גזירה של שריר לב נקי במיוחד מתאי גזע האנושי המושרה pluripotent באמצעות בידול מאופנן מולקולה קטן ולאחר גלוקוז רעב

סיכום

כאן, אנו מתארים פרוטוקול חזק לגזירת קרדיומיוציטים אנושיים המשלב התמיינות לבבית מווסתת מולקולות קטנות וטיהור קרדיומיוציטים בתיווך חסך גלוקוז, המאפשר ייצור של קרדיומיוציטים מטוהרים למטרות מודלים של מחלות לב וכלי דם וסינון תרופות.

תקציר

cardiomyocytes מקורן בתאי גזע pluripotent אדם מושרה (hiPSC-CMS) הפך מקור תא חשוב להתייחס לחוסר cardiomyocytes העיקרי זמין עבור יישומי מחקר וtranslational בסיסיים. להבדיל hiPSCs לשריר לב, פרוטוקולים שונים, כוללים גוף embryoid (EB) בידול מבוסס ואינדוקצית גורם הגדילה פותחו. עם זאת, פרוטוקולים אלה אינם יעילים ומשתנים מאוד ביכולתם ליצור cardiomyocytes המטוהר. לאחרונה, אפנון פרוטוקול ניצול קטן על בסיס מולקולות איתות Wnt / β-קטנין הוצג לקידום בידול לב עם יעילות גבוהה. עם פרוטוקול זה, יותר מ -50% -60% מתאים מובחנים היו cardiomyocytes טרופונין חיובי לב נצפו באופן עקבי. כדי להגדיל את טוהר cardiomyocyte נוסף, התאים המובחנים היו נתונים לגלוקוז רעב לחסל במיוחד שאינו cardiomyocytes המבוסס על ההבדל מטבוליםים בין cardiomyocytes ולא cardiomyocytes. באמצעות אסטרטגית בחירה זו אנו באופן עקבי השגנו עלייה גדולה יותר מ -30% בשיעור cardiomyocytes אי cardiomyocytes באוכלוסייה של תאים מובחנים. cardiomyocytes הנקי במיוחד אלה צריכים לשפר את האמינות של תוצאות מאדם מבוסס iPSC בלימודי דוגמנות המחלה מבחנה ומבחני הקרנת סמים.

מבוא

cardiomyocytes אדם מן המעלה הראשון הם קשה להשגה בגלל הדרישה לביופסיות לב פולשנית, קושי במתנער לתאים בודדים, ובגלל הישרדות תא לטווח ארוך עניה בתרבות. בהתחשב בזה חוסר cardiomyocytes האנושי הראשוני, cardiomyocyte מקורן בתאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מטופל ספציפי טכנולוגיה (hiPSC-CM) כבר נחשבה כמקור עוצמה חלופי cardiomyocyte למחקר בסיסי, כמו גם יישומים קליניים וtranslational כגון דוגמנות מחלה ותרופה תגלית ^1. מאמצים מוקדמים בתאי גזע pluripotent לcardiomyocytes מועסקים פרוטוקולי בידול באמצעות גופי embryoid (EBS), אך שיטה זו אינה יעילה בשריר לב בהפקת כי לעתים קרובות פחות מ -25% מתאים בEB מכים cardiomyocytes ^2,3. יחסית, פרוטוקול בידול המבוסס על monolayer באמצעות ציטוקינים Activin וBMP4 מוצג יעילות גבוהה יותר מאשר EBS, אבלפרוטוקול זה הוא עדיין יחסית לא יעיל, דורש גורמים יקרים צמיחה, ופועל רק במספר מצומצם של שורות תאי גזע האנושי pluripotent ^4. לאחרונה, פרוטוקול יעיל ביותר, המבוסס על monolayer hiPSC בידול cardiomyocyte פותח על ידי ויסות Wnt / β-קטנין איתות ^5. אלה hiPSC-CMS להביע T לב טרופונין וactinin אלפא, שני חלבונים sarcomeric שהם סמנים סטנדרטיים של cardiomyocytes ^6. הפרוטוקול מתאר כאן הוא עיבוד של,, ^5,7 זה קטן על בסיס מולקולות תא מזין ללא הבחנה monolayer שיטה. אנו מסוגלים להשיג להכות cardiomyocytes מhiPSCs לאחר 7-10 ימים (איור 1). עם זאת, בעקבות בידול cardiomyocyte וכתוצאה מכך 50% הכו את התאים, immunostaining באופן עקבי מראה את קיומה של אוכלוסייה הלא-cardiomyocytes כי הם שליליים לסמני cardiomyocyte הספציפי כגון T טרופונין הלבבי ספציפי ואלפא-actinin. לפוrther לטהר cardiomyocytes ולחסל הלא cardiomyocytes, אוכלוסיות תאים מובחנות הטרוגנית היו נתונים לגלוקוז רעב תוך התייחסות אליהם עם מדיום תרבות גלוקוז נמוך מאוד במשך ימים רבים (איור 2). טיפול זה באופן סלקטיבי מבטל הלא cardiomyocytes בשל היכולת של שריר לב, אך לא בלתי-cardiomyocytes, לחילוף חומרים לקטט כמקור האנרגיה העיקרי על מנת לשרוד בסביבת גלוקוז נמוכה ^8. לאחר שלב טיהור זה, עלייה של 40% בשיעור cardiomyocytes אי cardiomyocytes הוא ציין, (איור 3, איור 4) ותאים אלה יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם ביטוי גנים, דוגמנות מחלה, ומבחני הקרנת סמים.

