מאמר שיטה

פסיפס דג הזברה Transgenesis לניתוח הגנום פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמד בפתוגנזה גידול

DOI:

10.3791/52567

⸱

31 במרץ 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology & Experimental Therapeutics, Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine, 2Tufts University School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת מחקר זה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש באסטרטגיית טרנסגנזה של פסיפס בדגי זברה כדי להעריך במהירות וביעילות את התרומות היחסיות של אונקוגנים מרובים בהתחלת הגידול והתקדמותו in vivo.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח גנומי מקיף חשף מספר גדול באופן מפתיע של שינויים גנטיים בסוגים שונים של סרטן. זיהוי חזק ויעיל של "מניעים" אונקוגניים בין גידולים אלה והגדרת הקשרים המורכבים שלהם עם שינויים גנטיים בו-זמניים במהלך פתוגנזה של הגידול נותרה משימה מרתיעה. לאחרונה, דג הזברה התגלה כמודל בעל חיים חשוב לחקר מחלות אנושיות, בעיקר בגלל קלות התחזוקה שלהם, פוריות גבוהה, יתרונות ברורים להדמיה in vivo, שימור גבוה של אונקוגנים והמסלולים המולקולריים שלהם, רגישות לגידול והכי חשוב, הזמינות של טכניקות טרנסגניות המתאימות לשימוש בדגים. מודלים של דגי זברה טרנסגניים של סרטן היו בשימוש נרחב לניתוח מסלולים אונקוגניים בסוגי גידולים מגוונים. עם זאת, פיתוח מודל דגים טרנסגני יציב הוא מייגע וגוזל זמן כאחד, וקשה עוד יותר וגוזל זמן רב יותר לנתח את שיתוף הפעולה של גנים מרובים בפתוגנזה של מחלות באמצעות גישה זו, הדורשת יצירת קווים טרנסגניים מרובים עם ביטוי יתר של הגנים הבודדים המעניינים ואחריהם רבייה מסובכת של קווים טרנסגניים יציבים אלה. לפיכך, השימוש בגישה טרנסגנית חולפת פסיפס בדגי זברה מציע יתרונות ייחודיים לניתוח גנומי פונקציונלי in vivo. בקצרה, ניתן להזריק טרנסגנים מועמדים לעוברים מסוג פרא או טרנסגני בשלב תא אחד ולאפשר להם להשתלב יחד בכל תא סומטי בדפוס פסיפס שמוביל לגנוטיפים מעורבים באותה חיה שהוזרקה בעיקר. זה מאפשר לחקור בצורה מהירה יותר וזולה יותר אם וכיצד הגנים המועמדים יכולים לשתף פעולה זה עם זה כדי להניע גידולים. על ידי ביטוי יתר חולף של ALK מופעל בדגים הטרנסגניים המבטאים יתר על המידה MYCN, אנו מדגימים כאן את שיתוף הפעולה של שני האונקוגנים הללו בפתוגנזה של סרטן ילדים, נוירובלסטומה שהתנגדה לרוב צורות הטיפול העכשוויות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן הם מחלות מתקדמות המסומנות על ידי ההצטברות של מוטציות פתולוגיים, מחיקות ורווחי כרומוזום לאורך זמן. מומים גנטיים אלה יכולים להשפיע על תהליכים תאיים רבים, החל ממחזור התא, המוות של תאים, חילוף החומרים וההרכבה האנרגטיים של שלד התא להדגיש תגובות כגון היפוקסיה. לפיכך, יצירת גידולים משקפים את הפעולות הקולקטיביות של סטיות גנטיות מרובות על פני ספקטרום של תהליכים ביולוגיים. מאמצים האחרונים אינטגרטיבית הגנומי מחקר, כוללים רצף הגנום כולו, רצף exome, רצף ממוקד, רצף עמוק ומחקרי עמותת הגנום, זיהו מספר גדל והולך של שינויים גנטיים רומן במהותו את כל סוגי הגידולים 1-4. במקרים רבים, הנגעים הגנטיים מתרחשים ביחד באופן לא-אקראי 5-8, המצביעים על שיתוף הפעולה שלהם בפתוגנזה של מחלה. לנתח את התפקידים שבעור של המגוון הרחב של גנים הביעו aberrantly כתוצאה fROM נגעים הגנומי אלה יש צורך לתכנן אסטרטגיות טיפוליות חדשות ולהבין את התגובות של תאים סרטניים לסוכנים אלה, אבל זה הוכיח את עצמו להיות משימה מרתיעה, הדורש מערכות מודל חיה מאוד חזקות להתנהלות של אנליזה גנומית פונקציונלית תפוקה גבוהה ב vivo.

