ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Manoj Kulkarni; Timm Schubert; Tom Baden; Bernd Wissinger; Thomas Euler; Francois Paquet-Durand

doi:10.3791/52588

מאמר שיטה

ההדמיה Ca

12.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52588

⸱

6 במאי 2015

Manoj Kulkarni¹^,² , Timm Schubert¹^,³ , Tom Baden¹^,²^,³ , Bernd Wissinger⁴^,⁵ , Thomas Euler¹^,²^,³ , Francois Paquet-Durand¹

¹Institute for Ophthalmic Research, University of Tübingen, ²Graduate School of Cellular & Molecular Neuroscience, University of Tübingen, ³Bernstein Centre for Computational Neuroscience, University of Tübingen, ⁴Molecular Genetics Laboratory, University of Tübingen, ⁵Centre for Ophthalmology, University of Tübingen

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת ^{2 +} Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca ^{2 +} במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

תקציר

קולטני אור ברשתית קונוס (קונוסים) משרת חזון אור יום והם הבסיס של אפליית צבע. הם כפופים לניוון, לעתים קרובות מובילים לעיוורון בהרבה מחלות רשתית. סידן (Ca ^{2 +),} שליח שני מפתח באיתות קולטי האור וחילוף חומרים, הוצע להיות מקושר באופן עקיף עם ניוון קולטי האור במודלים של בעלי חיים שונים. באופן שיטתי לומד היבטים של הפיסיולוגיה קונוס אלה והפתופיזיולוגיה כבר הקשתה על ידי הקשיים של חשמל הקלטה מהתאים הקטנים אלה, בפרט בעכבר שבו הרשתית הוא נשלט על ידי קולטני אור מוט. כדי לעקוף בעיה זו, הקמנו Ca ^{2 +} פרוטוקול הדמיה שני פוטונים באמצעות קו עכבר מהונדס המבטא את Ca ^{2 +} biosensor TN-XL מקודדים גנטי באופן בלעדי בקונוסים וניתן כלאים עם מודלים עכבר לניוון קולטי האור. הפרוטוקול המתואר כאן כרוך בהכנת חלקים אנכיים (R20; פרוסות ") של רשתית מעכברים והדמיה אופטית של שינויים עוררי גירוי אור ברמת ^{2 +} Ca קונוס. הפרוטוקול מאפשר גם "מדידה ב- פרוסה" של Ca ^{2 +} ריכוזים מוחלטים; כפי שניתן אחרי ההקלטות של כיול. פרוטוקול זה מאפשר לימודים למאפייני קונוס פונקציונליים וצפוי לתרום להבנה של חרוט Ca ^{2 +} איתות כמו גם המעורבות האפשרית של Ca ^{2 +} במוות קולטי האור וניוון רשתית.

מבוא

חזון מתחיל בהפעלה מושרה האור של מפל phototransduction בקולטני אור ברשתית. קולטני אור רוד מאפשר ראייה ברמות אור נמוכות, ואילו קולטני אור קונוס לתווך חזון אור צבע ורזולוציה גבוהה. גני קולטי האור ספציפי רבים רגישים למוטציות המובילות לניוון של תאים אלה. מספר הסמנים מולקולריים הקשורים באובדן קולטי האור זוהה ^1, אך עד כה המנגנונים מולקולריים מפורטים ורצף אירועים לא ברורים. הומאוסטזיס שינה Ca ^{2 +} היה העריך להיות הדק של מוות של תאי קולטי האור, השערה נתמכת על ידי עד-הסדרת הפעילות של Ca ^{2 +} פרוטאזות -dependent calpain-הסוג במהלך ^2,3 תהליך הניוון. עם זאת, נכון להיום, השערה זו אינה מגובה במדידות פיסיולוגיות של Ca ^{2 +.} חוסר עקביות במספר מחקרים על ההשפעה של חוסמי הערוץ ^{2 +} Ca מחדשמחלות tinal תיגר נוספת על המעורבות של Ca ^{2 +} בתא המוות ^4-6, קורא לשיטות להעריך ישירות Ca ^{2 +} בקולטני אור קונוס יונקים.

בעבר, רוב ההקלטה החשמלית ובדיקות ההדמיה Ca ^{2 +} בוצעו בדגמים דו-חיים וזוחלים בגלל הגישה קלה יותר לקונוסים ^7-9. עם זאת, פיזיולוגיה קולטי האור יונקים עשויה להיות שונה מזה של הלא-יונקים ¹⁰ ובמיוחד, בהקשר של ניוון רשתית תורשתי אנושי, הבנה טובה יותר של פיזיולוגיה קולטי האור יונקים היא מפתח לפיתוח טיפולים חדשניים. מודלים של עכברים רבים מחקה מחלות רשתית אנושיות זמינים אך מעט מאוד ידוע על ^{2 +} Ca דינמיקה בקונוסים עכבר ^11. טכניקות חשמל אינן מתאימות להקלטות תפוקה גבוהה מאצטרובלים, בפרט לא בעכברים, שבו מוטות (~ 97%) במספרם באופן משמעותי קונוסים (~ 3%) ¹² . יתר על כן, טכניקות אלקטרו רגישות כגון הקלטות תיקון מהדק כל התא להפריע הסביבה תאית ולספק נתונים על Ca ^{2 +} זרמים אבל לא על Ca ^{2 +} ריכוזים תאיים מוחלטים. לפיכך, על אף ההחלטה הזמנית הנמוכה, הדמיה היא שיטת הבחירה כאשר פונים שאלות על קונוס דינמיקת Ca ^{2 +.} הנושא המרכזי בהדמיה הוא איך לתייג באופן סלקטיבי את הקונוסים עם צבע מחוון ניאון Ca ^{2 +.} מידור מתאים וספציפיות תא הוא קשה להשגה על ידי "בתפזורת טעינה" סינטטי Ca ^{2 +} צבעי מחוון לתוך הרקמה. כתוצאה מכך, קונוסים שכותרת, מוטות ^13,14, ותאי גליה מולר לא יכולים להיות מהימן מכובדים. כמו כן, צבעים סינטטיים נוטים לדלוף החוצה של התאים, מונעים הקלטות ממושכות בתנאים עקביים. יתר על כן, טוענים Ca ^{2 +} אינדיקטורים סינטטיים בצורת AM-אסתר הוא בעייתי, כפי שהוא דורש דהtergents (למשל, DMSO), ויוצר פורמלדהיד ^15. לCa ^{2 +} מדידות מוחלטות, מדדי ratiometric הם חובה. עם זאת, מדד ratiometric הסינתטי זמין כרגע הטוב ביותר הפורע-2 דורשים עירור אור בטווח של 700-760 ננומטר (עירור שני פוטונים), אשר, בהתאם לעוצמתה, יכולה בעצמו לעורר את הקונוסים, ובכך לעכב את הלימודים של קונוס Ca ^{2 +} דינמיקה בתנאי תאורה פיסיולוגיות.

