאשר נוגדנים מתאימים ממינים מארחים שונים אינם זמינים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

neurogenesis למבוגרים הוא תהליך שבו תאי עצב חדשים נוצרים מתאי גזע עצביים מופעלים באמצעות תת אב ביניים מחויבים יותר ויותר פיקוח הדוק, רב-שלבים. כל אחד מאלה מבטא תת קבוצה של סמנים מולקולריים ספציפיים ש, יחד עם קריטריונים מורפולוגיים ספציפיים, יכול לשמש לזיהוי. בדרך כלל, טכניקות immunofluorescent מיושמות מעורבות נוגדנים תת ספציפיים בשילוב עם סמני התפשטות exo- או אנדוגני. אנחנו במסמך זה מתארים immunolabeling שיטות לאיתור והכימות של כל שלבי neurogenesis היפוקמפוס המבוגר. אלה מהווים היישום של אנלוגים thymidine, זלוף transcardial, עיבוד רקמות, אחזור epitope מושרה חום, אימונוהיסטוכימיה ABC, immunofluorescence העקיף מרובה, מיקרוסקופיה confocal וכימות תא. יתר על כן אנו מציגים פרוטוקול immunofluorescence מרובה רציף העוקף בעיות usually נובע מהצורך בשימוש בנוגדנים העיקריים שהועלו באותו מין המארח. זה מאפשר זיהוי מדויק של כל תת אב היפוקמפוס יחד עם סמן התפשטות בתוך קטע אחד. טכניקות אלה הן כלי רב עוצמה כדי ללמוד את הרגולציה של תת אב שונה במקביל, מעורבותם בפתולוגיות מוח ותפקידם בתפקודי מוח ספציפיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שני אזורים במוח constitutively ליצור נוירונים חדשים לאורך כל חיים, אזור subventricular של חדרים לרוחב ואזור subgranular (SGZ) של gyrus בהיפוקמפוס המשונן (DG). נוירונים היילוד נובעים מהתאים עצביים ולעבור את שלבים שונים של פיתוח מורפולוגיים ופיזיולוגי לפני שהגיע לבגרות 1,2. מתא החלוקה לאט רדיאלי כמו גליה-גזע (סוג 1) שלבים רצופים של מעבר הגברה ותאי ביניים להתעורר. תת מובחן יותר (2 א ו -2 ב סוג הסוג) יש צורה לא סדירה עם תהליכים קצרים, משיקים. הם מייצרים neuroblasts (סוג 3) שיוצא בהדרגה את מחזור התא להפוך נוירונים בוגרים (עם דנדריטים מושטים אל השכבה המולקולרית) ולבסוף להשתלב ברשת בהיפוקמפוס תאי גרגיר כבוגר. בשל המאפיינים הפיסיולוגיים שלהם בפרט תאים אלה מספקים מעגלים עם פלסטיות 3 הצעותיה המשופרותטינג תפקיד ייחודי בתפקוד בהיפוקמפוס. למעשה, מחקרים בעשור האחרון נוצרו ראיות משמעותיות שneurogenesis למבוגרים תורמים לזיכרון מרחבי, הפרדת דפוס והתנהגות 4,5 רגשית.

neurogenesis למבוגרים ניתן ללמוד באמצעות גישות שונות. אנלוגים thymidine לשלב DNA במהלך S-השלב של מחזור התא ולאפשר ניתוח היכרויות לידה, כימות וגורלם של תאים שזה עתה נולד 6-8. יישום רציף של אנלוגים thymidine השונים (לדוגמא: IdU, CldU, edu או) יכול לשמש כדי לחקור את מחזור תא או אוכלוסיות תאים נולדו בנקודות זמן שונות במהלך ניסוי 9. אלטרנטיבה, סמן אנדוגני להתפשטות תאים הוא Ki67. זה בא לידי הביטוי בחלוקת תאים במהלך כל השלבים של מחזור התא (G1, S, G2, M) למעט שלב המנוחה (G0) ותחילת G1 10,11. כדי לנתח את הפנוטיפ של אוכלוסיות תאים שזה עתה נולדו במבוגרי dentatכמה סמנים מולקולריים בשלב מסוים gyrus הדואר יכולים לשמש כגון GFAP, nestin, DCX וNeuN 1,6. GFAP הוא סמן של האסטרוציטים בוגרים אלא גם בא לידי ביטוי בתאים כמו גליה-רדיאלי במוח הקדמי המבוגר. Nestin הוא סיבי ביניים ספציפיים לתאים כמו גליה-רדיאלי ובתאי ביניים מוקדמים. DCX הוא חלבון microtubule הקשורים בא לידי ביטוי באבות ביניים, neuroblasts ותאי עצב לא בוגרים. בהתבסס על הביטוי (שיתוף) של שלושת סמנים אלה ותכונות מורפולוגיות של התאים שכותרתו ניתן לזהות ארבעה תת תא אב נפרד: סוג 1 (GFAP +, + nestin, DCX -), 2 א הסוג (GFAP -, nestin + , DCX -), 2b הסוג (GFAP -, + nestin, DCX +) וסוג 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-תיוג של DCX יחד עם NeuN, המתבטא בתאי עצב postmitotic, מאפשר הבידול של immaturדואר (DCX +, NeuN +) ובוגר (DCX -, NeuN +) נוירונים גרגיר.