למרות יונקים, במיוחד מכרסמים, דגמים מועדפים בביולוגיה של סרטן, דג הזברה החלה למשוך תשומת לב רבה. דג הזברה החוליות (דריו rerio) נעשה שימוש כאורגניזם מודל למחקר פיתוח מאז 1960 ויושמה לראשונה לחקר פתוגנזה גידול בשינה 1982 9-11. קלות תחזוקה, גודל גוף קטן, ופוריות גבוהה להפוך את דג הזברה מודל חזק למסכים גנטיים קדימה בקנה מידה גדולה כדי לזהות מוטציות המעניקות פנוטיפים חריגים ופתולוגיים 10. השקיפות האופטית של עוברי דג הזברה היא תכונת מפתח נוספת התומכות בשימוש רחב יותר של מודל סרטן זה, כהיא מאפשרת בתחום ההדמיה vivo להתנהל כדי לאתר התפתחות גידולים בזמן אמת 9, יישום שהוא קשה יחסית במכרסמים 12. ניתוח גנומיקה השוואתית האחרון של הגנום התייחסות דג הזברה (Zv9) חשף 26206 גני המקודדים חלבונים, עם 71% שיש orthologues אדם, מתוכם 82% מתואמים עם גנים הקשורים למחלות בירושת מנדל באינטרנט בMan (OMIM) מסד הנתונים 13, 14. לוקמיה T-cell החריף לימפובלסטית (T-ALL) 15,16, מלנומה 17,18,, קרצינומה של לבלב כתוצאה מכך, דג הזברה כבר משמשת מודל סוגים שונים של סרטן, כגון: נוירובלסטומה 8, סרקומה ע"ש יואינג 19, 20,21 ראדומיוסרקומה 22, קרצינומה hepatocellular 23 ומיאלואידית ממאירות 24,25, ונבחרו כמודל לסרטן השתלה שלא מבן-מינית חוקר 11,26.

מהונדס יציבגישה בדג הזברה משמשת בדרך כלל כדי לחקור את ההשפעה של רווח של פונקציה של גנים בהתפתחות נורמלית או היווצרות המחלה 27,28. לפתח מודל (איור 1 א) כאמור, אחד מזריק מבנה ה- DNA המכיל את הגן של עניין מונע על ידי אמרגן רקמות ספציפיות לעוברי פרא-סוג אחד תאים. שלושה עד ארבעה חודשים לאחר ההזרקה, כאשר עובר המוזרקים מגיע לבגרות מינית, הם outcrossed עם דגי wild-type למסך לאלה המראים שילוב של DNA לבנות בתאי המין שלהם, שרישיונותיהם כדגי מייסד. גורמים רבים, כגון מספר העותק ואתר אינטגרציה של transgene, משפיעים על ביטוי של transgene בקווים מהונדסים יציבים. לכן, כדי לפתח מודל גידול מהונדס, קווים מהונדסים יציבים מרובים ביתר אונקוגן יחיד צריכים להיות שנוצרו ראשון והוקרנו לקו מבטא את הגן ברמה שעלולה להוביל לגידול אינדוקציה. עם זאת, אם ביטוי יתר של o מועמדncogene הוא רעיל לתאי נבט, קשה ליצור קו מהונדס יציב על ידי ישירות ביתר transgene 29. לפיכך, גישה זו יכולה להיות זמן רב, עם סיכון גבוה לכישלון כדי ליצור מודל סרטן מתאים.

