ויזואליזציה של Streptococcus pneumoniae בתוך Microlesions הלב וRemodeling לב לאחר

סיכום

Streptococcus pneumoniae יוצר נגעים מיקרוסקופיים נפרדים שאינם מוגלתיים בלב. מתואר הפרוטוקול למודל עכברי של היווצרות מיקרו-נגעים לבביים. ניתנת הדרכה על הדמיית מיקרו-נגעים באמצעות מיקרוסקופיה, הבחנה בין מיקרו-נגעים מוקדמים ומאוחרים, ושיטות לאיתור שיפוץ לב בלבבות של בעלי חיים מחלימים.

תקציר

במהלך בקטרמיה Streptococcus pneumoniae יכול translocate פני האנדותל של כלי הדם לשריר הלב ויוצר פגיעות מלאות חיידקים דיסקרטיים מיקרוסקופיות (microlesions) כי הם ראויים לציון בשל היעדר חדירת תאי מערכת חיסון. בשל שחרורם של מוצרי cardiotoxic, S. pneumoniae בתוך microlesions הם חשבו לתרום לאי ספיקת הלב שלעתים קרובות נצפתה במהלך המחלה דלקת ריאות פולשנית רועמת במבוגרים. מסמך זה בא לידי ביטוי בפרוטוקול לזיהום עכבר ניסיוני שמוביל להיווצרות לשחזור microlesion לב בתוך 30 שעות. הדרכה ניתנת על זיהוי microlesion בhematoxylin & Eosin חלקי לב מוכתמים והבחנות מורפולוגיות בין microlesions המוקדם והמאוחר מודגשים. הדרכה ניתנת על פרוטוקול לאימות של ס ' pneumoniae בתוך microlesions באמצעות נוגדנים נגד פוליסכריד קופסית דלקת ריאות ומיקרוסקופיה immunofluorescent. אחרון, פרוטוקול להתערבות אנטיביוטי שמציל עכברים נגועים ולזיהוי וההערכה של היווצרות צלקת בלבם של עכברי הבראה מסופק. יחד, פרוטוקולים אלה יקלו על החקירה של המנגנונים המולקולריים שבבסיס פלישת דלקת ריאות לב, מות cardiomyocyte, שיפוץ לב כתוצאה מחשיפה לS. pneumoniae, ואת התגובה החיסונית לpneumococci בלב.

מבוא

אשפוז של מבוגרים לנרכשו בקהילת דלקת ריאות (CAP) נושא סיכונים מתועדים לאירועים לבביים שליליים שתורמים לתמותה ^1-4. במחקר שנערך לאחרונה על ידי אל-המדינה קוראלס et. סיבוכים לבביים נמצאו להיות קשורים ו / או אחראי למותם של 27% הקשורים לדלקת ריאות ^3. Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), הגורם השכיח ביותר של CAP ואלח דם ^5, נקשר ישירות עם אירועים לבביים שליליים בכמה ש-19% מהחולים מבוגרים הודה ^6. אירועים לבביים חמורים הקשורים לדלקת ריאות כוללים כישלון חדש או הורע ספיקת לב, הפרעות קצב, ואוטם שריר לב כדי להקטין תדירות של ^6.

במאמר פתוגנים PLoS האחרון על ידי אל בראון ואח., S. pneumoniae נמצא מסוגל טרנסלוקציה דרך האנדותל של כלי דם של הלב, הכניסה לmyocardiuמ ', והיווצרותם של הנגעים דיסקרטיים שאינם מוגלתיים מיקרוסקופיים (microlesions) מלאים בחיידקים בחדרי הלב במהלך מחלה פולשנית דלקת ריאות (IPD) ^7. עדות להיווצרות microlesion לב נצפתה בדגימות לב מפרימטים שאינם בני אדם ואנשים שנכנעו לזיהום דלקת ריאות. כמו כן, עכברים נגועים בניסוי reproducibly פיתחו microlesions לב. בעכברים, גודל microlesion ומספר היה מתואם חיובי עם המשך והחומרה של בקטרמיה, רמות טרופונין הלבבי בסרום, וelectrophysiology לב חריג. טרנסלוקציה חיידקים ללב נמצאה להתרחש דרך אותם המנגנונים אחראים לטרנסלוקציה של pneumococcus פני מחסום דם-המוח וההתפתחות של דלקת קרום מוח דלקת ריאות, כלומר הפלישה, חלבון קושר כולין בתיווך של תאי האנדותל של כלי דם בקולט Laminin וטסיות דם אופן תלוי הקולטן לגורם -activating ^8. Microlesהיווצרות היון נדרשה גם pneumolysin רעלן דלקת ריאות יוצרים הנקבובית שנמצא להרוג cardiomyocytes ^7.