בניגוד לצבעים סינטטיים, יכולים לבוא לידי ביטוי Ca ^{2 +} אינדיקטורים גנטי מקודדים באופן סלקטיבי סוג תא. הם לא ידלפו החוצה של תאים, ולכן, אם ההלבנה הוא נמנע, מדידות ratiometric ממושכות ואמינות הן אפשריות. תא סוג סלקטיבי ביטוי של ^{2 +} חיישני Ca, בשילוב עם שני פוטונים במיקרוסקופ, מייצג כלי רב עוצמה כדי להעריך וללמוד subcellular Ca ^{2 +} במידה רבה בתנאים פיסיולוגיים ^13,16,17 . כאן, אנו מתארים פרוטוקול ללמוד חרוט עורר גירוי אור Ca ^{2 +} דינמיקה בקו מהונדס Ca ^{2 +} עכבר biosensor (HR2.1: TN-XL), המבטא את בסיס סריג Ca ^{2 +} biosensor TN-XL ¹⁸ באופן סלקטיבי בקונוסים, תחת HR2.1 אמרגן opsin האדום האנושי ^19. כדי לגשת למסופי קונוס, הכנת פרוסה לשעבר vivo ²⁰ הועסקה. הפרוטוקול כבר בהצלחה בשימוש בשלושה מחקרים על תפקוד חרוט בעכברים בריאים ^10,21,22. יתר על כן, הפרוטוקול מאפשר לימוד Ca קונוס ^{2 +} איתות תנאים גנטיים ספציפיים, למשל, על ידי הכלאת עכברי מודל לניוון רשתית תורשתי עם HR2.1: עכברי TN-XL.

פרוטוקול

נהלי כל החיה בוצעו הקפדה על ההנחיות וחוקים להגנה על בעלי חיים שנקבעו על ידי הממשלה הפדרלית גרמנית ואושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים המוסדית של אוניברסיטת טובינגן.

1. מודלים בבעלי חיים

HR2.1: TN-XL Ca ^{2 +} עכבר biosensor
1. השתמש בHR2.1 המהונדס: קו עכבר TN-XL מבטא את Ca ^{2 +} biosensor TN-XL סלקטיבי בקולטני אור קונוס ^10. השתמש 3 - עכברים משני מינים גדלו עם קצב היום / לילה סטנדרטי 12 שעות 6 שבועות.