כאן, אנו ממחישים אסטרטגיה חלופית המבוססת על transgenesis החולף הפסיפס (איור 1) המספקת יתרונות ייחודיים על פני transgenesis היציב המסורתי למחקר גנומי פונקציונלי in vivo. בגישה זו, בונה transgene אחד או יותר הם שהוחדרו לתוך השלב אחד התא של עוברים מהונדסים או wild-type. בונה DNA המוזרקת מכילה transgenes אז הם משולבים mosaically ואקראי לדגים המוזרקים העיקריים, וכתוצאה מכך מעורבים גנוטיפים בתוך אוכלוסיות תאים מרובות בדגים בודדים 30. יתר על כן, coinjection של DNA מרובה בונה בעוברי תא אחד מוביל לשיתוף השתלבות באותו התא באתרים אקראיים, המאפשר אחד כדי TRAהספירה התאים עם ביטוי של גנים מושתלים ולחקור את יחסי הגומלין של גנים שונים בהיווצרות מחלה בבעלי החיים הפסיפס 31. כהוכחה לעיקרון, אנחנו זמניים ביטוי יתר ALK מופעל mutationally (F1174L) עם גן כתב mCherry במערכת העצבים הסימפתטית ההיקפית (PSNS) תחת שליטה של hydroxylase בטא דופמין (βh ד) האמרגן בדגי פרא-סוג ודג מהונדס ביתר MYCN. ALK, אשר מקודד טירוזין קינאז קולט, הוא הגן שעבר מוטציה הנפוצות ביותר בנוירובלסטומה בסיכון גבוה 5-7,32,33. ALK (F1174L), כאחד מהמוטציות סומטיות הפעלה התכופות והחזקות ביותר, הוא ייצוג-יתר ב MYCN- מוגבר חולי נוירובלסטומה בסיכון גבוה וsynergizes עם ביטוי יתר MYCN להאיץ יצירת גידולי נוירובלסטומה בשני עכברים הטרנסגניים יציבים ודגמי דג הזברה מהונדסים 8,34,35. על ידי פסיפסביטוי יתר חולף של ALK (F1174L) עם mCherry בדג המהונדס MYCN, אנחנו סכמנו האצת תחילת גידול שנצפתה בדגים מהונדסים יציבים ביתר שני ALK (F1174L) וMYCN, המצביע על כך את אסטרטגית transgenesis פסיפס יכולה לשמש למהירות וביעילות להעריך את התרומה היחסית של אונקוגנים רבים בייזום גידול in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל מחקרי דג הזברה ותחזוקה של בעלי החיים נעשו בקנה אחד עם הפרוטוקול שאושר על-# IACUC Mayo Clinic מכון A41213.