הסמנים שהוזכרו לעיל משמשים לעתים קרובות לשיתוף תיוג immunofluorescent ומיקרוסקופיה confocal לאחר מכן לנתח את המספר וזהותם של תאים שזה עתה נולד. זה בדרך כלל דורש נוגדנים ממיני מארח שונים כדי למנוע נוגדן רצוי תגובה צולבת. עם זאת, הרוב המכריע של נוגדנים ראשוניים מתאימים למחקר neurogenesis גדלים גם בארנבות או עכברים (למשל, עכבר α-BrdU, עכבר α-NeuN, ארנב α-Ki67, α-GFAP ארנב). זה מוביל למגבלות חמורות במספר ובשילוב של אנטיגנים שיכולים להיות מוערך בפרוסה אחת. זה בתורו לא רק מגדיל את מאמץ הצביעה, כstainings מרובה צריכה להתבצע, אלא גם עלול לפגוע באמינות של תוצאות. יתר על כן, כמה אנטיגנים רגישים למיסוך פורמלין מושרה קיבעון epitope (למשל, Ki67, Nestin). אנחנו במסמך זה מתארים את השינויים מפרוטוקולי immunolabeling היחיד ו מרובה הקלאסיים (למשל, שליפת epitope, immunostaining רציף מרובה, שימוש בעכברי nestin-GFP מהונדסים 12) שלהתגבר על רבים מנושאים אלה. בפרט, פרוטוקול immunofluorescence מרובה רציף מאפשר צביעה נגד עד ארבעה אנטיגנים שונים, גם אם חלק מהנוגדנים נגזר מאותו המארח. זה מאפשר זיהוי סימולטני של סוג 1, 2 א הסוג, 2b הסוג וסוג תאי 3 אב, כמו גם פעילות השגשוג שלהם בתוך קטע אחד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הנהלים הקשורים בעלי חיים המתגוררים בוצעו בהתאם להנחיה אירופית 86/609 הנחיות / EEC על הטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (Thuringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).

1. הזרקת Intraperitoneal של אנלוגים תימידין

  1. לשקול בעלי חיים היום לפני ההזרקה. לחשב את כמות האנלוגית thymidine חובה לכל הזריקות מתוכננות ביום הבא, כמו גם כרכי הזרקה בודדים מותאם למשקל של 10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות.
  2. הכן פתרון מניות thymidine / מיליליטר 10 מ"ג. (זהירות! אנלוגים תימידין רעילים. בצע את גיליונות הספציפיים בטיחות חומרים (MSDS) המסופקים על ידי הספקים, כלומר, לובשת חלוק מעבדה וכפפות, להשתמש מנדף הכימי).
    1. קח אנלוגי thymidine מהמקפיא ולהביא אותו לRT, כ. 21 ° C. שוקל 10 מ"ג ולהוסיףתמיסת מלח סטרילית (לBrdU וCldU) או 0.04 N NaOH (בתמיסת מלח סטרילית; לIdU), מערבולת. הנח ללפחות 10 - 15 דקות באמבט 50 ° C מים ומערבולת כל 2-3 דקות כדי לפזר את האבקה.
      הערה: פתרונות שימוש לתקופה של עד 24 שעות, כאשר הם מאוחסנים בRT ובמשך כמה שבועות ב -20 ° C. הגן על פתרונות מהאור (כיסוי בנייר אלומיניום). בדוק תמיד למשקעים ולפזר מחדש במידת צורך.
  3. לרסן את העכבר בעורפו וintraperitoneally להזריק מתאים, נפח מותאם למשקל של פתרון מניות (בRT) באמצעות מזרק מינון עדין עם מחט G 30.
    הערה: במקרה CldU וIdU צריכים להיות מנוהלים ברצף באותו בעלי החיים, לשקול להזריק ריכוזי equimolar (למשל, 42.5 מ"ג / קילוגרם CldU ו57.5 מ"ג / קילוגרם IdU, אשר תואם את 50 מ"ג / קילוגרם BrdU). לכן, להתאים את כרכי ההזרקה של פתרונות 10 מ"ג / מיליליטר המניות בהתאם.