2. הרשתית Dissection

פתרון פיסיולוגי
1. הכן טרי 2 ליטר של פתרון תאי, המכיל 125 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl _{2, 3} 1.25 L- גלוטמין 0.5 מ"מ, גלוקוז 20 מ"מ (+) מ"מ לאא ₂ PO _4, 26 מ"מ NaHCO, ו. מערבבים עד שכל המרכיבים לפזר.
2. פתרון תאי "בועה"עם carboxygen (95% O _2, 5% CO ₂₎ ל5 - 10 דקות. להוסיף CaCl ₂ כדי להגיע לריכוז של 2 מ"מ.
3. לאחר מבעבע הפתרון תאי, למדוד pH שלה. PH צריך להיות 7.4, אחרת סביר להניח כי טעויות נעשו במהלך תקופת ההכנה של הפתרון. שמור טמפרטורה קבועה שיעור ופתרון מבעבע בכל ניסוי כדי להבטיח pH הקבוע.
4. הפרד את המניה ל -2 צלוחיות, אחד לנתיחה רשתית ואחד להגדרת ההקלטה (זלוף).
enucleation העין ובידוד של רשתית (5 - 10 דקות)
1. לשמור על תאורה אדומה עמומה באזור העבודה לenucleation. השתמש נוריות עם אורך גל של 650 ננומטר שיא (או יותר), כדי למנוע הלבנה של קונוסים במהלך נתיחה.
2. כהה להתאים העכבר עבור 2 שעות על ידי לשים הכלוב שלה לתוך קופסא מאווררת היטב, lightproof כדי להבטיח שהקונוסים רגישים באופן מלא בזמן של הקלטות.
3. לטשטש את העכבר תחת laboratoמכסה המנוע ר"י עם isoflurane (5%) באמצעות אידוי ומיכל גז חזק שמחזיק כלוב עכבר סטנדרטי. אחרי עיון את הוראות manufacturer's בעת הטיפול במכשיר האדים. השתמש בכפפות ומסיכת פנים להקטין את החשיפה לאלרגנים.
4. השתמש במיקרוסקופ דו עיני עם 10 - 40X הגדלה לנתיחה.
5. להקריב את העכבר מורדם על ידי עריפת ראש.
6. להתמצאות, לסמן את חלקו העליון של כל עין (= גב) עם עט עמיד למים. עקוב אחר באם באמצעות עין שמאל או ימין.
7. הסר את העין בזהירות באמצעות מספריים מעוגלים על ידי חיתוך עצב הראייה מאחורי גלגל העין. לנתיחה, להעביר את גלגל העין לצלחת פטרי המכילה פתרון תאי טרי carboxygenated. להעברת גלגל העין, החזיק אותו בגדם עצב הראייה.
8. לנקב את העין בכל נקודה לאורך הגבול בין הקרנית ולובן העין (כלומר, בserrata אורה) עם מחט זריקה חדה.
9. החזק את הדואראתם בלובן העין עם זוג מלקחיים ובעדינות להכניס אחד מספריים להב לתוך החור שנעשה בשלב הקודם. לחתוך לאורך serrata אורה להפריד חלק הקדמי של העין (קרנית, עדשה, גוף הזגוגי) מהחלק האחורי (עיינית). חותך את עיינית רדיאלית (לכיוון הדיסק האופטי) במיקום של סימן העט כדי לציין את מיקום הגב על הרשתית.
  הערה: מוכן בדרך זו, יכול להיות כל הזמן בפתרון eyecups carboxygenated כל הזמן לשימוש מאוחר יותר.
10. הפעל עיינית בצלחת פטרי כך שהגב לחתוך מעצמו נקודות. תפוס את לובן העין בצד השמאל וצד ימין של עיינית עם זוג מלקחיים על ידי הוספת כל הטיפים מלקחיים בין רשתית ולובן עין.
11. לנתק את הרשתית בעדינות על ידי היפוך חלק scleral של עיינית. לבסוף, לחתוך את עצב הראייה באמצעות מיקרו לנתח מספריים כדי לשחרר את הרשתית מלובן העין.
  הערה: זה הוא שלב קריטי. למנוע נזק לרשתית (למשל, על ידינוגע ללב ולוחץ אותה עם מלקחיים).
12. החזק אחד הקצוות של הרשתית עם זוג מלקחיים ובעדינות להסיר שאריות וגוף הזגוגי מפני שטח הרשתית באמצעות זוג שני של מלקחיים. כאשר פני השטח הרשתית הוא נקי, להשתמש מיקרו לנתח מספריים כדי לעשות שלושה חתכים נוספים קצרים יותר, רדיאלי (בערך כל 90 מעלות). קיצוצים אלה מאפשרים אחד כדי לשטח בזהירות את הרשתית עם צד קולטי האור פונה כלפי מטה בצלחת פטרי (איור 1 א).
הכנת פרוסה (10 - 15 דקות)
1. הכן ממברנות סינון nitrocellulose מראש לכיסוי תלושי חיתוך וזכוכית רשתית להרכבת פרוסות ומעבירים אותם לתא ההקלטה. חותך קרום מסנן nitrocellulose לחתיכות מלבניות בגודל כ 10 x 5 מ"מ באמצעות מספריים. חותך לחתיכות מלבניות coverslips כ 10 x 5 מ"מ בגודל באמצעות לוטש זכוכית.
2. לאט לטבול שקופיות זכוכית לתוך הפתרון תאי קרוב לרקמה. בעדינות, למשוך את הרשתית לשקופית הזכוכית עם הצד עד תא גנגליון על ידי גרירתו בקצה מאוד בעזרת זוג המלקחיים. תהליך זה מפחית את הנזק וקיפול של רקמה מכאני.
3. בחר את האזור של הרשתית הקשור לשאלת מחקר בהתאמה (ראה גם דיון). זכור, החתך הארוך שנעשה בשלב 2.2.9 מסמן את מחצית גב הרשתית (איור 1 א). לחתוך חתיכה בגודל מלבנית, כ 1 x 2 מ"מ מהאזור ברשתית שנבחר באמצעות סכין אזמל מעוקל. נגב את הפתרון עודף סביב הרקמה.
4. מניחים את קרום המסנן על גבי פיסת הרשתית כגון שצד תא גנגליון שומר על הקרום. מייד, להוסיף טיפה של מדיום תאי על הממברנה לצרף תוקף רקמת הקרום.
5. העבר את רקמת רשתית רכוב קרום לתא החיתוך המכיל פתרון תאי טרי.
6. חותך לפרוסות רשתית אנכיות של 200 מיקרומטרעובי (איור 1) באמצעות סכין גילוח טרי מצורף מסוק רקמה ^23. להב לשנות לכל פיסת רשתית.
  הערה: סכין הגילוח צריך להיות מיושר בצורה מושלמת עם פני השטח של התא תחתון חיתוך כך שכל הקרום מתפצל בו-זמנית, כפי שצוין על ידי "לחיצה על" נשמע בעת חיתוך - אחר הלהב עשוי לכופף ולגרום נזק לפרוסה.
7. דבק פרוסה רכוב קרום יחיד לכיסוי להחליק זכוכית על ידי יישום גריז ואקום גבוה הקרום מסתיים בלבד (איור 1 ג '). שמור את משטח הזכוכית מתחת לרשתית ללא שומן.
8. שמור פרוסות רכוב coverslip מכוסות על ידי ירידה של פתרון תאי בתא האחזקה - מיכל סגור וlightproof, למשל, צלחת פטרי עם המכסה מכוסה בנייר אלומיניום - תחת אווירת carboxygen ב RT. להציג carboxygen ידי מבעבע מאגר מים קטן כדי לשמור על האווירה בהחזקהתא humidified; זה מונע את הפרוסות מהתייבשות.
9. לאפשר פרוסות לנוח בתא האחזקה למשך 10 - 15 דקות לפני שעברה אותם (אחד אחד) לתא ההקלטה. יכולות להישמר פרוסות עד 4-5 שעות במחזיקות קאמרי ב RT (~ 21 מעלות צלזיוס).

