מאמר שיטה

7.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52672

⸱

30 ביוני 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine and New Jersey Medical School Cancer Center, Rutgers New Jersey Medical School

במאמר זה

סיכום

פיתחנו מודל מבחנה של תרדמה במח העצם עבור תאי סרטן שד רגישים לאסטרוגן. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש במודל לחקר הביולוגיה המולקולרית והתאית של תרדמה וליצירת השערות לבדיקה עוקבת in vivo.

תקציר

חקר תרדמת סרטן השד במח העצם הוא משימה קשה במיוחד בשל מורכבות האינטראקציות של תאים רדומים עם המיקרו-סביבה שלהם, נדירותם והעודף העצום של תאים המטופויאטיים. לשם כך, פיתחנו מודל קלונוגני דו-ממדי במבחנה של תרדמה של תאי סרטן שד רגישים לאסטרוגן במח העצם. המודל מורכב מכמה מרכיבי מפתח הנחוצים לתרדמה. אלה כוללים 1) שימוש בתאי סרטן שד רגישים לאסטרוגן, שהם הסוג שסביר שיישאר רדום לתקופות ממושכות, 2) דגירה של תאים בצפיפות קלונוגנית, כאשר האינטראקציה המבנית של כל תא היא בעיקר עם התשתית, 3) פיברונקטין, מרכיב מבני מרכזי של המח ו -4) FGF-2, גורם גדילה המסונתז בשפע על ידי תאי סטרומה של מח העצם ומופקד בכבדות במטריצה החוץ-תאית. תאים שהודגרו עם FGF-2 יוצרים שיבוטים רדומים לאחר 6 ימים, המורכבים מ-12 תאים או פחות בעלי מראה שטוח מובהק, גדולים משמעותית ומפוזרים יותר מאשר תאים גדלים ויש להם יחס ציטופלזמה לגרעין גדול. לעומת זאת, תאים שהודגרו ללא FGF-2 יוצרים בעיקר מושבות גדלות המורכבות מ->30 תאים קטנים יחסית. הפרעות של המערכת עם נוגדנים, מעכבים, פפטידים או חומצות גרעין ביום השלישי לאחר הדגירה יכולות להשפיע באופן משמעותי על היבטים פנוטיפיים ומולקולריים שונים של התאים הרדומים לאחר 6 ימים וניתן להשתמש בהן כדי להעריך את התפקידים של מולקולות מקומיות או תוך-תאיות, גורמים או מסלולי איתות על המצב הרדום או ההישרדות של תאים רדומים. תוך הכרה באופי המבחנה של הבדיקה, היא יכולה לתפקד ככלי שימושי ביותר לאיסוף מידע משמעותי על המנגנונים המולקולריים הדרושים להקמה והישרדות של תאים רדומים. ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי ליצור השערות לבדיקה במודלים in vivo.

מבוא

תאי סרטן שד גרורות למוח העצם לפני שהמחלה היא 1 לזיהוי, ברגע שגידולים קטנים לפתח כלי דם 2,3. התהליך גרורתי הוא מהיר אבל לא יעיל. תאים להיכנס לכלי הדם החדשים במהירות, במיליון ליום 4 אבל כמה לשרוד את המסע לאיברים מרוחקים 5. עם זאת, כמה micrometastases לשרוד בעצמות ובניתן למצוא כתאים בודדים או גושי תא קטנים בaspirates מח עצם של חולים שאובחנו לאחרונה 1. תאים אלה להתנגד כימותרפיה אדג'ובנט, המנוהלת למטרה מאוד של חיסולם 6. התנגדות זו היא ניחן, באופן משמעותי, על ידי הישרדות איתות ביוזמת אינטראקציות עם מייקרו-סביבת מח עצם 7,8. ניתן למצוא Micrometastases בכשליש מהנשים עם סרטן השד מקומי ומייצג מחוון עצמאי של הישרדות כאשר נותח על ידי ניתוח שונה 9. microme חלקtastases הוא צמיחה יזם, אבל דפוסי הישנות תלויים בסוג התא. חולים עם סרטן השד שלילי משולש נוטים לחזור על עצמה בין 1 עד 4 שנים, המצביעה על שליטה על עניי המצב הרדום. סוגי תאים אחרים, כוללים ER / PR + תאים, יכולים להישאר רדומים במשך עד 20 שנים, עם קצב קבוע, מתמשך של הישנות 10. בעוד הבדלים בחתימות ביטוי גני תרדמת בין ER + וקווי ER- שד תא וגידולים משקפים פוטנציאל תרדמת שונה 11, אינטראקציות עם סטרומה מח עצם עשויים לייצג תרומה משמעותית לתרדמת.