פרוטוקול

הערה: מידע ספק לכל חומרים כימיים המשמשים בפרוטוקול זה כבר מופיע בטבלה 1 ו רשימת חומרים. כל הפתרונות והציוד הבאים במגע עם תאים חייבים להיות סטרילי, ויש להשתמש בי טכניקת ספטית בהתאם. לבצע את כל incubations התרבות בC ° 37 humidified, 5% CO ₂ באינקובטור, אלא אם כן צוין אחרת. בפרוטוקול זה, כל הבידול מבוצע ב6-גם צלחות, שבי hiPSCs הם זורעים. בעקבות בידול וטיהור, יכולים להיות מנותקים תאים וreplated לשימוש במורד הזרם.

1. הכנה בינונית

1. לבינוני E8, להפוך את פתרון מניות עבור כל רכיב בינוני (NaHCO _3, חומצה אסקורבית L-2-פוספט, סלניט נתרן, transferrin, אינסולין, FGF2, TGFB1) ולאחסן את הפתרונות ב -20 ° C. הוספת הכמות מתאימה של פתרונות מניות לבקבוק DMEM / F12 ולסנן לעקר. Concentr הפתרוןניתן למצוא ation והתקנת תגובה לרכיבי המניות והבינוניים E8 בטבלה 1.
2. לפתרון החוץ-התאי, להפשיר את מטריצת קרום במרתף (מסופקת בדרך כלל על 10 מ"ג / מיליליטר) בשעה 4 ° CO / N. Matrigel משמש בדרך כלל לתרבות תאי גזע pluripotent כי תאי גזע pluripotent אדם יכולים לדבוק גם לחומר זה באמצעות integrin אלפא-6-beta-1 ^9. ברגע שהפשיר, לעשות aliquots 2.25 מ"ג (250 μl) על קרח באמצעות טיפים pipet הקר כקרח וצינורות ולאחסן את aliquots ב -80 מעלות צלזיוס.
   1. כאשר precoating צלחות עם ECMS, להפשיר וaliquot הפתרון תאי המטריצה ​​(ECMS) על קרח. מערבבים את ECMS ובינוני DMEM / F12 קר כקרח על יחס של 1: 200 על קרח. לשמור על קור רוח כדי למנוע התמצקות ECMS מוקדמת.
3. לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין, להוסיף 10 מיליליטר של B27 מינוס אינסולין לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI.
4. לRPMI / B27 (עם אינסולין) בינוני, להוסיף 10 מיליליטר של תוסף B27 (עם insulin) ו -5 מיליליטר של אנטיביוטיקה פן-סטרפטוקוקוס לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI.
5. למדיום גלוקוז הנמוך, להוסיף 10 מיליליטר של תוסף B27 ו -5 מיליליטר של אנטיביוטיקה פן-סטרפטוקוקוס לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI נטול גלוקוז.
6. לבינוני / הקפאת ההקפאה, לערבב בסרום שור עוברי יחד עם dimethylsulfoxide (DMSO) בשעה 9: 1. מדיום ההקפאה ניתן לאחסן עד חודש 1 על 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: יש לסנן כל כלי התקשורת ומאוחסן ב 4 ° C ושימוש בתוך 2 שבועות, אלא אם כן צוין אחרת. כל הכרכים מגיב / פתרון משמשים להלן מיועדים לבודד היטב בצלחת 6-היטב, אלא אם צוינו אחרת.

