Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק פיגומי nanofiber electrospun עם ארגון מדורג של סיבים ולחקור את היישומים שלהם בויסות מורפולוגיה תא / אורינטציה. הדרגתיים בכל קשורים לתכונות פיסיקליות וכימיות של פיגומי nanofiber מציע מגוון רחב של יישומים בתחום ביו-רפואיים.

תקציר

מטרת פרוטוקול זה היא לדווח על שיטה פשוטה ליצירת פיגומי ננו-סיבים עם הדרגתיות בארגון הסיבים ולבדוק את היישומים האפשריים שלהם בשליטה במורפולוגיה/כיוון התא. ארגון ננו-סיבים נשלט באמצעות מנגנון ייצור חדש המאפשר ירידה הדרגתית בארגון הסיבים בפיגום. שינוי יישור הסיבים מושג באמצעות הפחתת זמן התצהיר של סיבים אלקטרוספונים אקראיים על מחצלת סיבים מיושרת חד-שישית. על ידי כיסוי הקולט במחסום/מסכה נעים, לאורך אותו ציר כמו שקיעת סיבים, המבנה הארגוני נשלט בקלות. למטרות הנדסת רקמות, ניתן לזרוע תאי גזע שמקורם בשומן לפיגומים אלה. תאי גזע עוברים שינויים מורפולוגיים כתוצאה ממיקומם במבנה הארגוני המגוון, ויכולים להתמיין לסוגי תאים שונים בהתאם למיקומם. בנוסף, הארגון המדורג של הסיבים משפר את הביומימיקרי של פיגומי ננו-סיבים כך שהם דומים יותר לכיוונים הטבעיים של ננו-סיבי קולגן באתר החדרת הגיד לעצם בהשוואה לפיגומים מסורתיים. באמצעות ננו-אנקפסולציה, הסיבים המדורגים מאפשרים גם את האפשרות לבנות שיפועים כימיים בפיגומי סיבים, ובכך לחזק עוד יותר את היישומים הפוטנציאליים שלהם בסינון מהיר של אינטראקציה בין תאים לחומרים והתחדשות רקמות בין-פנים. טכניקה זו מאפשרת ייצור פיגומי שיפוע רציפים, אך היא גם יכולה לייצר סיבים בשלבים נפרדים על ידי שליטה בתנועת המחסום/המסכה הנעים בצורה בדידה.

מבוא

Nanofibers הוא כלי פופולרי להנדסת רקמות בגלל היכולת שלהם לחקות את המטריצה ​​תאית במבנה שלה וגודלה היחסי ^1. עם זאת, חלק מממשקים האם של הרקמה, כגון אתר הכנסת גיד לעצם, מכילים סיבי קולגן, אשר מפגינים מבנה ארגוני משתנה שמגדיל ביישור לגיד ופוחת באתר העצם ^2-5. אז, לשחזור רקמות יעילות יש צורך לפברק פיגום שיכול ביעילות לחקות שיפוע מבני זו.

מחקר בעבר, חל נערך על שינויים הדרגתיים בהרכב סיבים, במיוחד, תכולת מינרלים ^6. עם זאת, יצירה מחדש של המרכיב המבני של רקמות חיבור נשארה נחקרה במידה רבה. מחקר מוקדם יותר בדק הדרגתיים מורפולוגיים על ידי לימוד ההשפעה של צפיפות חלקיקי סיליקה משטח על ההתפשטות של osteoblasts calvarial החולדה ומצא Inverמערכת יחסים בין se צפיפות חלקיקי סיליקה ותא התפשטות ^7. אבל השינויים מורפולוגיים שתיווך שגשוג תאים בעבודה קודמת היו בעיקר קשורים למשטח חספוס חסר היכולת במחק שינויים ארגוניים סיבים ^7,8. אחד מחקרים אחרונים ניסו לפברק פיגום שחיקה אוריינטציות קולגן סיבים הייחודיות באמצעות אספן חדשני לelectrospinning ^9. בעוד מחקר זה הצליח לייצר פיגום עם סיבים שני מיושרים ואקראיים, היא לא הצליחה לחקות את השינויים הדרגתיים שהוצגו ברקמות המקומיות. כמו כן, בייצור רכיבים נפרדים, עם שינוי מיידי ממיושר לכיוון אקראי, המאפיינים ביו-המכאניים של פיגום זה ירד באופן משמעותי. אין עבודה קודמת הצליחה לייצר פיגומי nanofiber ישימים עם דרגות רציפות באורינטציות סיבים ממיושרים ואקראי. המחקר שנערך לאחרונה שלנו הראה בילוי מוצלח של פיגומי nanofiberעם דרגות בארגון סיבים שעלולים לחקות את הארגון האם של קולגן בגיד לעצם ההכנסה ^10. עבודה זו מבקשת להציג את הפרוטוקולים המשמשים לייצור פיגומי nanofiber עם מבנה דומה מאוד לזו של ארגון סיבים בממשק רקמת גיד לעצם הילידים.

