כתב יד זה מתאר פרוטוקול לבחינת מערכת הריח של מכרסמים. מבחן ההתרגלות/אי-השבתה של חוש הריח יאפשר לחוקרים לקבוע אם עכבר מתרגל לריח המוצג שוב ושוב והאם העכבר מפגין חוסר התרגלות כאשר מוצג לו ריח חדש.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
סרטון זה מדגים טכניקה לביסוס נוכחות של מערכת ריח המתפקדת באופן תקין בעכבר. הבדיקה עוזרת לקבוע אם העכבר יכול להבחין בין ריחות לא חברתיים לריחות חברתיים, האם העכבר מתרגל לריח המוצג שוב ושוב, והאם העכבר מפגין התרגלות כאשר מוצג לו ריח חדש. מאחר שמבחני התנהגות חברתית רבים מודדים את תגובת חיית הניסוי לעכבר מוכר או חדש, ניתן להימנע מתוצאות חיוביות כוזבות על ידי קביעה שבעלי החיים יכולים לזהות ולהבחין בין ריחות חברתיים. ישנם שיקולים דומים במבחני למידה כגון התניה של פחד המשתמשת בריח כדי ליצור סביבה חדשה או רמזי ריח כגירוי אסוציאטיבי. ליקויים במערכת הריח יפגעו ביכולת להבחין בין הקשרים וליצור אסוציאציה עם רמז ריח במהלך התניה של פחד.
במבחן מגורי הריח, העכבר מוצג שוב ושוב עם מספר ריחות. כל ריח מוצג שלוש פעמים למשך שתי דקות. החוקר רושם את זמן ההרחה המכוון לריח כמדידה של תגובת הריח. עכבר טיפוסי מראה ירידה בתגובה לריח על פני מצגות חוזרות ונשנות (התרגלות). לאחר מכן הנסיין מציג ריח חדש שמעורר רחרוח מוגבר לכיוון הריח החדש (Dishabituation). לאחר הצגה חוזרת ונשנית של הריח החדש, החיה מראה שוב התרגלות. פרוטוקול זה כולל הצגת מים, שני ריחות לא חברתיים או יותר, ושני ריחות חברתיים. בנוסף להפחתת בלבול ניסיוני, בדיקה זו יכולה לספק מידע על תפקוד מערכות הריח של קווי עכבר חדשים, נוק-אין ונוקאאוט מותנה.
מבוא
עכברים תלויים בolfaction לניווט סביבות חדשות, מציאת מזון, להכרה באנשים אחרים, והתנהגות מינית 1-3. זה חיוני כי חוקרים לקבוע אם או לא יש לי חיות ניסוי חוש ריח תפקוד לפני מתן בדיקות התנהגותיות הכוללות מזון, אינטראקציה חברתית, או כל ריחות שנועדו לעורר תגובה מהעכבר. תתרנות או חוסר היכולת להבחין בין ריחות שונים, עלול לגרום לתוצאות חיוביות או שליליים שגויות במגוון רחב של פרדיגמות התנהגות, כך היכולת של עכבר כדי לזהות ולהבחין ריחות יש לקבוע לפני סוגים אחרים של בדיקות התנהגותיות מבוצעים.
מבחן ההתרגלות / dishabituation חוש הריח תואר לראשונה בשנת 1980 4. הבדיקה הותאמה לשימוש בעכברים על ידי בני הזוג. מו יאנג וז'קלין קראולי 5. זוהי בדיקה פשוטה וזולה שמאפשרת לחוקר לestaמלמולים שעכבר יכול לזהות ולהבדיל בין ריחות. בנוסף לבדיקת חוש ריח, בדיקה זו מאפשרת לחוקר לבחון את ההתנהגות הכללית של העכבר וצריך להיעשות מוקדם במשטר בדיקות. תצפיות איכותיות בדבר התנועה של העכבר, סימנים של חרדה, רמת הפעילות, ותגובה לריחות חברתיים לעומת ריחות מזון עשויות לאותת אזורים החדשים שבו בדיקה יכולה להתבצע.
בבדיקה זו, צמר גפן טבול בריחות שונים מוצגים לעכבר שלוש פעמים ברציפות. עם כל הצגה חוזרת ונשנית של ריח, העכבר להרגיל לקלון צמר גפן, מבלה פחות זמן חוקר אותו בכל מצגת שלאחר מכן. כאשר ריח חדש מוצג, dishabituation מתרחש, ועכבר טיפוסי לבלות יותר זמן חוקר את הספוגית, מצביע על כך שהוא יכול להבחין בין הריחות הנוכחיים וקודמים 5. בדיקה זו ניתנת לעכבר אחד בכל פעם וכוללת ACC 45 דקותתקופת limation אחרי 45 דקות של בדיקות.