2. רקמות הכנה

  1. Prepaמחדש פורמלדהיד 4% בpH חיץ פוספט 0.1 M 7.4 ביום שלפני זלוף. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. Transcardially perfuse עכברים המורדמים העמוקה (isoflurane 3.5%) באמצעות החדר השמאלי עם PBS 10 מיליליטר קר כקרח, ולאחר מכן עם 40 מיליליטר פורמלדהיד קר כקרח (קצב זרימה 5 מיליליטר / דקה). מנתחים את המוח ופוסט-תיקון באותו מקבע למשך 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
  3. העבר את המוח ברציפות ל -10% (24 שעות על 4 מעלות צלזיוס) וסוכרוז 30% (עד כיורים המוח, כ. 48 שעות). להקפאה, לצלול לאט מוח cryoprotected לאיזופנטאן -25 ° C עד אין בועות לצאת מהרקמות. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
  4. לחתוך קטעי העטרה של 40 מיקרומטר עובי על microtome הקפאה (טמפרטורת בלוק ב-25 ל -16 מעלות צלזיוס). העברת חלקים ברצף לפתרון נוזל לרדיאטור המכיל בארות של צלחת תרבית תאי 24 גם (ראו איור 1). חנות ב -20 מעלות צלזיוס.

"איור איור 1. איור סכמטי של העברת פרוסות microtome לתוך צלחת 24 גם. התחל בA1 ומניח פרוסות לאחר מכן לשורה, לאחר A6 ללכת לשורה הבאה B וכן הלאה. כאשר הגיע D6, לחזור לA1 ולהמשיך. הסדר זה ​​של פרוסות מאפשר כימות של כל n th הסעיף של כל מוח. לכימות של תאים שזה עתה נולדו לקחת כל 6 ה סעיף המוח (שווה ערך לתוכן של עמודה אחת), לphenotyping immunofluorescence לנקוט בכל סעיף ה- 12 (שווה ערך לתוכן של 2 שורות לסירוגין של עמודה אחת).

3. Immunostaining

הערה: סעיפים מעובדים בחינם צפו, בדרך כלל 6 צלחות מצוידות היטב עם צלחת ספק והרשת מוסיף. כחריג, חסימה, incubations נוגדן ותגובת ABC נעשים ב12- או 24 גם צלחות בלי מוסיף רשת (0.5-1 מיליליטר לwell מספיק, תלוי במספר של פרוסות שצריכות להיות מוכתמים). במהלך השלבים הבאים, להעביר חלקים בעזרת מכחול דק (לשטוף עם כל פתרון חדש). כל incubations נעשים עם תסיסה מתמשכת (מקסימום 150 סל"ד).