1. בונת DNA לTransgenesis

  1. להגביר אזור אמרגן hydroxylase בטא דופמין 5.2-kb (ד βh) 8 באמצעות שיבוט CH211-270H11 BAC (ממרכז משאבי BACPAC (BPRC)) כתבנית ה- DNA. השתמש מתאים PCR מערכת הגברה PCR ארוכה ומדויקת של תבניות DNA ארוכות ותוכניות מחזור הבאות לPCR: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 10 מחזורים של (94 ° C, 15 שניות, 50 ° C, 30 שניות, 68 ° C, 8 דקות), ואחריו 30 מחזורים של (94 ° C, 15 שניות, 53 ° C, 30 שניות, 68 ° C, 8 דקות), 68 ° C, 4 דקות (פריימר קדימה 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 " ופריימר ההפוכה 5'- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ").
  2. צור ד βh -pDONRP4-P1R CLO הכניסהne 8 באמצעות מערכת שיבוט רקומביננטי מסחרית כגון שער multisite. לערבב 1 μl של מוצר dβh המטוהר PCR (172 ng / μl), μl 1 (150 ng / μl) וקטור תורם pDONRP4-P1R (יחד עם וקטורי שער אחרים הם מתנות נדיבות מד"ר צ'י-סל Chien, Univ. יוטה) , 4 μl של TE חיץ (pH 8.0) עם 2 μl של תערובת אנזים clonase BP, דגירה עבור שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפוך לאחת Shot TOP10 E. המוסמך coli על פי הפרוטוקול של היצרן.
  3. צור ד βh: מהונדס EGFP-MYCN לבנות 8 מערכת שיבוט רקומביננטי באמצעות הוזכרה בשלב 1.2. לערבב 1 μl של כל שיבוט כניסה (150 ng / μl) כולל 5.2-kb אמרגן dβh (מבנה dβh -pDONR P4-P1R), EGFP חסר קודון עצירה (מבנה PME-EGFP), ואדם MYCN cDNA (מתנה נדיבה מד"ר Hogarty בבית החולים לילדים של פנסילבניה, MYCN-pDONRP2R-מבנה P3), μl 1 (150 ng / μl) של וקטור היעד שונה המכיל אתרי I-SCEI הכרה (מתנה נדיבה מד"ר ג Grabher, המכון הטכנולוגי של קרלסרוהה, קרלסרוהה, גרמניה), 4 μl של חיץ TE ( pH 8.0) עם 2 μl של תערובת אנזים LR Clonase, דגירה עבור שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפוך לE. כימי המוסמך ירייה עליונה coli כגון אחת 10 ועיקבו אחרי הפרוטוקול של היצרן.
  4. הפוך mitf: מהונדס mitf לבנות 8 על ידי לעכל את וקטור PNP-mitf עם אנזימי הגבלת NotI וסאלי עבור 2 שעות על RT, ועל ידי subcloning 2.65-kb שוחרר (מתנה נדיבה מד"ר ד Raible, Univ של וושינגטון.) קטע DNA המכיל את אמרגן mitf ורצף הקידוד של גן mitf דג הזברה לאתרי NotI וMluI של וקטור pBluescript שונה המכיל אתרי הכרת I-SCEI איגוף (מתנה נדיבה מד"ר הואי Feng, אוניברסיטת בוסטון), תוך שימוש באנזים T4 DNA על פי הפרוטוקול של היצרן.
    הערה: כדי להגביר את היעילות של יצירת קווי MYCN -expressing יציבים, ד βh: נגזרים צלחת בונה DNA mitf הם coinjected לעוברי צדף שלב אחד תא הצדף מייעד סוג של דגים מוטנטים החסרים עצבית: EGFP-MYCN וmitf. melanophore במהלך פיתוח 36. כך, את המראה של תאי הפיגמנט בעוברים המוזרקים מציע שילוב של mitf: DNA mitf בונה לגנום. הוכח כי שתיים או שלושה מבני DNA coinjected ניתן cointegrated לתוך הגנום הדגים 31. לפיכך, פיגמנטציה נגרמת על ידי ביטוי mitf יכולה לשמש כסמן לאינטגרציה של dβh: transgene EGFP-MYCN ולזיהוי קל יותר של קו מהונדס יציב MYCN.
  5. מערבבים את βh ד: EGFP-MYCN וmitf: DNA mitfמבנים ביחס 3: 1 בנפח כולל של תגובת 15 μl עם 1 μl של אנזים I-SCEI ו0.75 μl של חיץ. ודא שהסכום הכולל של ה- DNA בתגובה אינו עולה על 750 ng.
  6. לבצע את עיכול I-SCEI ב RT במשך 4 שעות או O / N. ביום השני, I-SceI- מתעכל DNAs מוכן לmicroinjection או ניתן לאחסן ב -20 ° C להזרקה בעתיד. אחסן את אנזים I-SCEI ב -80 מעלות צלזיוס aliquots הקטן כדי לשמור על יעילות אנזימה.
  7. Subclone ALKF1174L האנושי וגן ALK wild-type מוקטור PCDNA3 (מתנה נדיבה מד"ר ג'ורג 'בדנו-פרבר מכון הסרטן) 7 לאתרי EcoRI וNotI של וקטור pENTRY1A (מתנה נדיבה מד"ר ג Grabher, המכון הטכנולוגי של קרלסרוהה, קרלסרוהה, גרמניה) באמצעות האנזים DNA T4 על פי הפרוטוקול של היצרן.
  8. צור βh ד: ALKF1174L </ Em> או dβh: מבנים מהונדסים ALKWT באמצעות מערכת רקומביננטי כאמור בפרוטוקול 1.2. בקצרה, לשלב שלושה שיבוטים כניסה, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (או ALKWT -pENTRY1A) וp3E-פולה, לתוך וקטור היעד שונה המכיל אתרי הכרה I-SCEI (מתנה נדיבה מד"ר ג Grabher, קרלסרוהה מכון טכנולוגי, קרלסרוהה, גרמניה), באמצעות LR Clonase אנזים Mix, על פי הפרוטוקול של היצרן.
  9. מערבבים את ד βh: ALKF1174L (או dβh: ALKWT) וdβh: mCherry הבונה DNA ביחס 3: 1 וlinearize עם אנזים I-SCEI כמתואר בפרוטוקול 1.5-1.6.