microlesions לב דלקת ריאות נבדלים ממוגלתיות רקמות רכות ומורסות לב שנגרמות על ידי חיידקים גראם-חיובי אחרים, כולל Staphylococcus aureus. אלו מאופיינים במוקדים בודדים של חיידקים מוקפים נויטרופילים ^ו9,10 תצהיר הפיברין. Microlesions שהוקם על ידי ס ' pneumoniae הם קטנים בגודל, בפריסה לב מושפע, וחסר מחלחל תא חיסון. בשלבים המוקדמים של זיהום השלבים, microlesions נגרמים על ידי ס ' pneumoniae מופיע כאזורי של רקמה פגועה או מודלקת מזכירה את הסימנים פתולוגיים של cardiomyopathy. מונוציטים מסוימים עשויים להיות שנצפו בתקופה זו, אך נוכחותם היא קצרה מועד ונגעים הפכו במהירות נימקי במראה ומלא בחיידקים ובמקביל ממשיך משויףow בגודל עד מותו של בעלי החיים או התערבות מיקרוביאלית. חשוב לציין, בתוך 3 ימים של התערבות אנטיביוטיקה, חדירת תאי מערכת חיסון פזרני הוא ציין באתר הנגע לשעבר וזה מלווה בתצהיר קולגן חזק. שיפוץ לב דומה דווח להתרחש בעקבות אוטם יחד עם השלכות ארוכות טווח על תפקוד לב ^11-15. לפיכך, microlesions מהווה הסבר אפשרי לאירועים הלבביים השלילי המתרחשים במהלך IPD ואולי השכיחות המוגברת של תמותה הקשורה ללב באנשי הבראה ששרדו את פרק המחלה.

במסמך זה, הוראה מסופקת על מודל העכבר הניסיוני של IPD והיווצרות נגע לב ויזואליזציה של microlesions לב בזיהום המוקדם ומאוחר שלבים. הפרוטוקול לזיהוי של תצהיר קולגן בבעלי חיים שנשמרו על ידי התערבות מיקרוביאלית הפגין. המטרה של מאמר זה היא facilitate המחקר של חוקרים אחרים על פתולוגיה דלקת ריאות החשובה והרומן הזה.

פרוטוקול

הערה: כל ניסויי העכבר היו נבדקו ואושרו על ידי בעלי החיים המוסדיים הטיפול ושימוש בועדות אוניברסיטת טקסס למדעי בריאות המרכז בסן אנטוניו (# 13032-34-01C פרוטוקול). טיפול בבעלי חיים ופרוטוקולי ניסוי דבקו משפט ציבורי 89-544 (צער בעלי החיים Act), על תיקוניו, הנחיות שירותי בריאות ציבוריות, והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (ארה"ב המחלקה לשירותי בריאות ואדם).

1. זיהום

1. להשיג עכברי BALB / c משני המינים בין גילאי 10-12 שבועות של גיל.
   הערה: ס זן pneumoniae זן 4 TIGR4 הוא לבודד קליני ארסי שכבר רצף ^16.
2. לגדול TIGR4 במרק טוד יואיט על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ עד שמגיע צפיפות אופטית (OD) ₆₂₀ של 0.5 (המקביל ל 1.0 x 10 ⁸ יחידות מושבה להרכיב מיליליטר / [CFU]). גלולה תרבות דלקת הריאות על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 3, XG 500 ולהסיר את supernatant באמצעות קו ואקום. להשעות ולדלל חיידקים עם תמיסת מלח סטרילית פוספט שנאגרו (PBS) לריכוז סופי של 1.0 x 10 ⁴ CFU / ml.
3. שימוש בחדר אינדוקציה, להרדים עכברים עם 2.5% isoflurane מתאדה בחמצן. אשר מדינה בהרדמה על ידי קמצוץ הבוהן עדין עם פינצטה הבוטה.
   1. מחזיק את העכבר בהרדמה בעורף וזקוף עם יד אחת, להזריק כל עכבר intraperitoneally (IP) עם ש '100 μl ההשעיה pneumoniae באמצעות מזרק עם מחט 27-30 מד (המקביל למינון אתגר של 1.0 x 10 ³ CFU). הנח את גב העכבר בכלוב שלה. עכברים בדרך כלל מתעוררים 30-40 שניות לאחר הזרקה.
4. לאפשר הזיהום להמשיך לפחות 24 (מוקדמת) או 30 שעות (מתקדמות).
   1. להרדים את העכברים על ידי CO ₂ מחנק. בצע נקע בצוואר הרחם על מנת להבטיח עכבר נפטר. המתת חסד הוא אישור נוסף על ידי ההסרהשל הלב בשלב 1.6.
5. לחטא את הזנב עם ספוגית אלכוהול ולגזור סעיף 2-3 מ"מ. אסוף 2 μl דם וסדרתי לדלל את הדם של פי 10 בPBS המכיל הפרין סודיום 1 פעמים U / ml חמש. דילולים צלחת סידוריים על צלחת אגר דם סויה tryptic דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2. להסיק למחרת ממושבה סופר את הרמה של בקטרמיה.
6. לשתק את העכבר במצב שכיבה על פלטפורמה כירורגית. תרסיס החזה עם 70% אתנול ומייבשים. בעזרת מספריים ומלקחיים כירורגיים לפתוח את חלל החזה, להסיר את כלוב הצלעות, ותחצה את הסרעפת כדי לחשוף את הלב וריאות. מספריים באמצעות לחתוך את כלי הדם קשורים ללב ולעדינות בלו הלב בזהירות כדי למנוע שטפי דם עם מלקחיים.
7. יש לשטוף את הלב עם PBS ולאחר מכן למקם לקלטות אוסף דגימת רקמה כך שסעיפי העטרה היו מתקבלים בחתך רקמה. להטבעת פרפין, PLACe הקלטות ב 10% פתרון שנאגר פורמלין ולמחרת לשלוח להטבעת פרפין.
   1. לחלופין הקפאת הבזק באמצעות מתחם אוקטובר בתוך cryomold שהושם על קרח יבש.