3. ההדמיה Ca ^{2 +} שני פוטונים

שני הפוטונים במיקרוסקופ
1. שימוש במיקרוסקופ Movable מטרה (MOM) -type מיקרוסקופ שני פוטונים. שני הליכי תכנון וההדמיה MOM תוארו קודם לכן ^24, לפרטים ראו גם ^10,21,25 (למקורות וחברות, ראה טבלה ^1).
  הערה: כל מיקרוסקופ שני פוטונים זקופים המקיים את הדרישות מינימליות הבאות יכול לשמש: זה חייב להיות מצויד ב( א) לייזר פעם tuneable ל~ 860 ננומטר, (ב) מינימום של שני ערוצים בו זמנית הקרינה נרכשו, (ג ) מסנני ECFP וקרינת סיטרין, (ד)ממריץ אור (לעיצובים אפשריים, לראות ^24,26), ותוכנה (ה) שמאפשר הקלטת רצפי דימוי פקע זמן במסגרת שיעור מספיק כדי לפתור את Ca ^{2 +} אותות של עניין.
2. להפעיל את מערכת ההדמיה שני פוטונים כפי שצוין על ידי היצרן. להקפיד לעקוב אחר הנחיות בטיחות לייזר של המתקן. התחל הלייזר ולכוון אותו ל~ 860 ננומטר.
3. העבר את הפרוסה מהתא מחזיק לתא ההקלטה ומייד להתחיל מרוסס עם פתרון תאי carboxygenated. לשמור על קצב זרימת זלוף של 2 מיליליטר / דקה וטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא ההקלטה.
4. השתמש מטרת טבילה במי 20X NA 0.95. אם זמין, להשתמש במצלמת CCD בשילוב עם אינפרא אדום LED מתחת תא הקלטה לאתר את פרוסת הרשתית (איור 2). אחרת לאתר פרוסה באמצעות הדמיה שני פוטונים (ראה 3.1.5).
5. לעבור להדמית שני פוטונים כדי להציג ביטוי biosensor. להדליקערוצי גילוי שני הדמיה הקרינה של ECFP וסיטרין.
6. השתמש בתוכנת רכישת תמונה ששולטת במיקרוסקופ שני הפוטונים כדי לסרוק ובחר שורה של מסופי קונוס להקלטה (איור 3 א). רכישת תמונת סט 128 x 16 תמונות פיקסל (31.25 הרץ) או תצורה דומה. להגביל אזור סרוק למסופים חרוט, כדי למנוע הלבנה של photopigments במגזרים חיצוניים.
  הערה: TN-XL חיישן סידן (τ = ~ 0.6 שניות לCa ^{2 +} מחייב, τ = ~ 0.2 שניות לCa ^{2 +} לא מחייבים, ראו ¹⁶⁾ במסגרת שיעור מינימאלית של ~ הרץ 8 מומלץ.
גירוי והקלטת אור
1. השתמש ממריץ אור שדה מלא תת-שלבים, כמתואר במקום אחר ^10,21,26 לבצע את השלבים הבאים.
  הערה: פתרון פשוט לממריץ שדה מלא אור הוא להשתמש בשתי נוריות-מסוננים לעבור להקה (למשל, "כחול": 360 BP 12, "ירוק": 578 BP 10)התואמים את רגישויות אורך הגל של קונוסים עכבר, אבל באותו הזמן אינו חופף עם המסננים המשמשים לגילוי הקרינה (CF. 3.2.4). האור מהנוריות מתמקד בקבל דרך החלק התחתון של תא ההקלטה (איור 2). לפרטים על עיצוב ממריץ זה, הכיול שלה, עוצמות האור משמשות ושיעורי צילום isomerisation קונוס התעוררו, לראות ^10,21,26.
2. הפעל את הלייזר ולאפשר קונוסים להסתגל לסריקת הלייזר ואור רקע גירוי (20 - 30 שניות, ראה גם החסרונות פוטנציאליים) לפני הצגת גירויי אור (ראה 3.2.3) או החלת סוכנים תרופתיים.
3. התחל מצגת של גירויים שרירותיים (למשל, הבזקי האור, כפי שמוצגים באיור 3, C). במקרה של הגירוי המתואר בשלב 3.2.1, ליצור גירויים על ידי ויסות עוצמת שתי הנוריות לאורך זמן באמצעות לוח המיקרו נשלט על ידי תוכנה מותאמת אישית (לפרטים, לראות ^10,21,26).
4. להתחיל להקליט שני ערוצי הקרינה (למשל, ב483 ננומטר לסריג-תורם "הכחול" ECFP וב535 ננומטר לסריג-acceptor "הצהוב";. למפרט ראה טבלה 1) בו זמנית באמצעות תוכנת רכישת תמונה המתאימה (ראה גם 3.1 .6). לדוגמא, במקרה של הבזקי אור (איור 3, C), שיא לפחות 8 - מצגות גירוי 10 (ניסויים).
כיול Ca ^{2 +} "ב- פרוסה"
1. השיא Ca ^{2 +} אותות במסופי קונוס (כמתואר בסעיף 3.1.6 ו3.2.4) ולחלץ את בסיס Ca ^{2 +} הרמה בקבוצה של קונוסים (כפי שמתואר ב3.4).
2. לעבור ל" Ca ^{2 +} חינם "בינוני תאיים עם 5 ionomycin מיקרומטר (מומס DMSO) ו -10 מ"מ EGTA (או, לחלופין, BAPTA) הוסיף. מסופי השיא קונוס שוב כל 5 דקות כדי לקבוע את היחס המינימלי הקרינה _(דקות R), כלומר, היחס בהעדר (ליד) של Ca ^{2 +} תאיים. פעולה זו עשויה להימשך בכל מקום בין 15 - 30 דקות.
  הערה: מערכת זלוף נדרש המאפשרת מעבר בין מאגרים שונים.
3. לעבור למדיום תאי עם 5 ionomycin מיקרומטר (מומס DMSO) ו -2.5 מ"מ Ca ^{2 +.} לאחר זמן דגירה של 5 דקות, קונוסים שיא שוב כל 5 דקות כדי למדוד את היחס המקסימאלי הקרינה _{(מקסימום} R), כלומר, היחס בנוכחות להרוות ריכוזים של Ca ^{2 +} תאיים. בעקבות יישום ionomycin, זה עלול לקחת בין 3-15 דקות ליחס Ca ^{2 +} להפוך יציב.
  הערה: חשיפה לפרוסות גבוהה Ca ^{2 +} וionomycin לתקופה ארוכה יותר סופו של דבר לגרום נזק לתאים. כוללים תאים רק בניתוח ששומר על המורפולוגיה הנורמלית שלהם. ריכוזים (כלומר, EGTA, ionomycin) ייתכן שיהיו הצורך להתאים. לפרטים נוספים על כיול Ca ^{2 +}פרוטוקול, לראות ^13,17.
ניתוח נתונים
הערה: השתמש בעיבוד תמונה וניתוח נתונים חבילת תוכנה תואמת עם תוכנת מיקרוסקופ המתאימה ומסוגלת להריץ תסריטי ניתוח מותאמים אישית.
לטעון קובץ נתוני הדמיה ולצייר אזורים של עניין (ROIs) מסביב לכל מסוף קונוס (איור 3 א). לכל מסגרת, עוצמת הקרינה ממוצעת בהחזר על ההשקעה ולהפחית הקרינה רקע, לפני חישוב היחס (R) בין סריג-acceptor (סיטרין) ותורם הקרינה (ECFP) (R = F / F _D; איור 3, C). יחס זה משמש בדרך כלל כמדד לריכוז Ca ^{2 +} תאיים יחסי, אבל אחרי הכיול (ראה 3.3), גם ניתן להעריך ריכוזים מוחלטים (ראה 3.4.3).
הערה: ניתן להכיר pedicles לפי מיקומם בשכבה החיצונית plexiform והמורפולוגיה שלהם (בברוטליות "כתמים" קטן יותר מהחרוט במקצתsomata, הממוקם בקצה של האקסון קונוס).
ניסויים ממוצע גירוי (איור 4 א). לחלץ פרמטרים תגובה מעקבות בממוצע (איור 4), כגון רמה בסיסית ^{2 +} _(בסיס R) Ca לפני גירוי אור, משרעת שיא _(מגבר R), ושטח מתחת לעקומה (R) כאמצעי לגודל תגובה. כמו כן, לחלץ קינטיקה תגובה מעקבות בממוצע, כגון עליית תגובה _(עליית t) וזמן דעיכה _{(ריקבון} t) (= מרווחי זמן המתאימים בין 20% ו -80% _ממגבר R; ראה איור באיור 4). לפרטים נוספים על כיצד לקבוע פרמטרים אלה, ראו ^10.
חישוב אומדן קונוס המוחלט ריכוז Ca ^{2 +} מבוסס על המדידות מצעדים 3.3.1-3.3.3. השתמש ביחסים לריכוז מינימאלי ומקסימאלי Ca ^{2 +,} _דקות R ו- R _{מקסימום,} בהתאמה, הקרינה התורם בCa ^{2 +} -bound (F _{D, מחויב-CA)} ו-unbound (F _{D, Ca-חינם)} מדינה, כמו גם vivo ב- הקבוע דיסוציאציה _(ד K = 0.77, ראה ¹⁶⁾ לTN-XL עם הבא משוואה (אנלוגי עד ^27):

