אנו מציגים שיטה לניתוח אלקטרורטינוגרפי (ERG) של זחלי דג הזברה תוך שימוש בטכניקות מיקרומניפולציה ואלקטרורטינוגרפיה. זוהי שיטה פשוטה ופשוטה לבדיקת תפקוד חזותי של זחלי דג הזברה in vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים
במאמר זה
סיכום
תקציר
Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו לקביעת תפקוד רשתית. באמצעות המיקום של האלקטרודה על פני השטח של הקרנית, פעילות חשמלית שנוצרה בתגובה לאור ניתן למדוד ומשמש להערכת הפעילות של תאים ברשתית in vivo. כתב יד זה מתאר את השימוש של ERG למדוד תפקוד ראייה של דג הזברה. דג הזברה ארוכה כבר נוצל כמודל לפיתוח חוליות בשל הקלות של דיכוי גן על ידי oligonucleotides morpholino ומניפולציה תרופתית. ב5-10 DPF, רק קונוסים הם פונקציונליים ברשתית הזחל. לכן, דג הזברה, בניגוד לבעלי חיים אחרים, היא מערכת מודל עוצמה לחקר תפקוד הראייה קונוס in vivo. פרוטוקול זה משתמש הרדמה סטנדרטית, מיקרומניפולציה ופרוטוקולי stereomicroscopy כי הם נפוצים במעבדות המבצעות מחקר דג הזברה. שיטות שתוארו לעשות שימוש בEQ אלקטרופיזיולוגיה הסטנדרטיuipment ומצלמה אור נמוך כדי להנחות את המיקום של microelectrode ההקלטה על גבי קרנית הזחל. לבסוף, אנו מדגימים כיצד ממריץ / מקליט ERG זמין מסחרי שנועד במקור לשימוש עם עכברים יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם דג הזברה. ERG של דג הזברה זחל מספק שיטה מצוינת שלו מנסה לאמוד פונקציה חזותית חרוט בבעלי חיים ששונו על ידי הזרקת oligonucleotide morpholino כמו גם בשיטות של הנדסה גנטית חדשות יותר כגון אצבע nucleases (ZFNs) האבץ, תמלול Activator-כמו מפעיל nucleases (TALENs), ו חזרות התקבצו באופן קבוע Interspaced הקצר Palindromic (CRISPR) / Cas9, אשר כולם בצורה ניכרת את היעילות והיעילות של גן המיקוד בדג זברה. בנוסף, אנו מנצלים את היכולת של סוכנים תרופתיים לחדור זחלי דג הזברה להעריך את המרכיבים המולקולריים התורמים לphotoresponse. פרוטוקול זה מתאר התקנה שיכולה להיות משונית ושימוש על ידי חוקריםעם מטרות ניסוי שונות.
מבוא
Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו שכבר נעשה שימוש נרחב במרפאת לקביעת התפקוד של הרשתית בבני אדם. הפעילות החשמלית בתגובה לגירוי אור נמדדת על ידי הנחת אלקטרודות הקלטה על פני השטח החיצוניים של הקרנית. המאפיינים של הפרדיגמה הגירוי וצורת גל התגובה להגדיר את תאי העצב ברשתית תורמים לתגובה. שיטה זו הותאמה לשימוש עם מספר המודלים של בעלי חיים, כולל עכברים ודג זברה. יש תגובת ERG חוליות הטיפוסית ארבעה מרכיבים עיקריים: א-גל, שהוא פוטנציאל קרנית-שלילית הנגזר מפעילות תאי קולטי אור; ב-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית הנגזר מON תאים דו קוטביים; ד-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית להתפרש כפעילות של התאים דו קוטביים OFF; וג-הגל, אשר מתרחש כמה ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אחזקת בעלי חיים ופרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי ועדות הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל, ולעמוד בכל הדרישות של משרד NIH של בעלי חיים במעבדת רווחה והאגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים בינלאומיים.