למרות שבדיקה זו היא קלה לביצועה ניתן להשתמש כדי לחקור שאלות מתוחכמות על מערכת חוש הריח עכבר. בדיקות אחרות פופולריות של olfaction, כגון בדיקת מזון הקבור, פשוט להקים את הנוכחות או עדר של תתרנות. עם זאת, בדיקת האפליה והתרגלות חוש הריח מאפשרת לחוקר כדי לקבוע שעכבר יש את היכולת לזהות ריחות אבל יכול להבחין בין ריחות שונים לא רק. הדפוס של התרגלות וdishabituation נעשה שימוש כדי לקבוע, כי מוטציות חדשות יכולות להפלות בין ריחות 6,7. במחקר מפתיע, Fadool ועמיתיו השתמשו תערובות מורכבות של ריחות להראות עכברים שעם מחיקה ממוקדת-גן של ערוץ Kv1.3 הם "smellers סופר" שיכול להבחין ריחות דומים מאוד טובים יותר מעכברים רגילים 8.
כאשר בוחן מודל עכבר נוקאאוט חדש כדאי establisשעות הנוכחות של התנהגות נורמלית למשימות חושיות בסיסיות. כאשר נעשו בשלב מוקדם במשטר בדיקות, אפליית הריח ובדיקת הרגלה נותנת חוקר את ההזדמנות כדי לבחון כל התנהגויות יוצאות דופן. תצפיות אלה יכולים למנוע תוצאות חיוביות או שליליות כוזבות בבדיקה הבאה שניתן לייחסם לבלבול מאפיינים של המוטציה. כחוקרים ממשיכים לחקור התנהגות חברתית הצורך לוודא תפקוד חוש הריח בסיסי הופך להיות חשוב יותר ויותר. בנוסף לבחינת olfaction בקווים מוטנטים, בדיקה זו יכולה לשמש כדי לענות על שאלות ספציפיות כגון האם טיפול תרופתי ספציפי מגדיל תגובה של בעלי חיים לגירויי ריח חברתיים או אם עליות תגובתם לגירויי כל הריח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עכברי הזכרים הבוגרים המשמשים בניסוי הבא נוצרו ושוכנו באוניברסיטה ביילור בטמפרטורת סביבה של 22 מעלות צלזיוס, עם אור 14 שעות ו -10 שעות חשכה (20:00-06:00 HR) מחזור יומי. עכברי גישה כרצונך מודעת מזון ומים היו נתון. כל הנהלים לעכברים היו בעמידה במכון הלאומי לבריאות הנחיות לטיפול והשימוש בחי מעבדה ופרוטוקול בעלי החיים אושרו על ידי אוניברסיטה ביילור טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. עכברים נבדקו בבוקר / אחר הצהריים המוקדמים מאוחר. לכל הנהלים מתחת לחוקר צריך ללבוש כפפות כדי למנוע ריחות ולמנוע זיהום.
1. הכנה של ריחות ללא חברתיים
- הכן ריחות הלא-חברתיים טריים בכל יום של בדיקות.
הערה: החוקר צריך להשתמש בכפפות כדי להכין את הריחות.- מלא 3 צינורות צנטריפוגה עם 10 מיליליטר של מים בכל.
- של תמצית בננת פיפטה 100 μl למיליליטר 15 & #160; צינור חרוטי ושל תמצית שקדים 100 μl לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר שני לדילול 1: 100.
הערה: שפופרת 15 מיליליטר השלישי רק תכיל מים.
2. הכנה של ריחות חברתיים
- הכן ריחות חברתיים טריים על בדיקות בוקר תתרחש. להשיג ריחות חברתיים משני כלובים שלא נוקו במשך לפחות שלושה ימים ומכילים מספר שווה של עכברים. להשיג ריחות חברתיים מעכברים מאותו המין כנושא הבדיקה.
שים לב: אלה הם להיות מאוחסנים ב RT ויש להשתמש תוך 4-6 שעות כדי לשמור על ריח חזק ועקבי.- לקבוע כמה להיווצר ריח חברתי צמר גפן צריך: כל עכבר נבדק יוצג עם שלוש ספוגיות מהריח חברתי 1, ושלוש מריח חברתי 2.
- הכן ריחות חברתיים על ידי ניגוב מקלון צמר גפן בצורה זיגזג בחלקו התחתון של כלוב מלוכלך. להתנער כל מצעים עודפים נצמדו לקצה.