תוצאות

על ידי שילוב של פרוסות אנכיות (איור 1) שהוכן מHR2.1: רשתית עכבר TN-XL עם הדמיה שני פוטונים (איור 2), שהיינו מסוגל לבצע מדידות ratiometric של ^{2 +} אותות Ca-עורר גירוי אור בסופי האקסון קולטי האור קונוס . גישה זו מהווה שיפור משמעותי בגישה חזותי קונוסים עכבר מעל שיטות הדמיה אופטיות קיימות מראש עם Ca ^{2 +} אינדיקטורים סינטטיים. לדוגמא, ביטוי קונוס הספציפי של Ca ratiometric גנטית המקודד ^{2 +} biosensor TN-XL הקל באופן משמעותי את זיהוי של מסופי האקסון קונוס (ראה ROIs באיור 3 א). לכן, הפרוטוקול שלנו מבטל את הסיכון של אותות הקלטה ממקור לא ברור, כלאותות דוגמא "מעורבים" עם תרומות משני מסופי חרוט והאקסון המוט.

הגישה שלנו מאפשרת פתרון תגובות חד-משפט ברמה של indiviמסוף האקסון חרוט כפול. חול אור עורר של Ca ^{2 +} ממסוף חרוט מסומן על ידי עלייה וירידה בתורם acceptor הקרינה, בהתאמה (איור 3). ירידה בשיעור הקרינה (R) תואמת את החול של Ca ^{2 +} ממסוף קונוס (איור 3 ג), הנגרם על ידי hyperpolarization מושרה האור של קונוס והסגירה הבאה של ערוצי Ca ^{2 +} מתח מגודרת. מאחר שניתן לנטר כמה סופי האקסון חרוט בו-זמנית (איור 3 א), רכישת נתונים היא יעילה מאוד ומאות התגובות ^{2 +} קונוס Ca ניתן לאסוף בניסוי יחיד. על ידי הערכת תגובות אלה כמותית (איור 4), ניתן להשוות קונוס אותות Ca ^{2 +} ומוערך בטווח של תנאים (ראה דיון).