מבני nanofiber Gradient יש פוטנציאל מרחיק לכת יישומים על פני מגוון רחב של תחומים. אנחנו מתמקדים ביישומים להנדסת רקמות של אתר הכנסת גיד לעצם על ידי שילוב של הפיגומים שלנו עם תאי שמקורם שומן גזע (ADSCs) שכבר מנוצלים לשחזור רקמות על מצעים שונים ^11-14. בנוסף, ADSCs דומה מאוד באופיים לתאי גזע של מח עצם במונחים של multipotency והמשאבים שלהם הוא בשפע שניתן לקצור באמצעות ^15,16 הליך שאיבת שומן פשוט. זריעת תאים אלה לפיגומי nanofiber מדורגים משפרת עוד יותר את tisלתבוע יישומים הנדסיים כך שהוא מאפשר להפצה מבוקרת של התאים שיכולים להתמיין לרקמות שעלולים להיות שונות. בנוסף לזריעת תאי גזע, יכול להיות במארז nanofibers עם מולקולות איתות לרגולציה של תגובה תאית. צימוד nanoencapsulation עם השיפוע הארגוני של פיגומים אלה מאפשר לחקר התנהגות סלולרית או עיצובי שתל אפשריים וציפויים. Encapsulation של מולקולות חלבון פונקציונליות כמו עצם המוךפו"גנטי 2 (BMP2), אשר הוכח לגרום להתמיינות תא עצם ^15,16, עוד יכול לשפר את יישומי הנדסת רקמות של פיגומים אלה ^10.

פרוטוקול

1. הכנת הפתרון

1. הכן פתרון של פולי (ε-caprolactone) (PCL) (M _w = 80,000 g / mol) בריכוז של כ 100 מ"ג / מיליליטר. לפזר PCL בתערובת של dichloromethane (DCM) וN, N-dimethlyformamide (DMF) ביחס של 4: 1 (V / V) בריכוז של 10% (w / v).
2. מניחים את הפתרון בצינור זכוכית 20 מיליליטר לערבוב. מניחים שפופרת זכוכית לתוך שואב קולי במשך 30 דקות, או עד שהפתרון הוא שקוף.

2. מכשירי הכנה

1. מוסיף את פתרון PCL הכין לתוך מזרק 5 מיליליטר עם מחט קהה 21 מד המצורף.
2. מניחים משאבת מזרק בעמדת electrospinning אנכית, על פי איור 1.
3. השתמש אספן הפלדה אל-חלד עם פער חלל פתוח של 2 x סנטימטר 5 סנטימטרים למצע סיבים מיושרים. הנח את האספן 12 סנטימטר מקצה המחט.
4. חבר את הזרם ישר (DC) אספקת חשמל מתח הגבוה למחט וקרקע האספן. ודא שהאספן מעוגן בנפרד ללא קשר לציוד מעבדה האחר.

3. Electrospinning

1. משאבת Set מזרק ל1.50 מיליליטר / שעה, עד שהטיפין יוצרות בקצה המחט מוחלפות מייד כשהוסר. ואז, להגדיר את קצב הזרימה עד 0.50 מיליליטר / שעה.
2. הפעל מפעיל מתח kV 12.
3. Electrospin עד הסיבים מיושרים uniaxially לכסות לחלוטין את הפער באספן.
4. החל דבק לקצוות של צלחת זכוכית קטנה ולהעביר את הסיבים מאספן הפער לצלחת הזכוכית. מניחים את צלחת הזכוכית בחלק העליון של פיסת נייר אלומיניום שיש באותו גודל כמו צלחת הזכוכית ומעוגנת.
5. מקם את אספן המזרק השני על פי איור 3.
6. צרף את מסכת הפלסטיק למשאבה השנייה מזרק וזה 2 מ"מ מעל עמדת האספן.
7. להוסיף Coumarin 6 ב 1% (w / w) לפתרון-אם נאן PCLoencapsulation הוא desired- ולערבב עד הפתרון הוא שקוף.
8. טען את PCL או פתרון PCL / Coumarin 6 למחט 5 מיליליטר עם מחט 21 מד בוטה. הגדר משאבה אנכית עד 0.50 מיליליטר / שעה ואופקית למשוך בשעה 9 מיליליטר / שעה או במהירות משוערת של 1 מ"מ / דקה.
9. Electrospin עד המסכה עבר כמעט לחלוטין את האספן, אבל עם אזור הקצה עדיין מתחת למסכה.