  1. אימונוהיסטוכימיה (שיטת ABC)
    1. העבר את החלקים מנוזל לרדיאטור לTBS ולשטוף היטב (פעם אחת O / N ב 4 ° C, 5 פעמים ב RT במשך 10 דקות כל אחד) כדי להסיר נוזל לרדיאטור לחלוטין.
    2. דגירה למשך 30 דקות בשיעור של 1.5% H 2 O 2 בTBS-T כדי להרוות את פעילות peroxidase אנדוגני. שים לב למבעבע ומחדש לצלול חלקים במידת צורך. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
    3. אופציונאלי: בינתיים מחממים ארון חימום ו- 2 N HCl עד 37 מעלות צלזיוס. סעיפי דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C ב 2 N HCl לפגל DNA. בעדינות חלקים נפרדים בעזרת מברשת.
    4. אופציונאלי: לנטרל סעיפים במשך 10 דקות בpH 0.1 M חיץ borate8.5, RT. בעת העברה, ספוגית בקצרה מוסיף רשת המכיל את הסעיפים על מגבת נייר כדי להסיר שאריות HCl. לשטוף 2 פעמים ב TBS במשך 15 דקות כל אחד.
    5. דגירה בTBSplus לpermeabilize הרקמה ולחסום אתרי נוגדן מחייב נוקבים, שעה 1 בRT.
    6. דגירה בנוגדן ראשוני בדילול מלא בTBSplus, O / N ב 4 ° C. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
    7. דגירה בנוגדנים משני biotinylated המדולל בTBSplus, 3 שעות ב RT. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד. בינתיים ...
    8. הכן מורכב ABC על פי הפרוטוקול של היצרן (1% + B 1% בTBS-T). אפשר לעמוד למשך 30 דקות ב RT לפני השימוש. סעיפי דגירה במגיבה AB עבור שעה 1 ב RT. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
    9. הכן 50 מיליליטר 0.5 מ"ג / מיליליטר DAB בTBS-T ל6- או 12 גם צלחת, מחולק לשני חצאים ו- 4 מיליליטר פיפטה או 2 מיליליטר לכל טוב, בהתאמה. העברת חלקים לפתרון DAB (זהירות! DAB הוא רעיל. בצע הספציפיג MSDS הניתן על ידי הספק, כלומר, לובשים חלוק מעבדה וכפפות, להשתמש מנדף כימי).
    10. הוסף 0.5 מיליליטר 1% H 2 O 2 לפתרון DAB 25 מיליליטר שנותר, לערבב וכרכים פיפטה שווי ערך כאמור לכל אחד ולהתחיל תגובת peroxidase. דגירה של 12 דקות. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
    11. חלקי הר לשקופיות בג'לטין, O אוויר היבש / N. Coverslip עם הרכבה בינונית קבוע.
    12. אופציונאלי: Counterstain לפני הצבת coverslip (ראה סעיף 3.5).
      הערה: אם יחס אות לרעש נמוך בגלל רקע גבוה, לחזור על טיפול H 2 O 2 לאחר הדגירה עם מגיב AB (צעד 3.1.8).
  2. מרובה-immunofluorescence
    1. immunofluorescence בודד או מרובה בו זמנית
      1. העבר את החלקים מנוזל לרדיאטור לTBS ולשטוף היטב (פעם אחת O / N ב 4 ° C, 5 פעמים ב RT במשך 10 דקות כל אחד) כדי להסיר לחלוטיןtifreeze.
      2. אופציונאלי: כצעדי 3.1.3 - 3.1.4.
      3. דגירה בTBSplus לpermeabilize הרקמה ולחסום אתרי נוגדן מחייב נוקבים, שעה 1 בRT.
      4. דגירה בקוקטייל נוגדן ראשוני (למשל, α-BrdU עכברוש, חזיר הים α-DCX, α-GFP העז) בדילול מלא בTBSplus, O / N ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
      5. דגירה בקוקטייל של נוגדנים משני fluorochrome מצומדות (למשל, Rhodamine האדום α-חולדה, Alexa-647 α-שפן ניסיונות, Alexa-488 α-עז; נגזר כולם בחמור) מדוללים בTBSplus, 3 שעות בRT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. מעתה להגן על חלקים מהאור. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
      6. חלקי הר לשקופיות בג'לטין, O אוויר היבש / N. Coverslip עם מדיום הרכבה המימי.
    2. immunofluorescence מרובה רציף עם נוגדנים עיקריים מאותו מין מארח
      1. כצעדי 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. דגירה בfiראשון נוגדן ראשוני (למשל, α-אנטיגן ארנב), O / N ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      3. דגירה בנוגדן הראשון fluorochrome מצומדות המשני (לדוגמא, Rhodamine אדום-conj. חמור α-ארנבת), 3 RT שעות. מעתה להגן על חלקים מהאור. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      4. דגירה בסרום 10% נורמלים ממארח ​​שהנוגדנים הראשוניים (למשל, סרום ארנבת) לRT 3 שעות כדי להרוות paratopes הפתוח בנוגדנים משני הראשונים. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      5. דגירה בTBSplus עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר שברי Fab חד ערכי unconjugated המכוון נגד שורה של הנוגדנים הראשוניים (למשל, IgG α-הארנב (L + H)) כדי לכסות epitopes שיכול להיות מוכרת על ידי הנוגדן השני המשני, O / N ב 4 ° C.