2. Microinjection

  1. השתמש micropipettes זכוכית עם 1.0 מ"מ קוטר לכל הזריקות 37. לשבור את הקצה של micropipettes הזכוכית עם סכין גילוח לפני ההזרקה. לכייל על ידי להזריק נפח ההזרקהing H 2 O לטיפה של שמן מינרלים. מדוד את הקוטר של טיפות וכתוצאה מכך ולהתאים את microinjector (לחץ או משך דופק לחץ) כדי להבטיח שאת עוצמת הזריקה היא פחות מ -10% מכלל נפח התא של עוברי תא בשלב אחד.
  2. להוסיף 0.5 μl נוסף של אנזים I-SCEI הטרי (5 יחידה / μl) ב 5 μl של פתרון הזרקה המכיל DNA בונה ממש לפני ההזרקה כדי להגביר את היעילות של transgenesis 38. הזרק 50-80 pg של מבני ה- DNA לינארית לתוך הציטופלסמה של עוברי שלב אחד תא. על מנת להבטיח את ההצלחה של הזרקה, לערבב את המדגם עם 0.25% פנול אדומים לשם ויזואליזציה. אם תאים הופכים לאדומים לאחר הזרקה, זה מצביע על microinjection הוא מוצלח. כדי להבטיח את שיעור הצלחה גבוה ליצירת דג מהונדס, אנחנו בדרך כלל להזריק רבים כמו 500 עוברים.
  3. כדי ליצור דג מהונדס ביציבות להביע MYCN, coinject βh ד ינארית: EGFP-MYCN וmitf: בונה DNA mitf (ביחס 3: 1) לעוברי של דג הזברה צדף המוטציה פיגמנטציה בשלב אחד התא. הביטוי של Mitf משמש ככתב בשילוב של מבנים מהונדסים בגנום הדגים.
  4. לביטוי יתר פסיפס של ALK בwild-type או עובר מהונדס MYCN, שיתוף להזריק βh ד ינארית: ALK F1174L (או dβh: ALKWT) עם dβh: mCherry בונה DNA (ביחס 3: 1) לאחד התאים עוברים כתוצאה מגידול של F1 הטרוזיגוטיים Tg (dβh: EGFP-MYCN) דג מהונדס עם דגי AB wild-type. כך, מחצית מצאצאים הן מהונדסים לMCYN וחצי הם wild-type.