2. ויזואליזציה של פצעים לב וPneumococci בתוך נגעים

1. צמצם את חלקי לב-מוטבע פרפין כך ש4 חדרי הלב גלויים בכל קטע רקמה. חותך שקופיות בעובי של 5 מיקרומטר.
2. שקופיות Deparaffinize וכתם עם hematoxylin וeosin (H & E) תוך שימוש בשיטות סטנדרטית ^17.
3. צפה בH & E מוכתמת חלקי לב באמצעות מיקרוסקופ אור בנמוך (100X, 200X) ו- (טבילת שמן: 400X, 1,000X) גבוהה בהגדלה. לאפיין את לב לנוכחות של microlesions בשריר הלב. כאן, לרכוש תמונות H & E באמצעות מיקרוסקופ 2 Zeiss Axioskop מצויד במטרת הצמצם 1.3 Plan-NEOFLUAR מספרית 100X.
   הערה: בשלבים המוקדמים l לבesions מופלה על ידי הופעת ההפרש שלהם בצבע ובמקרים מסוימים הנוכחות של תאי מערכת חיסון (מונוציטים וגרנולוציטים) מה שנראים כמונוציטים. בנגעים מתקדמים, במיוחד אלה ראו בשעה 30, תאי מערכת חיסון הם נגעים כמו vacuole-נעדרו וגדולים הם נצפו במקום שלהם. חשוב לציין כי בעוד שזרם תא חיסון בשלבים המוקדמים של התפתחות נגע לב השלבים יכול להתרחש זה לא נראה דרישה.

3. Immunofluorescent מיקרוסקופי Pneumococci בתוך Microlesions

1. לב סעיף בcryomolds עם microtome בעובי של 5 חלקי מיקרומטר ומקום על גבי שקופיות זכוכית טעונות חיובי. לאפשר סעיפי לב קפוא להפשיר ואוויר יבש. לתקן סעיפים במשך 10 דקות ב 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין (pH 6.8-7.2 של 25 מעלות צלזיוס).
2. לשטוף שקופיות (3x) בPBS במשך 5 דקות, permeabilize במשך 15 דקות ב0.2% Triton X-100 ב PBS, ולאחר מכן לשטוף שוב בPBS.
3. secti רקמת בלוק בשקופיות עם סרום עיזים 10% ב- PBS במשך שעה 1.
4. יש לשטוף את שקופיות עם PBS, מכסים ודגירת סעיפי לב עם ארנב נגד זן 4 antiserum pneumococcus ב 1: 1000 ב- PBS עם סרום עיזים 10% לשעה 2 ב 37 ° C.
   הערה: לבקרות שליליות חוקרים צריכים להשתמש antiserum ארנב הנאיבי
5. לאחר שטיפה עם PBS, מכסים ודגירה קטעים עם עז 10% בסרום-PBS עם נוגדן מצומדות FITC נגד ארנב עז בשעה 1: 2,000 למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
6. בעקבות ההוראה של היצרן, השתמש DAPI (4 ', 6 Diamidino-2-Phenylindole) בשעה 5 מ"ג / מיליליטר להדמיה של גרעינים אוקריוטים. לשטוף והר סעיפי רקמות עם FluorSave.
7. לרכוש תמונות ניאון באמצעות מערכת מיקרוסקופ confocal בהגדלה שניהם נמוכה וגבוהה. התאם את מספרי הצמצם בהתאם כדי להשיג תוצאות אופטימליות. כאן, לרכוש תמונות ניאון באמצעות מערכת confocal עם מטרת צמצם מספרית 60x 1.42.