      6. יש לשטוף לפחות 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד. בעת העברה, SWA בקצרהב מוסיף הרשת המכיל את הסעיפים על מגבת נייר כדי להסיר כל שאריות Fab.
      7. דגירה בנוגדן השני עיקרי (לדוגמא, ארנב α-אנטיגן B), O / N ב 4 ° C. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      8. דגירה בנוגדן שני fluorochrome מצומדות המשני (לדוגמא, Alexa-488-conj. חמור α-ארנבת), 3 RT שעות. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד, הר וcoverslip כאמור לעיל.
        הערה: כדי לתייג אנטיגנים עם נוגדנים ממינים שונים מארח להוסיף אותם לצעד 3.2.2.2 והנוגדנים משני המתאימים לשלב 3.2.2.3.
    3. אחד משני הנוגדנים מאותו מין כאחד מהנוגדנים הראשוניים
      הערה: פרוטוקול זה מתאים לחדר לארבעה מכתים נגד BrdU או Ki67 יחד עם GFAP, nestin-GFP וDCX.
      1. לעקוב בקפדנות פרוטוקול הצעדים 3.2.1.1 - 3.2.1.5. עד לנקודה זו להשתמש בסרום חמור רק בTBSplus.
      2. דגירה בTBSplus המכיל 3% עזים בסרום עבור שעה 1 ב RT. זה מכסה paratopes הפתוח בנוגדנים משני α-עז. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      3. דגירה בAMCA-conj. העז α-הארנב המדולל בTBSplus, RT 3 שעות או O / 4 N ° C. לשטוף שלוש פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד, הר וcoverslip כאמור לעיל.
    4. שיתוף מכתים CldU, IdU
      1. יש לשטוף, לפגל ולנטרל את החלקים כאמור בסעיף 3.2.1 (שלבים 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. דגירה עם 20 מיקרוגרם / ברי Fab unconjugated מיליליטר α-עכבר IgG (H + L) בTBSplus, שעת 1 בRT. יש לשטוף 4 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      3. דגירה בקוקטייל המכיל נוגדן ראשוני α-BrdU חולדה (1: 400; מטוהר IgG2) וα-BrdU עכבר (1: 350) מדולל בTBSplus, O / N ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      4. דגירה בקוקטייל נוגדנים משני המכילה חמור biotinylated α-חולדה (1: 500) וFITC-conj. α-העכבר החמור שברי Fab (1: 100). לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      5. דגירה בRhodamine האדום-conj. Streptavidin, שעה 2 ב RT. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד, הר וcoverslip כאמור לעיל.
    5. הגברה של אות הקרינה בעכברי nestin-GFP
      1. להוסיף העז α-GFP לקוקטייל הנוגדן הראשוני.
      2. הוסף נוגדנים משני מצומדות fluorochrome עם מאפיינים דומים לרוח רפאים GFP (כגון conj Alexa 488. חמור α-עז) לקוקטייל נוגדנים משני.
  3. אחזור epitope
    1. לבצע שליפת epitope לאחר שטיפת נוזל לרדיאטור. ספינת קיטור מחממים עם 6 או 12 גם צלחות המכילות pH 0.1 חיץ M ציטרט 6.0 to 95-99 מעלות צלזיוס (כ -25 דקות).
    2. העבר את החלקים למאגר ציטראט החם והקיטור למשך 30 דקות (לכסות את הצלחות עם רדיד האלומיניום כl פלסטיקמזהי אינם עמידים בחום).
    3. מייד למקם את הצלחות באמבט קרח כדי להתקרר. זה עוזר להגן על מורפולוגיה רקמות, אשר היא בעלת חשיבות מיוחדת בעבודה עם חלקים במוח של בעלי חיים שלאחר לידה.
    4. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 10 דקות כל אחד לשטוף החוצה ולנטרל את ציטראט ולהמשיך מכתים.
  4. עכבר נוגדנים ברקמת עכבר
    1. הוסף 20 מיקרוגרם / מיליליטר חד ערכי שברי Fab α-העכבר IgG (H + L; אותו מארח-מינים מ נוגדנים משני) לצעד החסימה הראשון (למשל, צעד 3.1.5 או 3.2.1.3).
    2. יש לשטוף 4 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד, ולהמשיך בפרוטוקול המתאים.
  5. counterstaining הסגול Cresyl
    1. פתרון מחממים סגול cresyl עד 60 ° C (בצנצנת זכוכית). דגירה שקופיות בפתרון החם במשך 3 דקות.
    2. יש לשטוף בaq. dest. ולייבש 2 פעמים 1 דקות כל אחד ב -70%, 96% ו -100% isopropanol.
      3. ברור ל5 - 6 דקות בקסילן או תחליף קסילן וcoverslip עם הרכבה בינונית קבוע תואם.