3. מסך לדגים יציבים או פסיפס מהונדס

  1. כדי להגביר את היעילות של זיהוי קווי MYCN -expressing יציבים, להרדים עוברי צדף הזריקו בעיקר עם tricaine (0.02%)ימי t 3-5 של postfertilization ומסך לפיגמנטציה. העבר את העוברים עם פיגמנטציה לצלחת פטרי חדשה עם מים ביצה טריים ולהעלות אותם לבגרות מינית להקרנה נוספת לדגי המייסד, אשר נושאים את ד βh: transgene EGFP-MYCN בתאי הנבט.
  2. כדי לזהות את המייסד עם שידור בתאי מין של EGFP-MYCN, דגים בוגרים F0 פיגמנט outcross עם wild-type דגי AB ומסך לעוברי EGFP חיובי ב1-2 ימים לאחר הפריה לgenotyping נוסף. הנח עובר F1 EGFP החיובי יחיד לתוך צינור PCR ולהסיר את כל הנוזלים. הוסף 50 μl של חיץ חילוץ gDNA המכיל 12.5 μl של חיץ תמוגה 4x, 35 H 2 O וμl 2.5 μl proteinase K (10 מ"ג / מיליליטר) לעובר יחיד. דגירה התגובה במשך 2-3 שעות על 55 מעלות צלזיוס, ואחריו 10 דקות של דגירה על 98ºC כדי להשבית proteinase K. כדי להפוך 50 מיליליטר של חיץ תמוגה 4x, להוסיף 500 μl של 1M טריס (pH 8.4), 2.5 מיליליטר של 1M t KClo 47 מיליליטר של H 2 O. הערה: לאחר דג מהונדס יציב F0 MYCN הם התרבו עם דגי AB wild-type, כל הצאצאים הם פיגמנט. לפיכך, פיגמנטציה אינה יכולה לשמש כסמן לזיהוי הדגים החיוביים MYCN-. בעוד שבדג המהונדס MYCN, חלבון היתוך EGFP-MYCN בא לידי ביטוי בPSNS, כולל נוירונים האוהד של גרעיני צוואר רחם מעולים וגנגליון המגזרי רציף של השרשרת הסימפתטית ואינו PSNS נוירונים דופאמין, כגון הלשד המוארך ו גרעיני גולגולת 8. לפיכך, הביטוי של EGFP יכול לשמש כסמן לזיהוי עובר המהונדס היציב MYCN.
  3. השתמש 2 μl של gDNA חולץ מן עובר F1 פיגמנט כתבנית, פריימרים MYCN -test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 , ושנינות התכנית הבאות "h GC-RICH מערכת PCR: מחזור 1 של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. אנחנו בדרך כלל גנוטיפ 14-16 עוברים פיגמנט מהזדווגות אחת כדי לאשר את קיומו של transgene MYCN המשולב בעוברי פיגמנט, יותר מ -6 דגי מייסד ביתר MYCN mitf וזוהו על ידי שיטה זו.
  4. לגייס את שארית עוברי F1 EGFP החיובי. קליפ הסנפיר וגנוטיפ בחודש 2-3 של גיל באמצעות הפרוטוקול לעיל כדי לאשר את האינטגרציה של transgene MYCN לדגים נוספים. גזע F1 MYCN דג מהונדס יציב עם דגי AB wild-type. Co-להזריק βh לינארית ד: ALK F1174L (או dβh: ALKWT) עם dβh: mCherry הבונה DNA לעוברים אחד התאים כמתואר בפרוטוקול 2.4.
  5. מיין MYCN -expressing עוברים בניסוי מתואר בפרוטוקול 2.4 באמצעות פלואוריד סטריאוסקופיתמיקרוסקופ escence ולהקרין את העוברים מוזרקים בעיקר בימים 1-3 בpostfertilization לביטוי EGFP-MYCN בPSNS. ואז, בימים 2-5 בpostfertilization, להרדים את העוברים עם tricaine (0.02%) ולמיין את העוברים חיוביים או שליליים MYCN- אלה שוב מבוססים על הביטוי של mCherry בPSNS באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופית. הביטוי של mCherry משמש כסמן לCoexpression של ALK ברקמות של בעלי החיים עיקרי פסיפס המוזרק.
    הערה: ~ 600 צאצאים כתוצאה מהרבייה של דגים מהונדסים יציבים MYCN עם דגי wild-type הוזרקו לכל קבוצה עם בונה DNA לינארית, כולל βh ד: ALK F1174L וdβh: mCherry, dβh: ALKWT וdβh: mCherry, או dβh : MCherry לבד, בהתאמה. ביטוי פסיפס של mCherry ניתן לצפות ב70-90% מהדגים שהוחדרו בעיקר. מחצית לחדשלישי של הדגים המוזרקים שרד דרך שלב הזחלים לשעון גידול.
  6. להעלות את כל mCherry + MYCN + וmCherry + MYCN - עוברים על פי הפרוטוקולים סטנדרטיים מהספר דג הזברה 39 ולפקח על תחילת גידול מתחיל בpostfertilization 5 שבועות.