4. סיבי אפיון

1. דגימות מקום עם קלטת מוליך דו-צדדית להרבעה מתכתית ומעיל עם פלטינה במשך 40 שניות באמצעות coater גמגום בגיל 40 mA.
   1. לבחון סיבים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) על פי המחקרים הקודמים שלנו ^17,18.
   2. לאסוף תמונות במתח מאיץ של 15 קילו וולט.
2. לבצע ניתוח מהיר התמרה (FFT) על מדגם סיבים נפרד למדוד יישור סיבים. המידע מפורט על יישור סיבי מדידה על ידי FFT יכול להתייחס to מחקרים קודמים ^19,20.

5. בתאי גזע זריעה.

1. לעקר את דגימות סיבים על ידי שריה בתמיסת אתנול 70% עבור שעה 2. לאחר מכן לשטוף את הסיבים עם מים מזוקקים כדי להסיר כל מזהמים.
2. להשיג ADSCs אנושי ותאי תרבות בבקבוק ² 25 סנטימטר על 37 מעלות צלזיוס באווירה של 95% CO אוויר / 5% _2. לשנות את מדיום תרבית תאים בכל יום אחר ^10.
3. Trypsinize התאים ולספור את מספר התאים. באופן ספציפי, להסיר את כל מדיום התרבות מהבקבוק תרבית תאים ולשטוף את התאים עם ופר פוספט (PBS) פעמיים. לאחר מכן להוסיף ^l 1 מ 'של פתרון 0.25% טריפסין EDTA (טרום חם באמבט מים עד 37 ° C) כדי לכסות את monolayer תא דגירה הבקבוק בתרבית תאי החממה במשך 2-3 דקות. הוסף בינוני תרבות 4 מיליליטר ולשטוף את כל התאים מפני השטח על ידי pipetting הבינוני בכל רחבי השטח. ה צנטריפוגה ההשעיה התא ומחדש להתפזרתא גלולה דואר במדיום התרבות. ספירת תאים באמצעות hemacytometer. זרע סביב 1 × 10 ⁴ תאים לפיגום nanofiber הניח בצלחת -culture 35 מ"מ ודגירה של 3 ו -7 ימים.
4. תאי כתם באמצעות diacetate והעמסת (5 מ"ג / מיליליטר באצטון) (FDA) ואז תמונה הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באופן ספציפי, להוסיף של פתרון ה- FDA 100 μl למנת התרבות ודגירה למשך 30 דקות. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים לפני ההדמיה ניאון. לנתח כיוון תא על ידי תכנית מעבדה-מחצלת מותאמת אישית המבוססת על המחקרים הקודמים שלנו ^10.

תוצאות

השימוש בפרוטוקול זה, מחצלת סיבים עם שיפוע ארגוני הוקמה. איור 3 מציג את התמונות שצולמו SEM במקומות שונים על פיגום nanofiber. איכותי, שניתן לקבוע שיש התקדמות מהסיבים מיושרים uniaxially ב0 מ"מ (איור 3 א) למגוון סיבים אקראי בשעה 6 מ"מ (איור 3D). FFT נותן ערך כמותי ליישור הסיבים, פרטים על התהליכים כמותיים מפורטים כאן ^19. סיבים ב0 תערוכת מ"מ FFT שמציין יישור סיבים, ובגיל 6 מ"מ דפוס FFT מסמן כיוון אקראי. יש...

דיון

החלק הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא יצירת פיגום השיפוע. חובה שהמסכה המכסה את הקולט תנוע במהירות קבועה כך שיהיה שינוי הדרגתי בתוך פיגום הסיבים. הכנה נכונה של תמיסת PCL חשובה גם כדי להבטיח את הצלחת האלקטרו-ספינינג. מומלץ לבדוק את מורפולוגיה הסיבים לפני אלקטרו-ספינינג, במיוחד לאחר האנקפסולציה של קומרין-6, מה שעשוי לדרוש מתח גבוה יותר לאלקטרוספין בצורה נכונה.

יתר על כן, הפרוטוקול מאפשר ייצור של הדרגתיות בדידה בארגון הסיבים. עם זאת, פרוטוקול זה מניב עוביים משתנים על פני הפיגום, מה שעלול להגביל את הייש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פוליקפרולקטון	סיגמא-אולדריץ'	440744
N,N-דימתליפורממיד	פישר כימיקל	D-119-1
דיכלורומתאן	פישר כימיקל	AC61093-1000
קומרין 6	סיגמא-אולדריץ'	546283
תאי גזע שמקורם בשומן	טכנולוגיות הנדסת תאים	HMSC. AD-100
Fetal Bovine	Serum Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
אתנול	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	A10490-01
אצטון	פישר סיינטיפיק	s25120a
פוספט חוצץ מלח	Invitrogen	10010023
זכוכית שקופיות	VWR International, LLC	101412-842
משאבת מזרק	פישר סיינטיפיק	14-831-200	מזרק יחיד
מנקה אולטרסאונד	ברנסון	1510
ספק	כוח DC במתח גבוהגמא מתח גבוה מחקר	ES30
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק	FEI	Nova 2300
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Zeiss	Axio Imager 2