ניתוח נתונים 4.

  1. ספירת תאים שזה עתה נולדו מוכתם peroxidase בכל סעיף 6 ה לאורך מידת rostrocaudal השלם של הגירוס המשונן. השתמש במיקרוסקופ אור בהגדלה 400X.
  2. הכפל את מספרי תא וכתוצאה מכך עם מרווח הצומת, כדי לקבל הערכה של מספרים כולל של תאים שזה עתה נולד.
  3. תמונת הקרינה שכותרתו חלקים עם מיקרוסקופ לייזר confocal מצויד בלייזרים מתאימים ומערכות סינון. קחו ערימות תמונה בעמדות אקראיות לאורך כל היקף gyrus המשונן בהגדלה 400X ולנתח לפחות 50 תאים שנבחרו באקראי של ריבית לחצי כדור לשיתוף תיוג עם סמנים אחרים.
  4. להכפיל את האחוזים של תאים שכותרתו שיתוף (% / 100) וכתוצאה מכך עם המספרים הכולל של תאים שזה עתה נולד כדי לחשב מוחלטמספרים של אוכלוסיות תאים ספציפיות שזה עתה נולדו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו מוחלים שיטות שתוארו לעיל לכמת ולאפיין תאים שזה עתה נולד בהיפוקמפוס לאחר הלידה והמבוגר. לכן, השתמשנו wildtype וD2 cyclin neurogenesis הלקויה לדפוק את עכברים (Ccnd2 KO) שוכנו בתנאים הידועים להשפיע על השיעור של neurogenesis (כלומר, סביבה מועשרת, EE) 13,14. צביעת DAB immunohistochemical נגד שני Ki67, BrdU, CldU או IdU חשפה באופן עקבי הבדלים במספרים סלולריים שזה עתה נולד בין wildtype והעכברים Ccnd2 KO (איור 3) 15. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימות וזיהוי של תת-אוכלוסיות של תאים שזה עתה נולדו הוא נושא מרכזי במחקר neurogenesis למבוגרים. שילוב סמני התפשטות ונוגדנים נגד חלבונים הביעו בשלבים מסוימים של neurogenesis המבוגר מאפשר זיהוי immunohistochemical של תת-אוכלוסיות אלה. חלק מהנוגדנים או שילובי נוגדן דורש תנאי מכתים ספציפיים.

תיוג של חלוקת תאים עם אנלוגים thymidine סינטטיים הוא עדיין סטנדרט הזהב ללימוד neurogenesis היפוקמפוס המבוגר. זה חיוני כדי לשקול ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לס' טאוש על הסיוע הטכני המצוין. העבודה נתמכה על ידי BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) ו-DFG (FOR1738).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