זה הוא לעתים קרובות מספיק כדי להשתמש ביחס בין סריג-acceptor (סיטרין) ו-donor הקרינה (ECFP)(F / F _D; לפרטים, ראה 3.4) כאמצעי יחסי של Ca ^{2 +} הרמה תאית. ובכל זאת, בכל פעם שיש צורך, היחס יכול להיות מכויל כדי להשיג Ca ^{2 +} ריכוזים תאיים מוחלטים ([Ca ^{2 +])} (איור 5). בתאורת רקע שימוש בפרוטוקול זה (לפרטים, ראה ¹⁰ ואיור 3 אגדה), כיול הניב אומדן למוחלט נח בHR2.1 [Ca ^{2 +]} "wild-type": מסופי TN-XL קונוס העכבר של 243 ± 159 ננומטר (ממוצע ± סטיית תקן), שנמצא בטווח שדווח לעכברים בספרות ^11.

figure-results-1
איור 1. הכנת פרוסות רשתית אנכית. () מבודד ושטח רשתית מוכנה לחיתוך. (ב) חתיכה מלבנית של רשתית (יםEE תיבה אדומה ב) רכוב על קרום נייר סינון (אפור כהה) לאחר חיתוך. (ג) צפה לראש של פרוסת רשתית רכוב קרום הקבוע על coverslip זכוכית באמצעות גריז. (ד) ציור סכמטי של חלק מפרוסת רשתית (ראה תיבה אדומה בC). קולטני אור חרוט מצוין בירוק. V הגחון,; D, גב; N, האף; T, זמני; מערכת הפעלה, קטע חיצוני; ONL, שכבה חיצונית גרעינית; OPL, שכבה חיצונית plexiform; INL, שכבת גרעין פנימית; IPL, שכבת plexiform פנימית; GCL, שכבת תא גנגליון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. שני פוטונים הדמיה של פרוסות רשתית: איור של תצורת ההקלטה למעלה:. עדשה אובייקטיבית מים טבילה התמקדות להיותבבוקר של לייזר הסריקה (חץ כלפי מטה אדום) לתוך הרשתית, ואיסוף הקרינה הנפלטת (חיצים כלפי מעלה). העדשה גם אוספת מועברת אור אינפרא אדום מLED תאורה רכוב מתחת למעבה כאשר הדמיה הפרוסה באמצעות מצלמת CCD מרכז:.. פרוסת רשתית רכובה בחדר ההקלטה וperfused עם פתרון תאי תחתונה: עדשת הקבל התמקדות האור מנוריות הגירוי (וLED אינפרא אדום עבור הדמיה מצלמת CCD) באמצעות התחתית השקופה של חדר ההקלטה לתוך רקמת הרשתית. IR LED, אינפרא אדום אור דיודה; CCD, מכשיר תשלום מצמידים; BP, להקה עוברת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3. אור-להעלות זכרונותתגובות ^{2 +} D Ca במסופי האקסון של קולטני האור קונוס העכבר. (א) משמאל: הקלטות התמקדו במסופים הסינפטי (תיבה אדומה) של קולטני האור קונוס (ירוקה) בפרוסות רשתית ימנית:. דוגמא לאזור שהוקלט עם 7 מסופים בודדים. הקרינה נרשמה באמצעות שני ערוצים:. אחד לסיטרין סריג-acceptor (למעלה; 535 BP 50) ואחד לסריג-תורם ECFP (התחתון; 480 BP 32) (ב) שינויי אור עורר בסיטרין (F) וECFP הקרינה (F _D) שנרשמה בהחזר על השקעה בודדת. התגובות (C) Ca ^{2 +} (כיחס F / F _D) של מסוף חרוט לסדרה של הבזקי אור בהירים 1 שניות במרווחים של 5 שניות. החזר על השקעה, אזור של עניין; BP, מסנן להקה עוברת; F, עוצמת הקרינה; au, יחידות שרירותיות; סריג, העברת אנרגיית תהודת פורסטר; ECFP, משופר חלבון פלואורסצנטי ציאן. עוצמת גירוי (כמו pשיעור hoto-isomerization ב 10 ³ · P ^-1 לקונוס) · s:. 13.0 ו -12.8 לM- ו- S-opsins, בהתאמה, והוסיפו על רמת רקע (= נוריות כבויות, סריקת לייזר עירור) של ~ 10 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4. ניתוח כמותי של מופת תגובות Ca ^{2 +} קונוס האור עורר () Ca ^{2 +} תגובות אור עורר (כΔR) ממסוף חרוט יחיד (ניסויים בודדים: עקבות אפורות, n = 16; ממוצע:. עקבות שחורות ) (פרמטרי B) שנקבעו לתגובה הממוצעת Ca ^{2 +:.} מנוחה Ca _(בסיס R רמת ²⁺⁾ המייצג את הבסיס לפני גירוי אור, גודל התגובה כarEA-תחת-עקום (R) ומשרעת שיא _(מגבר R), קינטיקה של תחילת תגובה _(עליית t, מרווח זמן בין 20% ל 80% _ממגבר R) וקיזז _{(ריקבון} לא, מרווח זמן בין 80% 20% _ממגבר R). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
איור 5. הערכת ריכוז Ca ^{2 +} מוחלט. ריכוז ^{2 +} המנוחה Ca ([Ca ^{2 +],} כיחס F / F _D) נרשם במסופי האקסון 8 חרוט בעכבר TN-XL (חוגים, עם ממוצע ± סטיית תקן) לפתרונות שונים תאיים: פעמיים במדיום תאי סטנדרטי (Ctrl 1 ו -2), ולאחר מכן עם מינימאלי ("אפס") [Ca ^{2 +]} (10 מ"מ EGTA)ד עם (מ"מ 2.5) [Ca ^{2 +]} גבוה, שני התנאים האחרונים בנוכחות 5 מיקרומטר ionomycin לאזן Ca התאי ו תאי ^{2 +.} אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

פרוטוקולים קיימים מראש באמצעות הקלטות מתא בודד אלקטרו או Ca ^{2 +} הדמיה עם אינדיקטורים ניאון סינטטיים להיאבק כדי להקליט את ^{2 +} Ca הדינמיקה בקולטני אור קונוס עכבר למספר הסיבות טכניות (ראה מבוא). הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר המדידה של Ca ^{2 +} אותות ואפילו Ca ^{2 +} רמות מוחלטות במסופים בודדים שנוצר על קונוס העכבר בדרך יעילה ופשוטה יחסית.