2. טרום ציפוי צלחות 6-גם עם ECMS

1. הפוך ECMS ידי ערבוב מטריצת מרתף קרום (למשל, Matrigel) עם תקשורת DMEM / F12 קר כקרח על יחס של 1: 200, ולאחר מכן להחיל 2 מיליליטר של ECMS הטרי היטב כל אחד לצלחת 6-היטב. כל טוב בצלחת 6-גם יקבל כ 90 מ"ג ECMS.
2. דגירה ECMS מצופה צלחות עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. מייד לפני תאי ציפוי, לשאוב DMEM פתרון F12 / מכל טוב. אז הצלחות תהיה מוכנות לקבל תאים.

3. ההפשרה hiPSCs קפוא

הערה: באופן קרוב בצע הליך זה כפי שהוא עשוי להוביל לculturing האופטימלי ובידול במורד הזרם של hiPSCs לhiPSC-CMS הבא מחזור ההקפאה / הפשרה.

1. להפשיר בקבוקון אחד של hiPSCs לכל טוב של 6-גם צלחת. הכן צינור חרוטי 15 מיליליטר עם 9 מיליליטר של מדיום E8 קר עם מעכבי ROCK (10 מיקרומטר) לכל בקבוקון. מעכב ROCK משפר הישרדות hiPSCs הבאה הקפאה ^10. שמור את הצלוחיות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס להפשיר את התאים עד קרח קוטר גביש כ 5 מ"מ שנשאר.
2. תרסיס החיצוני של צלוחיות עם 70% אתנול. נגב את הצלוחיות עם נייר טישו לפני שעברת אותם למכסה המנוע למינרית סטרילי.
3. להעביר את התאים לתוך צינור חרוטי מוכן. יש לשטוף tהוא בקבוקון פעם אחת עם 500 μl של מדיום E8 ולהעביר את המדיום המכיל את התאים המופשרים לאותו צינור חרוטי. צנטריפוגה ב RT למשך 4 דקות ב 200 x גרם.
4. לשאוב supernatant לאחר צנטריפוגה ועדינות resuspend התא גלולה עם 2 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK (10 מיקרומטר). להעביר את תאי resuspended לאחד היטב צלחת 6-היטב מראש מצופה עם ECMS.
5. החלף את המדיום עם מדיום E8 ללא מעכבי ROCK לאחר 24 שעות של culturing. תאים צריכים דבקו בזמן הזה.

4. Passaging של hiPSCs

1. בדרך כלל, hiPSCs מעבר לאחר שהגיע 75% confluency -80% בצלחת 6-היטב. לשאוב את מדיום התרבות. מהירות לשטוף בארות עם 1 מיליליטר של סטרילית, RT PBS. לשאוב PBS.
   1. הוסף 500 μl של 0.5 mM EDTA או פתרון ניתוק תא 1x (לדוגמא, Accutase) ודגירה של 1-7 דקות ב RT. הזמן מתאים לדגירת EDTA משתנה עם קו hiPSC. מצפה לראות o מסתלסל גלויהעיבוי r של מושבות בקצוות, כמו זה מצביע על כך שפתרון EDTA או ניתוק תא מוכן להסרה.
2. לשאוב EDTA או פתרון ניתוק תא. הוסף 1 מיליליטר של מדיום E8 בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומטר. לעקור מושבות hiPSC בהיטב על ידי pipetting שוב ושוב למעלה ולמטה וריסוס את מושבות עם טפטפת P1000. מושבות צריכה להיות מחולקות 5-10 גושי תא אחרי ההשלמה.
3. העבר את המושבות שמושעות ב 1 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר.
4. לשבש את גושי תאים הגדולים לגושים קטנים במדיום E8. הוספת נפח מתאים של תקשורת E8 עם מעכב להשעית התא לדלל את התאים. נפח התקשורת להוסיף לדילול תלוי בצפיפות התאים ומספר הבארות שנזרע. באופן אידיאלי, 80% גם של hiPSCs אחת, ומחוברות צריכים להיות מדולל 01:12.
   1. להוסיף 11 מיליליטר בינוני E8 עם מעכב ROCK ל1 מיליליטר הקיים של ceפתרון ll בצינור חרוטי 15 מ"ל כאמור לקבלת דילול 01:12.
5. נוסף triturate גושי תאים לרסיסי תא קטנים (סביב 50-200 תאים בכל בר הוא הטובים ביותר). הימנע על-triturating כמו זה מפחית הישרדות תא.
6. לשאוב ECMS מהצלחות מצופים מראש ולהוסיף 2 מיליליטר של תאי resuspended לתוך כל טוב. כ -100,000 תאים לכל גם צלחת 6-גם הוא אידיאליים. שואף לוותר התאים באופן שווה סביב היטב כדי למנוע הצטברות של תאים במרכז הבאר.
7. לאחר 24 שעות של culturing, להחליף בינוני עם בינוני E8 ללא מעכבי ROCK. לשנות את מדיום התרבות כל שעה 24 עד התאים להיות מחוברות 80%. לאחר מכן, התאים מוכנים למעבר שוב. זה בדרך כלל לוקח 3-6 ימים בין הקטעים להגיע 80% confluency.