- מטליות חנות בצנצנות זכוכית גדולות עם מכסים או בכוסות מכוסות parafilm. לייעד מיכל אחד לריח חברתי 1 ושני לריח חברתי 2.
- לשמור על כלובי מקור ריח מחוץ לחדר הבדיקה הניסיוני.
3. הסתגלות של עכבר המבחן
- שים כפפות ולשקול את העכבר כדי להיבדק ולמקם בנפרד בכלוב נקי עם מכסה חוט על גבי ואת בקבוק המים הוסר.
- אפשר העכבר כדי להסתגל לכלוב החדש במשך 45 דקות בחדר אחר מחדר הבדיקה. ודא שאין ריחות או רעשים חריגים בחדר.
- כבדיקה נמשכת כ -45 דקות, מתנודד הפעמים הסתגלות על ידי הצבת העכבר הבא להיבדק לכלוב נקי להסתגל תקין לפני בדיקת העכבר הנוכחי.
4. הכנת לחדר הבדיקה
- מניחים ספוגיות כותנה טריות, קלטת מעבדה, בקבוקים המכילים דגימות ריח חברתיות, צינורות של nריחות על-חברתי, micropipette, שני השעונים, ובקבוק פסולת עם מכסה בחדר הבדיקה.
- ודא שחדר הבדיקה ללא תשלום סביר של ריחות, רעשים חזקים, ואור בהיר. אל תלבשו קולון או קרמים ריחניים.
הערה: המשקיף לא צריך להיות מסטיק או סוכרייה בתקופת הבדיקה וצריך לנסות להגביל את החשיפה שלהם למזון ריח חזק.
5. בדיקת נוהל
- להביא את העכבר התאקלם בכלוב שלה לחדר הבדיקות ולמקם את הכלוב על הדלפק בגובה שנוח לצפייה תוך כדי ישיבה.
- להציג כל ריח 3 פעמים ברציפות למשך 2 דקות בכל פעם. השתמש כדי המצגת שניתן למצוא בטבלה 1.
- פיפטה 50 μl של odorant בריח להיבדק על קצה מקלון צמר גפן ומחדש כובע מקור הריח. הרם את ראש החוט של הכלוב ולהכניס את הקצה ללא בישום, עץ של הספוגית לפתיחת בקבוק מים, בלדחוףז האורך דרך מהחלק התחתון של החוט לפסגה. הימנע מלגעת בקצה הכותנה לכל דבר, כוללים אצבעות, כך שזיהום הריח הוא נמנע.
- תמשיך לצייר את הספוגית דרך הפתח בקבוק מים עד כ 1 אינץ 'של סוף הכותנה נתקע למטה לתוך הכלוב. להדביק סוף העץ של הספוגית לצד השני של הכלוב באמצעות מעבדה קלטת.
הערה: היזהר לא לתת את המכסה נופלת חזרה אל הכלוב, גרימת רעש חזק שיפריע עכבר המבחן. - מייד תתחיל עיתוי למשך 2 דקות. השתמש טיימר אחד לעת את מצגת 2 דקות. רשום את הזמן המצטבר בילה מרחרח את הריח במהלך משפט 2 דקות. רוזן התנהגות הרחרוח של בעלי החיים באמצעות שעון עצר נפרד. מרחרח פעיל מוגדר כאשר האף של בעלי החיים מכוון לקצה הכותנה עם האף ~ 2 סנטימטר שלה או קרוב יותר לקצה.
- לאחר השלמת כל ניסוי, הרם את המכסה התיל ולהסיר את קלון צמר גפן על ידי משיכתו כלפי מטה דרך האו"םderside של המכסה (זה מונע זיהום על ידי מניעת ריח קצה הכותנה מלגעת בחוט). חותם את הספוגית בשימוש בבקבוק 500 מיליליטר פסולת.
- להכין ולהכניס את הספוגית הבאה ולהתחיל עיתוי. לאפשר כ 1 דקות בין כל מרווח בין משפט. תמשיך עד שכל ריח הוצג שלוש פעמים ברציפות, למשך 2 דקות בכל פעם.
- לאחר העכבר השלים את כל הניסויים, רוקן את בקבוק הפסולת המכיל צמר גפן משמש בפח אשפה מחוץ לחדר הבדיקה. החזר את העכבר לכלוב בבית שלה.