פרוטוקול זה כבר שימש בהצלחה בשלושה מחקרים העוסקים בהיבטים שונים של תפקוד חרוט ברשתית עכבר בריאה. במחקר הראשון ^10, HR2.1: עכבר TN-XL התאפיין באמצעות אימונוהיסטוכימיה, הקלטות ERG, שני פוטונים הדמיה Ca ^{2 +,} ופרמקולוגיה, מראה כי ביטוי קונוס הספציפי של biosensor Ca ^{2 +} לא להפריע האנטומיה חרוט ותפקוד. במחקר השני ^21, כרומטיתומאפייני תגובה אכרומטית של קונוסים עכבר מופו על פני הרשתית, מדגימים הבדלים בולטים בתפקוד קונוס בין הגב-נשלט opsin "הירוק" והרשתית "הכחולה" הנשלט opsin הגחון העכבר. הבדלים האזוריים אלה בנכסי קונוס תאמו את חלוקת ניגוד ההפרש בסביבה הטבעית (כלומר, שמים לעומת קרקע), המצביעים על כך הסוגים השונים של קונוסים הרפאים עכבר לספק ל( ליד) דגימה אופטימלית של ניגודים אכרומטית ו, ובכך, עשויה להציע יתרון אבולוציוני. במחקר השלישי ²² המשוב ההדדי שסופי האקסון חרוט מקבלים מהתאים אופקיים נחקר. כפי שכל מנגנוני משוב תא אופקי הציעו לפעול במתח מגודרת ^{2 +} ערוצי Ca בסופי האקסון קונוס ^28, מסוף חרוט Ca ^{2 +} יכול לשמש כמדד לאינטראקציות תא אל החרוט אופקיים. המחקר על ידי Kemmler ועמיתים לעבודת ²² תומכיםההשקפה שתאים אופקיים להשתמש במערכת משוב מורכבת הכוללת מספר מנגנונים לשלוט שחרור גלוטמט קולטי האור.

מחקרים אלה ממחישים את הרבגוניות של הפרוטוקול המתואר ולהראות שזה יכול להיות מותאם למגוון רחב של שאלות הנוגעות פונקצית חרוט ומעגלים הסינפטי. בנוסף, הפרוטוקול מאפשר ללמוד Ca ^{2 +} איתות מקומית בתאי קונוס השונים, להבנה טובה יותר של הפיסיולוגיה קונוס. ידע כזה חשוב להבין תהליכי pathophysiological בקונוסים מנוונים, כדי לאפשר סופו של דבר לפיתוח רציונלים של גישות טיפוליות פוטנציאליות, במיוחד למחלות ניווניות המשפיעות על קונוסים.

בHR2.1: קו עכבר TN-XL, biosensor Ca ^{2 +} בא לידי ביטוי בכל חרוט, למעט הקטע החיצוני. זה מספק הזדמנות להערכה ישירה וratiometric של Ca ^{2 +} דינמייםים בתאי קונוס שונים. מאז שינויים בCa ^{2 +} זרמים במגזר החיצוני משתקפים במסופים באמצעות פוטנציאל הממברנה וההפעלה של ערוצי Ca ^{2 +} מתח מגודרת וכתוצאה מכך, תהליכים בקטע החיצוני ניתן להבחין באופן עקיף.

בעיות פוטנציאליות:

הנתיחה של הרשתית היא שלב קריטי: בעכבר, הרשתית נפרדת מעיינית בדרך כלל בין מגזרים חיצוניים קולטי האור ואפיתל הפיגמנט. לכן, המגזרים החיצוניים קולטי האור רגיש לאור של הרשתית המבודדת חשופים ורגישים מאוד לפגיעות מכאניות. יש לנקוט בזהירות רבה שלא לפגוע על ידי נגיעה בצד קולטי האור עם כלים או על ידי הזזת הרקמות הצידה על משטח דבק (למשל, קרום מסנן).

יכולות להיות מוכרות פרוסות רשתית באיכות גבוהה מתחת למיקרוסקופ על ידי משטח החיתוך הנקי שלהם ובשכבת קולטי האור מאורגנת היטב עם מגזרים חיצוניים ברורים. הערכה תפקודית של איכות פרוסה יכולה להיעשות במהירות על ידי מהבהב גירויי אור בהירים וקביעת אחוז קונוסים תגובה (לדוגמא, בשדה ראייה עם 10 - 20 קונוסים). הנה, איכות תגובה צריכה להיות מוערכת על ידי חישוב יחס אות לרעש (S / N) (משרעת של רעש בסיס לפני גירוי האור לעומת משרעת של תגובת האור); S / N של 2 - 3 צריך להיחשב כסף המינימאלי. בדרך כלל, אנחנו זורקים פרוסות עם קונוסים מגיבים פחות מ -50%. פרוס גם עם קונוסים המציגים מוגזמת התנהגות spiking הספונטני (ראה איור 4 ב ¹⁰⁾ אמור להיות מושלכת.

פרוסות בחדר ההקלטה שעומדות בקריטריונים אנטומיים ותפקודיים האמורים להראות תגובות עקביות ל1 - שעה 2 (לפרטים על עקביות תגובה, ראה ^10). בגלל פרוסות לשרוד במשך שעותשלנו בתא מחזיק, ניסוי מוצלח יכול להימשך עד 6 שעות. ראוי לציין כי יש כמה הגבלות ביחס לחקר אינטראקציות מרחבי ארוכים הנעות בין קונוסים ותאים אופקיים, כמו חיתוך בהכרח מנתקת קשרי רוחב ברשתות רשתית. עם זאת, הגדלת העובי של פרוסות רשתית 300 מיקרומטר קילה נושא זה ^22.

השימוש בפרוסות רשתית אנכיות מונעת סריקה של מגזרים חיצוניים קונוס רגיש לאור על ידי לייזר העירור, ולכן, במידה רבה, מונעת הלבנת opsin (לדיון נרחב, לראות ^10,21). עם זאת, Ca ^{2 +} האותות נרשמו תלויים לא רק בגירויי האור, אלא גם לקבל מושפע רכיב תאורת רקע שנוצר על ידי לייזר עירור סריקה. למעשה, תאורת הרקע היעילה בניסויי הדמיה שני פוטונים כזה הוא שילוב של אור הלייזר מפוזר, אור הניאון הנפלט על ידי CE נרשםLLS, וכל רכיב רקע גירוי LED. לכן, יש לאפשר קונוסים להתאים לפחות 20 - 30 של לסריקת לייזר (עם רכיב הרקע של גירוי האור מופעלים) לפני ההקלטה.