"> 4. אנטיביוטי הצלה של עכברים ספיגה

1. תתחיל עם ip הנגוע עכברים עם 1.0 x 10 ³ CFU של TIGR4 כפי שצוין קודם לכן בשלב 1.
2. החל מהשעה 30 לאחר פגיעת שעות, לנהל ip אמפיצילין הכיתה תרופות (80 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) ב100 מלוח μl כל 12 שעות במשך 36 שעות. לאסוף לבבות בנקודת הזמן הרצוי והתהליך כמתואר בשלב 1.6 להטבעת פרפין ורקמה, חתך.

5. קולגן הפקדת איתור

1. שימוש בקסילן ושוטף אלכוהול מדורג עם קטעי מים, deparaffinize ורקמת מימה deionized תוך שימוש בשיטות סטנדרטית ^17. פנק את החלקים עם 0.2% חומצת phosphomolybdic מימית במשך 5 דקות ולשטוף עם מים deionized במשך 5 דקות.
2. חלקי כתם עם 0.1% אדומים סיריוס בחומצה picric לשעה 2 בטמפרטורת חדר.
3. לשטוף חלקים ב0.01 N חומצה הידרוכלורית במשך 3 דקות ולשטוף באמצעות אתנול 70% דקות 1.
4. Dehydrate החלקים באמצעות זהה אך הפוך סדר שוטף שלהותווה ב5.1, ליבש חלקי לב בהגדלת ומדורגים ריכוזי אתנול אז קסילן.
5. סעיפי רקמות הר עם פתרון הרכבה להערכה מיקרוסקופית.
6. כדי לזהות אזורים של בתצהיר קולגן, לבחון קטעי רקמה צבעוניים לאזורים של מכתים קריאה עמוק בהגדלה נמוכה וגבוהה באמצעות מיקרוסקופ אור. אזור כלשהו בתוך חדרי הלב של הלב שהוא אדום הוא אזור שבו קולגן הופקד. אזורים ללא הכתם האדום הזה הם אתרים של רקמה בריאה החסרים בתצהיר קולגן. במסמך זה, לרכוש Picro סיריוס אדום תמונות מוכתמות באמצעות מיקרוסקופ מצויד מטרת צמצם מספרית 20X 0.5.
   הערה: הכתמים האדומים אטריום ברקמות בריאות.

תוצאות

ויזואליזציה של Microlesions על ידי H & E

microlesions לב נצפה בחדרי הלב של H & E המוכתמות חלקי לב מעכברים עם IPD הבא אתגר ה- IP שלהם עם TIGR4. איור 1 מדגימה את העלייה בגודל של נגעים אלה בין פוסט-זיהום 24 ו -30 שעות (HPI), עם מספר גדול יותר של hematoxylin pneumococci -stained (כחול-סגול כלומר,) גלוי בתוך הנגע. Microlesions התאפיינו במורפולוגיה כמו vacuole-, צפוף eosin (אד...

דיון

בדוח זה, שיטה לשחזור מאוד כדי לגרום לS. pneumoniae תיווך microlesions לב בעכברים במהלך IPD והטכניקות להדמיה שלהם באו לידי ביטוי. עכברים נגועים במינון של חיידקים שעולה סף של המערכת החיסונית לקבלת אישור, שמוביל לבקטרמיה בדרגה גבוהה, דומה לזו המתרחשת במהלך אלח דם אדם, ומוביל לטרנסלוקציה חיידק לשריר הלב. מסיבות שעדיין לא ידועות, S. pneumoniae בלב הוא מסוגל לשכפל לא נרתע מהתגובה החיסונית המארח. זה הוא הנושא של חקירה מתמשכת ופרסום זה עשוי להקל על חוקרים אחרים במאמציהם ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מרק טוד-יואיט	תרכובת ניאוגן	7161A
O.C.T 	טישו-טק (סאקורה פינטק)	4583
טריטון X-100	פישר סיינטיפיק (Acros)	9002-93-1
סרום עיזים רגיל	Abcam	ab7481
אנטי-סרוטיפ 4 פנאומוקוקוס אנטיסרום	Statens Serum Institut	16747
עז נגד ארנב FITC נוגדן מצומד	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicillin	Sigma	A9393
חומצה פוספומוליבדית 0.2%	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	26357-01
0.1% סיריוס אדום בחומצה פיקרית	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	26357-02
0.01 N חומצה הידרוכלורית	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	26357-03
שקופיות מיקרוסקופ רקמות שקופיות	Polysciences, Inc	24216
משחה וטרינרית פרלובה	Dechra	12920060
ערכת צביעת המטוקסילין ואאוזין	לא מוגדרת		תקן