6. ניתוח
- לנתח נתונים עבור כל קבוצה למצב ריח באמצעות דו-כיוונית ANOVA ואחרי ניומן-Keuls או בדיקה דומה פוסט הוק כדי לקבוע התרגלות משמעותית (פחות זמן מרחרחים אותו ריחות רצופים), וdishabitutation (יותר זמן מרחרח ריח חדש).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות הפרוטוקול המתואר, תוצאות נרשמו באמצעות עשרה מבוגרים (יום לידה 90-120) זכר C57BL / 6J ושמונה זן גברי FVB מעורב-רקע (יום לידה 50-70). הבדיקה בוצעה על ידי חוקר יחיד על פני ימים רבים. כל נקודה על הגרפים מייצגת את המשך הזמן הממוצע חוקר ריח.
כאשר קלון צמר גפן טבול במים הוצג לראשונה, העכברים לבלות זמן רב בחקירת אובייקט זה רומן (איור 1: שלוש נקודות נתונים הראשונות). עם כל מצגת רצופה, פחות זמן הוא ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התוצאות אמורות במאמר זה הן אופטימליות לעכברים. העכברים להפגין תגובה חזקה לריח רומן, אז להרגיל מהירות. אחד הצעדים המרכזיים בשיטה זו היא ההכנה של הריחות. החוקר צריך לקחת בזהירות רבה כדי לבודד את הריחות מזה על מנת למנוע זיהום. היבט נוסף מפתח הוא ההצגה של מקלון צמר גפן. החוקר צריך לפתור את המיקום הטוב ביותר של קצה הכותנה כך העכבר יכול לחקור את הקצה אבל לא יקרע בקצה. מרכיב חשוב של הבדיקה הוא הבחירה של ריחות. הצגנו שלושה ריחות הלא-חברתיים, אבל זה לא יהיה קשה לכלול ריחות נוספים. אזהרה אח...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי מענק של מועצת המחקר של אוניברסיטת ביילור ועל ידי מענק מחקר מקרן האפילפסיה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כלוב עכבר | Allentown | כלוב | |
| מכסה חוט | Allentown | BCU עכבר WBL 2500 | |
| מצעים | Harlan | 7090 סאני-צ'יפס | |
| צמר גפן | VWR | 89031-270 | 6 אינץ' ידית עץ |
| תמצית בננה | מקורמיק | ||
| תמצית שקדים | מקורמיק | ||
| סרט מעבדה | VWR | 89098-062 | |
| שעון עצור | VWR | 62374-000 | |
| כפפות ניטריל | VWR | 82026 | |
| מכשיר תזמון | VWR | 61161-350 | |
| צינורות חרוטיים 15 מ"ל | VWR | 89003-294 | |
| כוסות 2 ליטר | פיירקס | 1003 | |
| פרפילם | פרפילם | PM-992 | 4 אינץ' x 250 אינץ' |
| בקבוק 1 ליטר עם פקק | VWR | 89000-240 |
מקורות
- Doty, R. L. Odor-guided behavior in mammals. Experientia. 42, 257-271 (1986).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm Behav. 46, 247-256 (2004).
- Keverne, E. B. Importance of olfactory and vomeronasal systems for male sexual function. Physiol Behav. 83, 177-187 (2004).
- Gregg, B., Thiessen, D. D. A simple method of olfactory discrimination of urines for the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. Physiol Behav. 26, 1133-1136 (1981).
- Yang, M., Crawley, J. N. Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8 24), (2009).
- Pan, Y. W., Kuo, C. T., Storm, D. R., Xia, Z. Inducible and targeted deletion of the ERK5 MAP kinase in adult neurogenic regions impairs adult neurogenesis in the olfactory bulb and several forms of olfactory behavior. PLoS ONE. 7, e49622(2012).
- Wesson, D. W., Levy, E., Nixon, R. A., Wilson, D. A. Olfactory dysfunction correlates with amyloid-beta burden in an Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci. 30, 505-514 (2010).
- Fadool, D. A., et al. Kv1.3 channel gene-targeted deletion produces 'Super-Smeller Mice' with altered glomeruli, interacting scaffolding proteins, and biophysics. Neuron. 41, 389-404 (2004).
- Arakawa, H., Arakawa, K., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Scent marking behavior in male C57BL/6J mice: sexual and developmental determination. Behav Brain Res. 182, 73-79 (2007).
- Baum, M. J. Sexual differentiation of pheromone processing: links to male-typical mating behavior and partner preference. Horm Behav. 55, 579-588 (2009).
- Ferguson, J. N., et al. Social amnesia in mice lacking the oxytocin gene. Nat Genet. 25, 284-288 (2000).
- Yang, M., et al. Low sociability in BTBR T+tf/J mice is independent of partner strain. Physiol Behav. 107, 649-662 (2012).
- Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33, 1206-1215 (2008).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2011).
- Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nat Methods. 11, 629-632 (2014).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