4. גידול צפה בפסיפס מהונדס דגים

  1. צג דגים מוזרקים בעיקר חיוביים mCherry- כל 2 שבועות החל משעת postfertilization 5 שבועות לראיות של הופעת גידול.
  2. הרדימי דגים עם tricaine (0.02%) ומסך לנוכחות של mCherry - וEGFP -expressing גידולים בPSNS תחת SMZ-1500 מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופית Nikon מצויד במראה מצלמה דיגיטלי DS-U1.
  3. כדי לאשר את הגידולים מביעים את גן ALK, לבודד את mCherry- והמוני EGFP החיובי עבור genotyping ALK PCR.
  4. באמצעות PCR, להגביר הדנ"א הגנומימופק מגידולים שפותחו עם פריימרים הבאים: ALK P7: 5'-AGG-3 GC 'וALK P18: GC-3 CTT CAG GCT GAT GTT 5'-TGT' המרכז לאמנות עכשווית GGT GTC CGG AAT: מחזור 1 ותגובת PCR הבאה של 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורים של (94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות). לאחר מכן, רצף מוצר PCR עם פריימר P7 ALK כדי לאשר נוסף לקיומה של מוטציה או ALK wild-type בגידולי mCherry-החיוביים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לבדוק האם ביטוי יתר של F1174L ALK מופעל mutationally או ALK wild-type יכול לשתף פעולה עם MYCN באינדוקצית נוירובלסטומה, אנו ביטוי יתר או ALK אדם מופעל או ALK אדם wild-type תחת שליטה של אמרגן βh ד בPSNS של דג מהונדס ביתר MYCN. אחד מהמבנים הבאים, dβh - ALKF1174L או dβh - ALKWT, היו coinjected עם dβh - mCherry לתוך אחד התאים wild-type או עוברי MYCN מהונדסים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר נציג זה, השתמשנו coinjection וCoexpression של ALK מופעל חולפים עם גן כתב mCherry בMYCN -expressing דג מהונדס כדי להראות שהגנים הללו ישתפו פעולה על מנת להאיץ את תחילתה של נוירובלסטומה, עולה בקנה אחד עם הממצא הקודם שלנו בcoexpressing דגי התרכובת יציב מהונדס במידה ניכרת שני הופעל ALK וMYCN 8. גישה מהונדס פסיפס זה הוא בעל מספר יתרונות בולטים על פני השיטה הקונבנציונלית. החשוב ביותר, היא מאפשרת בדיקה מהירה של ההשפעות של coexpressing אונקוגנים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מעריכים את ד"ר ג'ונג-סו לי על ששיתף אותנו בדג הטרנסגני Tg(dbh:EGFP-MYCN) במחקר שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענק 1K99CA178189-01 מהמכון הלאומי לסרטן, מלגה מקרן פבלוב וחברים לחיים, ופרסי חוקרים צעירים מקרן דוכן הלימונדה של אלכס וקרן ריפוי לסרטן ילדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
הרחב מערכת PCR של תבנית ארוכה רוש מדע יישומי, IN11681834001
וקטור pCR-TOPO Invitrogen, CA451641
T4 DNA ligaseניו אינגלנד Biolabs, MAM0202M
Gateway LR Clonase II אנזים
Mix		Invitrogen, CA11791-100
Gateway® BP Clonase® תערובת אנזימים IIInvitrogen, CA11789-020
מערכת PCR עשירה ב-GC Roche Applied Science, IN12 140 306 001
מגה-נוקלאז SceI ניו אינגלנד ביולאבס, MAR0694S
ניקון SMZ-1500 מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי ניקון, ניו יורק
מצלמת כוונת דיגיטלית של ניקון DS-U1 ניקון, ניו יורק

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
  2. Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).
  3. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  4. Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).
  5. Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).
  6. Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).
  7. George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).
  8. Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  9. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  10. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  11. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  12. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  13. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  14. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  15. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  16. Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).
  17. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).
  18. Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).
  19. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).
  20. Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
  21. Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21 (11), 1382-1395 (2007).
  22. Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
  23. Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9 (3), e91179(2014).
  24. Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).
  25. Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).
  26. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).
  27. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).
  28. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  29. Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).
  30. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  31. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  32. Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).
  33. Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. , (2013).
  34. Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).
  35. Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191(2012).
  36. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
  37. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  38. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  39. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  40. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  41. Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6 (5), e20230(2011).
  42. Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1 (1), 25(2010).
  43. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  44. Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).
  45. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  46. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vivo

מאמרים קשורים