המחקר של תרדמת in vivo הוא קשה במיוחד כי micrometastases הם נדירים ועלו במספרם על ידי תאי hematopoietic על ידי יותר מ 10 6 -fold. לפיכך, מודלים רלוונטיים חייבים להיות שנוצרו המספקים נתונים במבחנה שיכול להציע מנגנונים וליצור השערות הניתנות לבדיקת in vivo. מספר דגמי תרדמת, כולל מתמטי עבור מערךמודלים מתמטיים 12,13, במבחנה מודלים 7,8,14,15, המודלים xenograft in vivo 16, שילובים של במבחנה ומודלי xenograft 17,18 ומודלי גידול וגרורים ספונטניים 19, הניבו כמה תובנות תאים סרטניים תרדמת 20 . בכל אחד מהמודלים האלה המגבלות שלהם והם בעצמם בעיקר שימושיים ליצירת השערות בנוגע לאיתות ואינטראקציות ששולטות תרדמת להיבדק במודלים יותר מבחינה ביולוגית מולקולריות רלוונטיים.

עם המטרה הכללית של הגדרת המנגנונים המולקולריים של תרדמת, אינטראקציות עם מייקרו-הסביבה שגורמת לעצירת מחזור, redifferentiation והתנגדות ומנגנונים טיפוליים שתגרומנה לחזרה בER + תאים, שפיתחנו מודל במבחנה שמספקת נבחר אלמנטים רלוונטיים של מייקרו-סביבת סטרומה 7. מודל זה, תוך דליל יחסית בcomponents, הוא מספיק חזק כדי לאפשר לחוקרים להפיק מנגנונים מולקולריים ספציפיים המשפיעים על פונקציות משמעותיות של תרדמת. ניסויים אלה ליצור השערות שניתן לבדוק ישירות in vivo. המודל מסתמך על כמה אלמנטים מרכזיים שהפגנו להיות רלוונטי בתרדמת. הם כוללים את השימוש בתאי סרטן השד תלוי באסטרוגן, התרבות של תאים בצפיפות clonogenic בו האינטראקציה שלהם היא בעיקר בתשתית ורכיבים מסיסים של המדיום, תשתית פיברונקטין ואת הנוכחות של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (FGF-2) בטווח הבינוני.

אנו מאופיינים מנגנונים ששולטים במערכת במבחנה, כולל האינדוקציה של עצירת מחזור התא על ידי FGF-2 21, בתיווך באמצעות 22 TGFβ, הישרדות איתות באמצעות PI3 קינאז 7,8 וERK 8 ובידול morphogenic לפנוטיפ אפיתל, שהיה תלוי ב איון RhoA, integrin45; 5β1 upregulation וקשירה של פיברונקטין סטרומה הישרדות 7,15 (איור 1). האפקטים במבחנה מחזור תא של FGF-2 על MCF-7 תאים מתחילים בריכוזים יומן אחד לפחות מתחת ל -10 ננוגרם / מיליליטר 21,23. הרציונל היה מבוסס על השליטה הזמנית של FGF-2 ביטוי שלטון המורפוגנזה החלב ductal, הרחבה מחזורית ומיתון במספר מערכות יונקים 24-27. אנחנו הוכחנו כי FGF-2 גורם בידול, כוללים המורפוגנזה ductal בתרבות 3D 28, ושFGF-2 ביטוי, בדרך כלל, איבד עם שינוי ממאיר של גידולים אנושיים 29. הביטוי של FGR1 נותר על כנן בקרצינומה של שד שהשתתף בסקר 29 וMCF-7 תאים ממשיכים לבטא את כל 4 קולטני FGF 30. בהקשר של תרדמת, FGF-2 מיוצאים על ידי ושהופקדו בכבדות על סטרומה מח עצם 31,32 שבו מתפקדת בשימור תאי גזע hematopoietic 33. אנו demonstrated שFGF-2 גורם למצב רדום בתאי ER + סרטן השד בתרבית על substrata פיברונקטין, גם בשפע במוח, שם הוא גורם לבידול morphogenic 7. במודל, תאי סרטן השד הם גידול עכבות, להשבית Rho באמצעות גרף RhoGap, redifferentiate לפנוטיפ אפיתל מחדש מפורש lost α5β1 integrins עם התקדמות ממארת. הם נקשרים פיברונקטין דרך α5β1 integrin ולהפעיל הישרדות איתות שהופך אותם עמידים לטיפול ציטוטוקסיות 7,8,15 (איור 1). עיכוב של GTPases כיתת Rho כבר הוכיח בעבר כדי לגרום פנוטיפ רדום 34.

כאן אנו מתארים את הנהלים הספציפיים שיאפשר לחוקרים לקבוע את המודל ולחקור מנגנונים מולקולריים ותאיים ספציפיים המסדירים תרדמת של תאי ER + סרטן השד. בניסויים שהוצגו כאן כדי להמחיש את השימוש במודל, אנו ממוקדים מסלול PI3K (איור 1) עם מעכב Akt ומעכב PI3K וכל בני משפחת Rho (איור 1) עם מעכב פאן-רו וRho קינאז מעכב (סלע).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. Assay clonogenic

  1. הכן השעיות תא בודדות של שורות תאי סרטן השד תלוי באסטרוגן תאי MCF-7 וT47D באמצעות הצעדים המפורטים להלן
    1. לשאוב את מדיום התרבות (DMEM / 10% חום בסרום / גלוטמין מומת עגל עוברי ועט / סטרפטוקוקוס) מצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים שאינה מחוברים יותר מ- 50% עם MCF-7 או תאי T-47D. לשטוף עם PBS. דגירה עם טריפסין 0.25% / 2.21 mM EDTA מומס בגלוקוז הגבוהה DMEM על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-4 דקות.
    2. בדקו תאים במרווחי 1 דקות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב כדי להבטיח הפצת תא בודדת. Resuspend תאים עם טפטפת 2 מיליליטר ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשבש קשר תאי תאים כדי להשיג מעמד תא כמעט בלתי משתנה, אחת.
    3. תמשיך לדגור תאים בטריפסין על 37 מעלות צלזיוס במשך עד 4 דק 'אם אתה רואה גושים של תאים רק לאחר 2 דקות של דגירה. אין להשתמש בתאים אלה ללימודי clonogenic אם הם יישארו חסיד לדוארבגלל שגיאה יושקו אח אחר לאחר 4 דקות של trypsinization בתשואת מספר המושבה.
      הערה: אם תאים בכבדות, מספר מושבות הוקמו ישקף את המוצר של פחות תאים מהמספר מודגרות. אם תאי trypsinized מוגזמים, פוטנציאל clonogenic עשוי להצטמצם.
    4. הכן השעיה תא בודדת של 1,500 תאים / בינוני תרבות מיליליטר במשך 24 צלחות גם, או, פחות (+ 500 מיליליטר / תאים, בהתאם לסוג התא או מספר מעבר), על ידי דילולים סדרתי בצינור ראשי אחד המכילים את כל הנפח הדרוש ל כל המשתנים בניסוי.
      הערה: המטרה היא צפיפות תא סופית של 800 תאים / 2 סנטימטר (טווח של כ -500 עד 1,100 תאים / 2 סנטימטר). המטרה היא להניב כ 100 + 50 מושבות, המאפשרת ספירה קלה יחסית, מונעת צפיפות ומאפשרת מושבות מספיק כדי לגרום להבדלים סטטיסטיים משמעותיים כאשר מושבות עלו או ירד בperturba הניסיונימשא.
  2. תאי דגירה בצפיפות clonogenic שימוש צעדים המפורטים להלן
    1. דגירה תאים בבארות ארבע פעמים ב -24 צלחות מצופים פיברונקטין גם בצפיפות clonogenic של 1500 תאים / גם מצינור השעיה תא בודד אדון של 1,500 תאים / מיליליטר. Triturate הבינוני המכילים תאים עם טפטפת 5 מיליליטר על ידי ציור עד 3 מיליליטר וניפוק בינוני 1 מיליליטר בכל אחד מ2 בארות.
      הערה: צלחות מצופה פיברונקטין יש לרכוש מראש מצופים מספק מסחרי. צלחות ציפוי חיצוניים של איכות מבוקרת, תוצאות תהליך אוטומטיות במשטח אחיד שלא התאימו לassay זה.
    2. מערבבים את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה עם טפטפת 5 מיליליטר, להכין 3 מיליליטר של השעיה תא ולמלא 2 בארות עם 1 מיליליטר כל אחד. מלא רק 2 בארות בכל זמן מפיפטה אחד. להחזיר את הנפח שנותר בפיפטה ההשעיה התא בצינור הראשי, תאים גלולים שוב על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהכין עוד 3 מיליליטר כדי למלא עוד 2 welLS עם 1 מיליליטר כל אחד.
      הערה: ערבוב רציף של הצינור הראשי הוא הכרחית, כי תאים יהיו ברציפות משקעים. הכנת נפח מספיק כדי למלא רק 2 בארות יש צורך להוסיף מספרים סלולריים דומים זה לזה היטב, כי תאים משקעים, כמו גם בפיפטה.
    3. לעבוד במהירות כדי להפיץ כמויות הגדולות של תאים כי תאים המאפשרים לשבת בהשעיה בטמפרטורת חדר וריכוז CO 2 יהיה לווסת (התצפיות לא פורסמו) פוטנציאל clonogenic.
    4. לייעל את הפריסה המרחבית של תאים במהלך הפעולה של pipetting אותם לבארות למבחני מושבה. לעשות זאת על ידי pipetting ההשעיה המכילה ריכוז התא הסופי לאמצע גם לאט. אל תחשוף את הצלחת כדי לקדם את התנועה לפני תאים ליישב לתחתית. לא לערבל את הצלחת כי ערבוב החוזר ביעילות צנטריפוגה התאים להיקף של צפיפויות גבוהות תא גם יצירת ומושבות ומחוברות לאינספור בשעה 6 ימים.
      הערה: אין לערבב אלא אם יש צורך, מאחר שזו פחות רצויה מאשר ללא ערבוב בכל לאחר החדרת הנפח עם התאים בתרחיף. אם יש צורך לערבב תאים, עושה זאת על ידי העברת הצלחת קדימה ואחורה בכיוונים ניצבת בזמן שהוא נח על משטח שטוח.
    5. דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ללא שינוי תקשורת במשך 6 ימים. המספר הקטן של תאים ובלאחר 6 ימים לא ישפיע באופן משמעותי את ההרכב התזונתי או ציטוקינים ולא את ה- pH של המדיום המקורי.
    6. לעצב את הקורס של assay הזמן כדלקמן: דגירה תאים בsubstrata פיברונקטין מצופה ביום 1. החלפה הקיימת בינוני עם 1 מיליליטר בינוני טרי או בינוני טרי המכיל FGF-2 10 / מיליליטר ng ביום 0. תאי כתם ביום 6 להלן ב1.4). לנהל כל הפרעות ניסיוניות ביום 3, כלהלן 1.3).
  3. הפרעות ניסויי הגדרה מולקולרית איתות או הדבקה מולקולות
    1. ביום 3, להוסיף 10056; L של תמיסה המכילה 10x של הריכוז המיועד הסופי של הסוכן המדאיג למדיום מיליליטר 1 בבארות. אל תערבב. המשך דגירה התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל3 ימים נוספים.
      הערה: מביך סוכנים יכול לכלול מגוון של מעכבים וסוכני חסימה של מולקולות דבקות, קולטנים או חלבוני משטח אחרים, מעכבים של מסלולי איתות תאיים, מולקולות, גורמים, קו-פקטורים או חלבונים מבניים, שעשויה לשחק תפקיד בתמיכה במצב הרדום.
    2. מושבות כתם על יום 6, כדלקמן.
  4. מושבות כתם
    1. תאי כתם לאחר 6 ימים בתרבות עם 0.1% סגולים קריסטל טרי ב 2% אתנול / 10 borate נתרן מ"מ (pH 9.0) פתרון. תקשורת לשאוב ולהוסיף פתרון סגול גביש מיליליטר לכל אחד גם עבור 20 דקות.
    2. לשטוף צלחות ידי שיקוע שלהם עם הפתחים גם כלפי מטה בזווית חדה לדלי קרח עולה על גדותיו עם ברז פועל ברציפותמים בכיור. הטה את הצלחת לזווית אופקית פעם מתחת למים, גם פתיחה מטה, ולאחר מכן להטות חזרה לזווית חדה בעת הסרת בתנועה זורמת עדינה אחד.
    3. חזור על הטבילה 2 או 3 פעמים עד שהמים בחלק התחתון של הבארות הוא כבר לא כחולים. שוטף נמרץ עשוי להסיר תאים או מושבות כי הם פחות חסיד בשל התערבות ניסיונית, והוסיף באופן משמעותי לשגיאה בספירה ונתונים.
    4. צלחות יבשים לילה על ידי הצבת אותם במהופך על מגבות על גבי הספסל הסמוך לכיסויי שהכותרת המתאימים שלהם.
  5. ספירת מושבות
    1. לספור את מספר המושבות גדלו ורדומות בכל הטוב אחרי 6 ימים של דגירה, צביעה וייבוש. ספירת מושבות בצורה אופטימלית ב40X ההגדלה במיקרוסקופ לעומת שלב הפוך. ספירת מושבות של> 30 תאים כגדלו ומושבות של 12 או פחות תאים, עם המראה המורפולוגי של גודל גדול מאוד בהשוואה לexpa גדל תאים, גדולציטופלסמה nded עם ציטופלסמה הגדולה לגרעין יחסים, שמוצגים באיור 1 7,15.
      הערה: אשכולות של 13-29 תאים בדרך כלל לא נספרו כמו שהם לא מאוד תכופים במבחני תרדמת פשוטים. הם ניתן לספור אם הפרעות להעביר את פוטנציאל הצמיחה של שני תאי גידול או רדומים. אז תוצאות אלו צריכה להיות מתואמות עם משמעות ביולוגית.

2. clonogenic דגירה לImmunofluorescence לימודים

  1. התאם מספרים סלולריים לכ 7,500-8,000 תאים / גם ב 6 צלחות גם, למתאימים לתא מספרים / שטח דומה לניסויים גם 24.
  2. הנח עגול,, להחליק לכסות מצופה פיברונקטין סטרילי לכל בסיס גם של 6 צלחות גם למחקרי הדמיה לפני בנוסף תא. תאי Pipet ב 3 מיליליטר כרכים לתוך זה גם 2 בארות בכל פעם בריכוזים התוו, כפי שתואר עבור ניסויי clonogenic לעיל ב1.2).
  3. דגירה תאיםבמשך 6 ימים, כאמור לעיל וב1.2.4 1.2.5. להוסיף גורמים מדאיגים ביום 3 ב10x ריכוזים בכרכי μl 300, כפי שמתואר בנהלי assay המושבה ב1.3).
  4. תאי כתם על יום 6 עם נוגדנים לתא מולקולות הדבקה כגון α4 integrins, α5, α6, β1, β3, למשל, מולקולות מורכבות הידבקות מוקד FAK, paxillin וvinculin, למשל, חלבונים מעורבים בתנועתיות כגון α-טובולין, לדוגמא, חברי מסלול איתות כגון phospho-AKT, phospho-ERK, phospho-p38, phospho-JNK, למשל, או כל חלבון אחר שהוא היעד של חקירה לתפקידה בתרדמת, תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית עבור ישיר או עקיף מכתים immunofluorescence.
    1. הסר שקופיות עם יום מלקחיים 6. תיקון באצטון / מתנול 1: 1 ב -20 ° C במשך 20 דקות ואוויר יבש. מקבע חלופי, כגון paraformaldehyde, ניתן להשתמש, במידת צורך. תאי Permeabilize עם 0.1% X-100, נתרן ציטרט 0.1% טריטון לו 2 דקותאו זיהוי של אנטיגנים תאיים. לשטוף את התאים עם PBS.
    2. עבור מכתים immunofluorecence עקיף, שקופיות בלוק עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר עם BSA 5% או 10% בסרום preimmune מהמינים שבנוגדנים משני נוצרו.
    3. דגירה הלילה ב 4 ° C עם נוגדנים ראשוניים לתא מולקולות הדבקה, מולקולות מורכבות מוקדי, איתות חברי מסלול או כל חלבון אחר שהוא היעד של חקירה לתפקידה בתרדמת בדילול לדילולים ספציפיים מומלצים על ידי היצרן בPBS 0.1% Triton X -100.
    4. לשטוף 3 פעמים עם PBS. דגירה התלושים לכסות עם נוגדני fluorophor מצומדות- בטמפרטורת חדר למשך שעה 2. כדוגמא, אלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר IgG נוגדנים חמורים יכולים לשמש כדי לזהות נוגדנים חד שבטיים עיקריים עכברי. הר coverslips צד תא על שקופיות זכוכית באמצעות סוכן antifade עם DAPI. חותם את היקפה עם לק.
    5. לimmunofluorescence הישיר, לבצע את BSAחסימה כאמור ב2.4.2), דגירה עם נוגדן ראשוני fluorophor מצומדות- הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים עם PBS. דגירה השקופיות עם סוכן antifade וDAPI וחותם עם לק.
    6. מגשי שקופיות מכסים ברדיד האלומיניום ולאחסן ב 4 ° C להדמיה וצילום בכל עת עד כמה שבועות לאחר מכן. תאי צפייה וצילום באמצעות כל מערכות הדמיה מיקרוסקופיות הקרינה מצוידת במצלמה ב1,000x הגדלה.
    7. עבור מכתים אקטין סיבי, שקופיות בלוק ב 1% אלבומין בסרום שור (BSA) למשך 30 דקות ודגירה בBODIPY FL-Phallacidin (ירוק) או phalloidin Rhodamine (אדום) בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. הוסף סוכן antifade ולאטום כאמור לעיל.

3. clonogenic דגירה למחקרים מולקולריים

  1. כתמים מערביים
    1. דגירה ER + תאי סרטן שד MCF-7 או T47D בצפיפויות clonogenic של / 100 מ"מ צלחת 20,000 תאים / 60 צלחת מ"מ ו50,000 תאים בfibronecצלחות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 מצופי פח.
    2. דגירה תאים בצפיפויות גבוהות מעט יותר של 75,000 תאים / 100 מ"מ צלחת למחקרים מולקולריים הדורשים כמויות מ"ג לחלבון מlysates. השתמש עד עשר צלחות לכל נקודה ניסיונית כדי לאסוף מספיק חלבון ללימודים מולקולריים באמצעות כתמים מערביים או לבידוד RNA לכתמי צפון.
    3. טעינת ג'ל על בסיס מספר התא היא תוספת הכרחית להשוואת ביטוי חלבון בתאי גידול ורדום בגדלים שונים בהרבה. איסוף תאים על ידי trypsinizing ולספור aliquot בhemocytometer ב0.2% trypan הכחול להכנת lysates לכתמים מערביים במקום מגרד את התאים עם להב קצה אחד.
    4. תאי צנטריפוגה ב 10,000 XG למשך 2 דקות, להסיר את התקשורת על ידי שאיפה, להוסיף 200 חיץ תמוגה μl, sonicate התאים במאגר תמוגה ולקבוע את ריכוז החלבון.
    5. לחשב את כמות חלבון לכל תא על ידי חלוקת תשואת החלבון במספר התאיםשנוצר סכום זה. טען את lysate לבאר כל ג'ל polyacrylamide הנפרד שמייצג שני) כמויות שווה של חלבון וב) כמויות חלבון המייצגות מספרים סלולריים שווי ערך. לפחות 25 מיקרוגרם חלבון צריך להיות טעון לתוך כל אחד.
      הערה: זה יאפשר השוואות בין תאי גידול והרדומים, שהם שונים באופן משמעותי בגודל ותכולת חלבון (איור 1).
  2. Cytometry הזרימה
    1. איסוף תאים מצלחות 100 מ"מ על ידי trypsinization, כמו ב3.1 ולנתח על ידי תא הקרינה סטנדרטי הופעל מיון פרוטוקולים (FACS) באמצעות מכתים immunofluorescence ראשוני או המשני לשני אנטיגנים תאיים או תאיים, כפי שתואר ב2.4.
      הערה: ניתוק תאים מצלחות תרבית רקמה על ידי trypsinization אינו משפיע על הריכוז של חלבונים בממברנה, כפי שנקבע על ידי תיוג נוגדן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניסויים שנערכו כדי לשחזר את assay. במהלך הניסוי הזמן מוצג באיור 2 א. תאים טופחו על צפיפות clonogenic ביום -1, FGF-2 במדיום חדש מתווסף ביום 0 ותאים בתרבית עד שהיום 6 כאשר הם מוכתמים ומושבות נספרות. כל הפרעות למערכת מנוהלות ביום 3 ב100 כרכי μl ב10x ריכוזים סופיים רצוי. איור 2 מדגים את המראה האופייני של מושבות גדלו ורדומות. מושבות גדלו לכלול> 30 תאים ומושבות רדומות מכילות 12 או פחות תאים שהם פעמים רבות יותר גדולות מגידול תאים עם יחס ציטופלסמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המודל שלנו מורכב ממספר אלמנטים המרכזיים של תרדמת במח העצם. זה מורכב של אסטרוגן תאים רגישים, שהם הסוג צפוי להישאר רדום במוח לפרקי זמן ממושך 10, זה מורכב של פיברונקטין, אלמנט מבני עיקרי של מוח, FGF-2, גורם גדילה מסונתז בשפע על ידי סטרומה מח העצם והופקד בכבדות במטריקס של מח העצם 31,32 ודגירה של תאים בצפיפות clonogenic בי האינטראקציות שלהם הן ​​בעיקר בתשתית. בעוד מייקרו-סביבת מח העצם הוא הרבה יותר מורכב, מערכת פשוטה זו יכולה להיות בנויה עם מורכבות ככל הוסיפו לפי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

נתמך על ידי משרד הגנה מענקי DAMD17-01-C-0343 וDAMD17-03-1-0524, נציבות מדינת ניו ג'רזי בחקר הסרטן 02-1140-CCR-E0 ורות Estrin גולדברג הזיכרון לחקר הסרטן (RW)

תודות

יש המחברים אין לחשוף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי MCF-7תאי ATCCHTB-22
T47D ATCCHTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat BottomTC-Treated TC Multiwell Plate Corning354411
BD BioCoat פיברונקטין 60 מ"מ צלחות תרביתקורנינג354403
BD BioCoat פיברונקטין 100 מ"מ כלי תרבותקורנינג354451
BD BioCoat 22x22 מ"מ #1 כיסוי זכוכית עם מריחה אחידה של פיברונקטיןאנושיקורנינג354088
6 באר צלחת תרבית רקמותCellTreat229106
Dulbecco נשר שונה בינוני גבוה גלוקוז 10X אבקתקורנינג מדעי החיים50-013-PB
סרום בקר עוברי מושבת בחוםמקורFB02-500HI
0.25% טריפסין/2.21 מ"מ EDTAקורנינג25-053-CI
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100Xקורנינג30-002-CI
L-גלוטמין, 100x,קורנינג25-005-CI
FGF אנושי רקומביננטי  מו"פ בסיסי D Systems234-FSE-025
מעכב Akt (1L6-הידרוקסימתיל-כירו-אינוזיטול-2-(R)-2-O-מתיל-3-O-אוקטדציל-sn-גליצרוקרבונט)CalBiochem124005
LY294002 CalBiochem19-142מעכב PI3K Chenical
C3 transferase שלד הציטוCTO3מעכב את RhoA, RhoB ו-RhoC, אך לא GTPases קשורים כגון Cdc42 או Rac1
Y-27632 דיהידרוכלוריד סנטה קרוז ביוטכנולוגיה129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (ירוק) בדיקות מולקולריותB607פלואורוכרום לצביעת אקטין פיברילרי
BODIPY FL-רודמין פלואידין (אדום) בדיקות מולקולריותR415פלואורוכרום לצביעת אקטין פיברילרי
Alexa Fluor 488 נוגדן IgG נגד עכבר חמור, מגיב ReadyProves בדיקות מולקולריותR37114
ProLong Gold Antifade Mountant עם DAPI בדיקות מולקולריותP-36931
בינלאומי נוזלי

מקורות

  1. Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
  2. Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
  3. Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
  4. Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
  5. Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
  6. Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
  7. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
  8. Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
  9. Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
  10. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
  11. Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569(2012).
  12. Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
  13. Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
  14. Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914(2011).
  15. Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
  16. Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
  17. Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
  18. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  19. Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
  20. Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
  21. Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
  22. Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
  23. Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
  24. Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
  25. Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
  26. Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
  27. Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
  28. Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
  29. Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
  30. Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
  31. Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
  32. Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
  33. Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
  34. Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
  35. Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
  36. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  37. Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FGF 2PI3K

מאמרים קשורים