הערה: פרוטוקולים כדי להשיג זחלים לניתוח ERG, שפורסם לגידול דג הזברה סטנדרטי ותחזוקה הועסקו 18. זחלים שהושגו באמצעות רבייה טבעית, ושוכנו בשעה 14 מחזור אור / חושך 10 שעות. פרוטוקול זה כבר מותאם לזחלים ב5-7 ימים לאחר הפריה (DPF), אבל יכול להתבצע באופן אידיאלי על דגים מבוגרים עם שינויים קטנים להליך. כאן, להשתמש בלחץ TL של זחלי דג הזברה wild-type בשעה 5 DPF.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בדרך כלל, ERGs נרשמים מזחלי דג הזברה בשעה 5 DPF, מאז מספר מחקרים שפורסמו הקלטות ERG בשלב זה 9, 16,20. תגובות הזחל נמדדו בתנאים כהים מותאם ללא תאורת רקע באמצעות גירוי msec 20 אור LED הלבן. אנו מנוצלים מערכת זמינה מסחרי בהיקף של ERG ממריץ Ganzfeld אור ובקר / צורב במחשב. ממריץ משתמש אפנון רוחב מערכת פיקוח הדוק דופק קניינית (PWM) כדי לשלוט בעוצמת ההארה של שני הרקע ופלאש גירוי. תגובות נרשמו באמצעות מגבר ההפרש במלואו קניינית עם מסנן אנטי-aliasing חומרת נהיגה אנלוגי 16-bit ממי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה הליך פשוט להקלטות ERG של דג הזברה זחל מפורט. הליך זה מאפשר לassay מהיר והמקיף של function.There החזותי מספר שלבים קריטיים בכל ההליך שצריך להיות כל הזמן בראש. זחלי דג הזברה צריכים להיות בריאים לפני הניסוי למניעת מוות בטיפולים תרופתיים פוטנציאליים ולהבטיח פרנסה ממושכת במהלך הקלטות ERG. בנוסף, חשוב שהזחלים מנוצלים בניסויים הם באופן הדוק באותו גיל. זאת בשל ההתפתחות המהירה של הרשתית (כלומר, פיתוח ההפרש של תת קונוס) וגם המורפולוגיה והפיסיולוגיה הכוללות של הזחלים. ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
אנו מודים לחברי מתקן החקלאות הימית של דג הזברה של UNC על תחזוקת דג הזברה. ברצוננו גם להודות ל-Diagnosys, LLC על הסיוע בהקמת מנגנון ה-ERG. תודה נוספת לד"ר פורשיה מקוי ולמעבדה של ד"ר בן פילפוט על הסיוע בשיטות אלקטרופיזיולוגיות. ברצוננו גם להודות לליזי גריפיתס על האיור שלה של דג זברה זחל. עבודה זו נתמכה על ידי פרסי המכונים הלאומיים לבריאות F32 EY022279 (ל-J.D.C) ו-R21 EY019758 (ל-E.R.W).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כלוב פאראדיי | 80/20 בע"מ | מותאם | אישית אלומיניום מעוצב בהתאמה אישית "סט זקוף תעשייתי" למסגרת כלוב |
| ספוג PVA | אמזון | B000ZOWG1C מספק פלטפורמה רכה ולחה להצבת זחלי דג הזברה | |
| 150 מ"ל מערכות סינון סטריליות | קורנינג | 431154 | פתרונות סינון למניעת מפרקים קטנים לחסום מיקרופיפטות |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | מערכת אלקטרופיזיולוגיה מודולרית המסוגלת לייצר גירויים חזותיים לכל ממריץ והקלטה דיגיטלית וניתוח תגובות באמצעות תוכנה קניינית, מידע נוסף בכתובת |
| http://www.diagnosysllc.com Colordome | Diagnosys, LLC | מגע ממריץ אור עם RGB LED ומקורות אור קסנון עבור Ganzfeld ERG, מידע נוסף ב | |
| http://www.diagnosysllc.com Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | החזקה ומיקום של מיקרואלקטרודת ההקלטה |