5. hiPSCs הקפאה

הערה: באופן קרוב בצע הליך זה כפי שהוא עשוי להוביל לculturing האופטימלי ובידול במורד הזרם של ירךמנג'רים לhiPSC-CMS הבאים מחזור ההקפאה / הפשרה.

1. תווית צינורות קירור עם שם שורת התאים, סוג התא, מספר מעבר, ותאריך הקפאה. כקו מנחה כללי, להשתמש בבקבוקון אחד לכל גם צלחת 6 באר. הכן צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא 9 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK (10 מיקרומטר). הכן הקפאה בינונית עם FBS 90% ו -10% DMSO, ולשמור בינוני על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
2. לשאוב תקשורת והתרבות, להוסיף 500 μl של 0.5 mM EDTA או פתרון ניתוק תא 1x ודגירה של 2-7 דקות ב RT. משך חשיפת פתרון EDTA או ניתוק תא משתנה משורת תאים לשורת תאים.
3. לשאוב EDTA או פתרון ניתוק תא. הוסף 1 מיליליטר של מדיום E8.
4. לעקור מושבות hiPSC בהיטב על ידי pipetting מעלה ומטה וריסוס את מושבות עם טפטפת P1000. מושבות לא צריכים להיות מחולקות קטן יותר מ -100 גושי תא. להעביר את התאים מושעים לצינור חרוטי מוכן המכיל E8. צנטריפוגה בRT למשך 4 דקות ב 200 x גרם.
5. לשאוב supernatant ולהוסיף 500 μl של מדיום הקפאה קר לגלולה. Resuspend גלולה ידי pipetting 01:59 פעמים. הישרדות תא משתפרת על ידי שמירה על תאים בגושים גדולים.
6. להעביר את תאי resuspended לתוך צינור קירור שכותרת. במהירות להזיז את הבקבוקונים לisopropanol הקפאת מיכל המכילה, אשר תאפשר לקירור הדרגתי. שמור את המכל עם תאים ב -80 ° C למשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר את תאי חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

6. לב התמיינות של iPSC האדם

הערה: כל התקשורת צריכה להיות לפחות ב RT כאשר הוסיפו.

1. לאחר ניתוק עם פתרון ניתוק תא EDTA או 1x, זרע כ -100,000 iPSCs האנושי על ECMS מצופה תרבות צלחות 6-גם לבידול (אותם צעדים כמו נהלי passaging תא). כאשר התאים מגיעים 85% confluency, לשנות את המדיום לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין עם 6CHIR99021 מיקרומטר מעכב GSK3-ביתא (CHIR) ולשמור במשך 48 שעות.
2. לאחר 48 שעות, להחליף את מדיום התרבות CHIR המכיל עם RPMI / B27 ללא בינוני אינסולין ולהשאיר לבד למשך 24 שעות (עד יום 3).
3. ביום 3, לשנות את התקשורת לRPMI / B27 ללא אינסולין עם 5 מיקרומטר Wnt מעכב IWR1 ולשמור במשך 48 שעות (עד יום 5).
   הערה: עיכוב Wnt יכול להיות גם ניסה באמצעות תרכובות מולקולה קטנות אחרות, כפי שתואר במחקרים קודמים ^11. IWR1 נבחר על מעכבי Wnt מולקולה קטנה אחרים בשל הטווח המוגדל שבה הוכח כיעילים בעיכוב Wnt איתות ^11.
4. ביום 5, לשנות את המדיום חזרה לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין ולהשאיר למשך 48 שעות (עד יום 7).
5. ביום 7, להחליף בינוני עם בינוני RPMI / B27 (עם אינסולין) ולהחליף בינוניים כל 3 ימים לאחר מכן עם אותו בינוני. מכות ספונטניות של שריר לב צריכה להיות גלויות ראשונה בכ היום 8 ליום10.

7. טיהור של cardiomyocytes האדם באמצעות הרעבת גלוקוז

1. ביום שלאחר 10 בידול, לשנות את המדיום בכל טוב של 6-גם הצלחת 2 מיליליטר הבינוני גלוקוז הנמוך ולשמור על התאים במדיום הזה במשך 3 ימים (עד יום 13).
2. ביום 13, לחזור תאים למדיום RPMI / B27 (עם אינסולין).
3. לחלופין, replate cardiomyocytes לפני הסיבוב של רעב גלוקוז השני כדי לעזור לשחרר הלא cardiomyocytes מצלחת התרבות, המאפשר לניתוק קל של אי-cardiomyocytes במהלך רעב גלוקוז.
   1. ביום 13, בינוני לשאוב, לשטוף פעם אחת עם PBS, ולנתק את התאים לתאים בודדים באמצעות 500 μl של אנזים התנערות תא במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. באופן ספציפי, לאחר 5 דקות של טיפול אנזים, להשתמש פיפטה 1000 μl לנתק ידני cardiomyocytes מהצלחת 6-היטב על ידי משיכת שוב ושוב את אנזים התנערות תא וריסוס נגדו cardiomyomonolayer cyte. עד 30 חזרות pipetting ייתכן שיהיה צורך לנתק את cardiomyocytes לתוך תאים בודדים.
   2. לאחר התאים הם ניתקו והם בצורה חדה-תאית, לאסוף את כל התאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא 5 מיליליטר של מדיום RPMI / B27 עם אינסולין כדי לדלל את אנזים התנערות תא צנטריפוגות למשך 4 דקות ב 200 x g. לשאוב ולזרוק supernatant.
   3. להשעות מחדש את התאים עם מדיום 2 מיליליטר RPMI / B27 וצלחת על צלחת 6-גם מצופה ECMS חדשה. בדרך כלל, confluency גבוה יותר של שריר לב מסייע בהישרדות תא במהלך replating. מטרת replate 2 מיליון תאים לכל צלחת 6-גם חדשה להישרדות אופטימלית במהלך replating.
4. ביום 14, לשנות את המדיום חזרה ל -2 מיליליטר של מדיום גלוקוז הנמוך למעגל קיפוח גלוקוז שני. תרבות התאים במדינת גלוקוז נמוכה זה במשך 3 ימים נוספים. רוב הלא-cardiomyocytes ימותו במצב התרבות הנמוך של גלוקוז זה.
5. ביום 17 ב, לשנות הבינוני עד 2 מיליליטר של Rבינוני PMI / B27 עם אינסולין. התאים הנותרים יהיו cardiomyocytes הנקי במיוחד. cardiomyocytes אלה יכול לשמש לניתוח ביטוי גנים, הקרנת סמים, ניתוח חילוף חומרים, ומבחנים במורד הזרם שונים אחרים.

תוצאות

השינויים מורפולוגיים במהלך התמיינות hiPSC.

HiPSC התרבותי בצלחות מזין ללא גדל מושבות שטוחות כמו, דו-ממדיות. לאחר שהגיע סביב 85% confluency, טופלו hiPSCs עם 6 מיקרומטר CHIR לבידול (איור 1 א). כמויות ניכרות של מוות של תאים, תופעה נורמלית ושכיחה, נצפו לאחר 24 שעות של טיפול CHIR. לאחר יומיים של טיפול CHIR, hiPSCs המשיך להבחין כלפי גורל mesodermal. בהשוואה לתאים במושבות hiPSC, גודל תא ...

דיון

קבלת כמות גדולה של שריר לב הנגזר hiPSC נקי במיוחד היא קריטית למחקר לב בסיסי, כמו גם יישומים קליניים וtranslational. פרוטוקולי בידול לב עברו שיפורים עצומים בשנים האחרונות, מעבר משיטות המבוסס על גוף embryoid ניצול צמיחת קרדיוגני גורמים ^2, למטריצת שיטות כריך ^12, ולבסוף לשיטות המבוססות monolayer-מווסת מולקולה קטנות ^ו5. מהפרוטוקולים האמורים, הפרוטוקול המתואר כאן מוצג הגבוה ביותר ואת יעילות בידול לב לשחזור ביותר לשורות תאי hiPSC שונות על ידי ויסות איתות ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מטריג'ל (9-12 מ"ג/מ"ל)	BD Biosciences	354277
מדיה RPMI	Invitrogen	11835055
ללא גלוקוז	מדיה RPMI Invitrogen	11879-020
B27 מינוס אינסולין	Invitrogen	A1895601
תוסף B27 (עם אינסולין)	Invitrogen	17504-044
אנטיביוטיקה עט-סטרפטוקוקוס	Invitrogen	15140122
סרום בקר עוברי	BenchMark	100-106
DMSO	Sigma	D-2650
מעכב ROCK Y-27632	EMD Millipore	688000
CHIR99021	Thermo Fisher	508306
IWR1	Sigma	I0161
EDTA	Invitrogen	15575-020
Accutase	Millipore	SCR005
מרים תאים	פישר	08-100-240
קריוביאלי	(צינורות NUNC)	375418
TrypLE Select אנזים	Invitrogen	12563-011

פישר