יתרונות ויישומים:

בעוד כמה בקשות לקונוס זה Ca ^{2 +} פרוטוקול -imaging תוארו לעיל ^10,21,22, ניתן חזו יישומים אחרים: מחקרים פרמקולוגיים בשילוב עם חרוט הדמיה Ca ^{2 +} עשוי לאמת Ca ^{2 +} מסלולי איתות בקונוסים ויכולים להיות משמש לבדיקת יעילות ועצמה של תרופות המכוונות לשחקנים שונים בCa ^{2 +} -signaling ^10. עם זאת, יישום עשוי להיות מפתח ללמוד מחלות המשפיעות על תפקוד קונוס. מודלים עכבר ניוון רשתית רבים מחקה מחלות אנושיות זמינים. לדוגמא, העכבר (1 cpfl) הפסד קולטי האור חרוט 1 הוא סבל מודל ניוון חרוט עיקריממוטציה Pde6c ^29. לעומת זאת, עכבר ניוון מוט 1 (RD 1) סובל ממוטציה Pde6b. אמנם זה גורם לניוון מוט העיקרי קולטי האור ^30, ברגע שאובדן מוט RD 1 הושלם, ערכות ניוון חרוט המשניות ב ^1. הכלאת החיות האלה עם HR2.1: קו TN-XL יאפשר לימוד והשוואת ^{2 +} Ca דינמיקה בשני הניוון החרוט הראשוני והמשני ועשוי לספק תובנות רבות ערך לתפקיד של Ca ^{2 +} במוות של תאים חרוט. כמו כן, פרמקולוגית מושרה ניוון קונוס - למשל באמצעות מעכבי PDE6 סלקטיבית - יכול לשמש כדי לזהות את המנגנונים במורד הזרם של ^10,29,31 ניוון חרוט.

לסיכום, הפרוטוקול מתואר כאן מאפשר מדידת Ca ^{2 +} בתאי subcellular של קולטני האור קונוס העכבר ומציגה הזדמנויות גדולות לחשוף פיזיולוגיה קונוס תחת מגוון רחבתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש להקרנה של סוכנים תרופתיים שנועדו להפריע ל-signaling קונוס Ca ^{2 +} ובכך לסייע להקמת טיפולים חדשים למחלות קונוס.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (מרכז ורנר רייכארדט למדעי המוח האינטגרטיביים Tübingen, EXC 307 to T.E. ו-T.S.; KFO 134 ל-B.W. ו-F.P.D.), משרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 ל-T.E ו-T.B.), והאיחוד האירופי (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 ל-M.K. ו-F.P.D).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גריז ואקום גבוה	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Cover החלקות	R. Langenbrinck		24 x 60 מ"מ; http://www.langenbrinck.com
זכוכית שקופיות	ר. לנגנברינק		76 x 26 מ"מ; http://www.langenbrinck.com
להבים לקוצץ רקמות	MARTOR KG	ARGENTAX מס' 1044	0.25 מ"מ; http://www.martor.de
קוצץ רקמות	בנייה		מבוסס על עיצוב של F. Werblin²³, מותאם על ידי T. Schubert
קרום מסנן ניטרוצלולוז מרושת	Merck Millipore		AABG01300 סוג מסנן: 0.8 µ m; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CP	CP pharma	AP/DRUGS/220/96	http://www.cp-pharma.de
a>UV/green LED ממריץ שדה מלא מבוסס LED	בנייה		לפרטים, ראה¹⁰
לוח מיקרו-מעבד קוד פתוח	Arduino		http://www.arduino.cc
Imaging תוכנת CfNT	Custom-written		שפותחה על ידי Michael Mü ller, MPI למחקר רפואי, היידלברג, גרמניה
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 מערכת זלוף מוקדי	ALA מכשיר מדעי		עם 100 μ סעפת קצה בקוטר m; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Movable Objective microscope (MOM), עוצב על ידי W. Denk, MPImF, היידלברג, גרמניה	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
[header]
XLUMPlanFL 20X/0.95w objective	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Vaporizer 100 series	Surgivet		http://www.surgivet.com
Ionomycin, מלח סידן	טכנולוגיות חיים	I24222	http://www.lifetechnologies.com
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	https://www.sigmaaldrich.com
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	101191250	http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95	leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/

מותאמת אישית מותאמת אישית

מקורות

Trifunovic, D., et al. Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration. Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).
Paquet-Durand, F., et al. Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse. Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).
Paquet-Durand, F., et al. A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa. Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).
Frasson, M., et al. Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse. Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).
Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).
Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).
Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors. The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).
Choi, S. Y., et al. Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse. Neuron. 48, 555-562 (2005).
Krizaj, D. Calcium stores in vertebrate photoreceptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).
Wei, T., et al. Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).
Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).
Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).
Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).
Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290, 527-528 (1981).
Hendel, T., et al. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).
Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo. Nature Methods. 6, 883-889 (2009).
Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).
Wang, Y., et al. A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes. Neuron. 9, 429-440 (1992).
Connaughton, V. P. Zebrafish retinal slice preparation. Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).
Baden, T., et al. A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution. Neuron. 80, 1206-1217 (2013).
Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).
Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the tiger salamander retina. The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).
Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).
Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina. Current Biology. 23, 48-52 (2013).
Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).
Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
Thoreson, W. B., Mangel, S. C. Lateral interactions in the outer retina. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).
Trifunovic, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).
Sahaboglu, A., et al. Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms. Cell Death & Disease. 4, e488(2013).
Sahaboglu, A., et al. PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function. PloS One. 5, e15495(2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TN XL