| מעמד טבעת מגנטית | Drummond | 3-000-025-MB | החזקה ומיקום של המצלמה ואלקטרודת ההתייחסות |
| הרחבות עופרת | Grass Technologies | F-LX | כבלי עופרת רזרביים נקבה לזכר 1.5 מ"מ לחיבור אלקטרודות |
| סיכה זכר לנקבה טכנולוגיות דשא | מתאם SAFELEADDF-215/10 | חיבור פינים 2 מ"מ ל-1.5 פיני ראש מיטה | |
| מסגרת מסך חלון (מתכת) וספליין | Lowes או הום דיפו | שונים | לחיבור רשת נחושת למסגרת כלוב פאראדיי |
| מסנני Steriflip 50 מ"ל | Millipore | SCGP00525 | פתרונות סינון למניעת חסימת מפרקים קטנים |
| מתאם BNC | Monoprice | 4127 | חיבור מצלמה לכבל BNC |
| כבל BNC | Monoprice | 626 | חיבור מצלמה למתאם וידאו |
| עדשת מצלמה | Navitar | 1582232 | הדמיית מיקום המיקרואלקטרודת ההקלטה על קרנית הזחל |
| מצמד מצלמה | Navitar | 1501149 | הדמיית מיקום המיקרואלקטרודת ההקלטה על קרנית הזחל |
| Luna BNC to VGA + HDMI | ממיר Sewell | SW-29297-PRO | מתאם BNC ל-VGA המאפשר להקרין תמונת מצלמה על צג מחשב |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 אגוניסט, חוסם גל b המאפשר ניתוח של פוטנציאל קולטן מסת החרוט |
| המבודד זכוכית בורוסיליקט | Sutter | BF-150-86-10 | זכוכית בורוסיליקט מלוטשת אש (טמפרטורת מטלינג = 821° ג) עם נימה ומידות של 1.5 מ"מ x 0.86 מ"מ (קוטר חיצוני לפי קוטר פנימי) |
| P97 חולץ בוער/חום | Sutter | P97 | למשיכת מיקרופיפטות זכוכית |
| גיליון סורבוטן | Thorlabs | SB12A | פולימר אורטן ויסקו-אלסטי סינטטי, המונח מתחת לתושבות בידוד פסיביות ופלטפורמת ERG לספיגת זעזועים ומניעת החלקה, ניתן לחתוך לגודל |
| לוח לחם | Thorlabs | B2436F | פלטת בידוד רעידות עבור ממריץ ERG ודגימת |
| דג זברהתושבות בידוד פסיביות | Thorlabs | PWA074 | מספק בידוד רעידות ללוח אב-טיפוס |
| רשת נחושת | TWP | 022X022C0150W36T | כדי לרפד משאבת פיפטות כלוב פאראדיי |
| VWR | 53502-233 | משמש עם פיפטות פסטר להעברה בזהירות של זחלי דג זברה | |
| פיפטות פסטר | VWR | 14672-608 | משמש עם משאבת פיפטה להעברה זהירה של זחלי דג הזברה |
| מצלמה | Watec | WAT-902B | הדמיה של מיקום המיקרואלקטרודה המקליט על קרנית הזחל |
| טריקאין (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | חומר הרדמה בדרגה פרמצבטית, |
| מיקרו-פיל | WPI | MF28G-5 | מילוי מחזיק מיקרואלקטרודה ומחזיק מיקרואלקטרודה זכוכית מיקרואלקטרודה |
| WPI | MEH2SW15 | מחזיק מיקרו-אלקטרודה מזכוכית, מתחבר לציוד ERG | |
| אלקטרודה התייחסות | WPI | DRIREF-5SH | נתק בזהירות את הסנטימטר האחרון של המעטפת כדי לנקז אלקטרוליט ולחשוף אלקטרודת גלולה Ag/AgCl מסונטרת |
| אלקטרודת ייחוס (אלטרנטיבית) | WPI | EP1 | חלופה ל-DRIREF-5SH. אלקטרודה Ag/AgCl שיש לחווט/להלחם לחיבור עופרת |
| כבל רעש נמוך למחזיק מיקרואלקטרודה | WPI | 13620 | חיבור מחזיק מיקרו-אלקטרודה הקלטה למתאם/ראש המיטה |
מקורות
- Dowling, J. E. The retina: an approachable part of the brain. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