הכנת רקמות

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מתן אנלוגי תימידין
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdUSigma-AldrichB9285רעיל (מוטגני, טרטוגני)
5-כלורו-2&פריים;-דאוקסיורידין, CldUסיגמא-אולדריץ'C6891רעיל (מוטגני, טרטוגני)
5-כלורו-2&פריים;-דאוקסיורידין, CldUMP ביו-רפואי2105478רעיל (מוטגני, טרטוגני)
5-יודו-2&פריים;-דאוקסיורידין, IdUMP ביומדיקל2100357רעיל (מוטגני, טרטוגני)<
Isoflurane-ActavisPiramal Healthcare700211
אבקת פרפורמלדהיד (PFA)Riedel-De Hä EN16005רעילה ודליקה
PD5206Heidolph Instruments523-52060-00
צינורות מעבדה Masterflex Tygon, Ø 0.8 מ"מThermo Fischer Scientific06409-13
מחט הזנה, ישרה, 21 גרם, קצה זית 1.75 מ"מ, 40 מ"מAgnthos1036
מיקרוטום מקפיא Microm HM 400Thermo Fischer Scientific
24 בארות תרבית תאים צלחות מרובותגריינר ביו-וואן662160
אימונוהיסטוכימיה
ספינת קיטור Tefal vitacuisineTefalVS 4001
Netwell 24 מ"מ מוסיף קרום רשת פוליאסטרקורנינג3479טעון מראש בלוחות תרבית 6 בארות
מוסיף קרום רשת פוליאסטר 15 מ"מקורנינג3477טעון מראש בלוחות תרבית 12 בארות
ערכת מנשא 6 בארות פלסטיק Netwellקורנינג3521עבור 24 מ"מ פוליאסטר רשת קרום מוסיף
מנשא 12 בארות פלסטיק Netwellקורנינג3520עבור 15 מ"מ פוליאסטר רשת קרום מוסיף
Vectastain Elite ABC ערכתוקטורמעבדות PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate)Sigma-AldrichD-5637מסרטן, רגיש לאור
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
נוגדנים ראשוניים
Rabbit IgG1 α-Ki67Novocastra/ Leica BiosystemsNCL-L-Ki67MM1DAB 1:400/IF 1:100; דורש אחזור אפיטופים
ארנב α-GFAP, AS-3-GFמערכות סינפטיות173 0021:500
עז IgG (H+L) α-GFPAcris נוגדניםR1091P1:300
עכבר IgG1 α-nestinAbcamab61421:200; דורש אחזור אפיטופ
חזיר ניסיונות IgG (H+L) α-DoublecortinMerck MilliporeAB22531:500
Rat IgG2a α- BrdU (מיימת)AbD Serotec / Bio-RadOBT0030CXלזיהוי BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
חולדה IgG2a α-BrdU (מטוהר)AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030   לאיתור CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
עכבר IgG1 α-NeuNMerck MilliporeMAB3771:500
עכבר IgG1κ α-BrdUBD Biosciences347580לזיהוי IdU; DAB 1:500/IF 1:350
נוגדנים משניים
חמור ואלפא;-שרקנים IgG (H+L)-ביוטיןדיאנובה711-065-1521:500
חמור ואלפא;-חולדה IgG (H+L)-ביוטיןדיאנובה712-065-1501:500
חמור &אלפא;-עכבר IgG (H+L)-ביוטיןדיאנובה715-065-1511:500
עז ואלפא;-חולדה IgG (H+L)-Alexa Fluor 488בדיקות מולקולריותA110061:250
חמור ואלפא;-עז IgG (H+L)-Alexa Fluor 488בדיקות מולקולריותA110551:250
חמור ואלפא;-עכבר IgG (H+L)-FITC, Fab-FragmentDianova715-097-0031:100
חמור ואלפא;-עכבר IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova715-605-1511:250
חמור &אלפא;-שרקן ניסיונות IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova706-605-1481:250
חמור &אלפא;-חולדה IgG (H+L)-רודמין אדום-Xדיאנובה712-295-1501:250
חמור &אלפא;-ארנב IgG (H+L)-רודמין אדום-Xדיאנובה711-295-1521:250
חמור &אלפא ;-שרקן ניסיונות IgG (H+L)-רודמין אדום-Xדיאנובה706-296-1481:250
Streptavidin-rhodamine Red-XDianova016-290-0841:500
עז α-ארנב IgG (H+L)-AMCADianova111-155-1441:250, עובד רק עם ארנב α-GFAP
Hoechst 33342בדיקות מולקולריותH35701:1000
בדיקות מולקולריותDAPI D13061:1000
חסימה
חמור רסיס Fab α-עכבר IgG (H+L)Dianova715-007-0031:20
חמור Fab-fragment α-rabbit IgG (H+L)Dianova711-007-0031:20
סרום חמור רגילMerck MilliporeS30
סרום ארנב רגילDianova011-000-010
סרום עיזים רגילDianova005-000-001
אלבומין סרום בקרSigma-AldrichA7906
Histology
Cresyl violetSigma-AldrichC5042
Neo-ClearMerck Millipore109843תחליף קסילן לא רעיל
Neo-MountMerck Millipore109016מדיום
Microscopy
Axioskop 2מיקרוסקופיה
LSM 710מיקרוסקופיה
td colspan="4"> משאבת זלוף ערכתהרכבה קבועקרל זייס קרל זייס

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46(2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים