מאמר שיטה

Assay זול, Scalable התנהגות למדידת אתנול הרגעת רגישות וסובלנות מהירה ב

10K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52676

⸱

15 באפריל 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Human and Molecular Genetics, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

במאמר זה

סיכום

בדיקות פשוטות למדידת רגישות לאתנול וסבילות מהירה בדרוזופילה מקלות על השימוש באורגניזם מודל זה לחקירת התנהגויות חשובות אלה הקשורות לאתנול. כאן מתוארת בדיקה פשוטה יחסית וניתנת להרחבה למדידת רגישות לאתנול וסבילות מהירה בזבובים.

תקציר

הפרעת שימוש באלכוהול (AUD) היא אתגר בריאותי חמור. למרות מרכיב תורשתי גדול לAUD, כמה גנים היו מעורבים באופן חד משמעי באטיולוגיה שלהם. זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, הוא מודל עוצמה לחקר מנגנונים מולקולריים-גנטיים שבבסיס התנהגויות הקשורות לאלכוהול, ולכן טומן בחובו הבטחה גדולה לזיהוי וההבנה של הפונקציה של גנים המשפיעים על AUD. השימוש במודל תסיסנית למחקרים מסוג תלוי בזמינות של מבחני שלמדוד באופן מהימן תגובות התנהגותיות לאתנול. דו"ח זה מתאר assay המתאים להערכת רגישות אתנול וסובלנות מהירה בזבובים. רגישות אתנול נמדדה בassay זה מושפעת הנפח והריכוז של אתנול משמש, מגוון רחב של מניפולציות גנטיות שדווחו בעבר, וגם את משך זמן הזבובים הם שוכנו ללא מזון מייד לפני הבדיקה. בניגוד לכך, של אתנולensitivity נמדד בassay זה אינו מושפע מהמרץ של טיפול זבוב, מין של הזבובים, ותוספת של מדיום גידול באנטיביוטיקה או שמרים חיים. שלוש שיטות שונות לרגישות אתנול quantitating מתוארות, כולם מובילים לתוצאות רגישות אתנול בלתי שונה במהות. טבע מדרגי של assay זה, בשילוב עם הפשטות שלה הכוללת להגדרה והוצאה נמוכה יחסית, הופך אותו מתאים לניתוח גנטי בקנה מידה קטן וגדול של רגישות אתנול וסובלנות מהירה בדרוזופילה.

מבוא

הפרעת שימוש באלכוהול (AUD) היא בעיה בריאותית עצומה ברחבי העולם (שנסקרה ב1). למרות מנגנוני הנהיגה פיתוח AUD מורכבים, יש להם הפרעות אלה מרכיב גנטי משמעותי (לדוגמא, 2). התורשתיות הגדולה של AUD והתגובות התנהגותיות המשומרות כדי אתנול על פני מינים רבים (שנסקרו ב3,4) יצרו עניין רב בשימוש באורגניזמים מודל גנטיים כדי לחקור את מעורבותם של גנים מסוימים בהתנהגויות הקשורות לאתנול להבנה טוב יותר של הבסיס המולקולרי של AUD. זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, התפתח כאורגניזם מודל מוביל לחקר מנגנונים מולקולריים-גנטיים של התנהגויות הקשורות לאתנול (שנסקרו ב3,4). מחקרים בזבובים הדגישו תפקידים במשך כמה מסלולי איתות בתגובות התנהגותיות לאתנול (הנסקרת ב 5). מעניין לציין, שחלק מהגנים והמסלולים המשפיעים על התנהגות responses לאתנול בזבובים גם היה מעורב בהתנהגויות הקשורות לאתנול מכרסם ו / או AUD האנושי (למשל, 6-14). שימור מנגנוני נהיגה התנהגויות הקשורות לאתנול בין מינים, בשילוב עם החבילה של כלים גנטיים זמינים במערכת מודל דרוזופילה, מדגיש את התועלת של מודל זבוב פירות לחקירת הגנטיקה של תגובות התנהגותיות לאתנול.

רגישות וסובלנות 15,16 (הנסקרת ב -17) כדי אתנול בבני האדם קשורה להתפתחות של AUD. שתי תגובות התנהגותיות אלה כדי אתנול יכולים להיות מודל בזבובים באמצעות מגוון רחב של מבחני מעבדה (שנסקר ב3,4). כל מבחני הזבוב ידועים למחברים מבוססים על שני מושרה אתנול הרגעה / חוסר קואורדינציה תלוי זמן או זמן החלמה תלוי מהרגעת אתנול.

במאמר קודם מהקבוצה שלנו בגנטיקה של רגישות אתנול וrסובלנות apid בדרוזופילה, assay התנהגות המבוסס על הרגעה מושרה אדי אתנול זבובים שימשה 18. הבדיקה בassay זה הייתה ביוזמת העברה מבוגרת חי עפה ללא הרדמה לרוקן את בקבוקוני מזון, לכידת הזבובים בצלוחיות עם תקע אצטט תאית, הוספת אתנול לראש (כלומר, הצד הלא-fly) של התקע אצטט תאית, ו איטום הבקבוקון המכיל זבובים, תקע אצטט תאית ואתנול עם פקק סיליקון (ראה סכמטי באיור S3, התייחסות 18). בקבוקונים מרובים המייצגים קבוצות שונות של זבובים הוערכו במקביל, הגדלת תפוקה של assay זה. בקבוקונים ניתנו קוד אנונימי והנסיינים לא היו מודעים לקבוצת טיפול למניעת הטיה מכוונת בהערכת ההרגעה. בניסוי סטנדרטי, זבובים בבקבוקונים שנקשו בעדינות בשעה 6 דקות במרווחים, ולאחר התאוששות 30 שניות, את מספר הזבובים מסוממים בכל בקבוקון נספר וconverteד לזבובים פעילים אחוזים. זבובים נקלטו אדי אתנול מהתקע אצטט תאית באופן תלוי זמן, גורמים לעלייה הדרגתית באתנול הפנימי 18 והרגעה (התייחסות CF 18 ואיור 1 א ו -1 B בדוח זה). הרגעה בassay זה הוגדרה מבצעי כזבובי מעמד (i) בהעדר ההליכה או (ii) שוכב על גבם, עם או בלי נפנוף הכנפיים שלהם. כאן, assay ההרגעה אתנול זה מתואר בפירוט, אופטימיזציה תפעולית נוספת הנוגע לשימוש בו מסופקת, וassay משמש לטיפול בתרומה של אפשרויות תוספי מזון על רגישות הרגעה זבוב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. יום לפני Assay

  1. לאסוף זבובים לתוך צלוחיות מזון טריות בקבוצות של 11 (חד מיני) תחת CO הקצר (1-5 דקות) 2.
  2. לאפשר זבובים להתאושש O / N בבקבוקוני מזון בחלל מבוקר לסביבה (בדרך כלל 25 ° C, 60% לחות יחסית, שעות אור 12 / מחזור כהה).
  3. הכן פתרון אתנול (ים) על ידי דילול (100%) אתנול טהור במים מטוהרים (≥18 MΩ) לריכוז סופי (ים) מתאים לניסוי המתוכנן. לאפשר פתרון (ים) כדי לחזור לRT O / N.
    הערה: הדילול של אתנול פולט חום.

2. יום של Assay

  1. לכל בקבוקון של זבובים להיבדק, להכין (i) בקבוקון מזון נקי, ריק; כלומר, בקבוקון בדיקות, (ii) תקע אצטט תאית חדש, (iii) פקק סיליקון ו( iv) 1 מיליליטר של תמיסת אתנול (ראה טבלה 3).
  2. הכן חדר בדיקות על ידי התאמת טמפרטורה 20-25 מעלות צלזיוס ולחות היחסית ל55-65%.
  3. יש עובד נוסףלהקצות קוד ייחודי לכל קבוצה של בקבוקונים ולהקליט את הקוד לשימוש מאוחר יותר. מניחים צלוחיות מקודדות עם זבובים בחדר בדיקות כדי להסתגל לכמה דקות.
  4. תווית בקבוקוני בדיקות ריקות כדי להתאים קודים על בקבוקונים לטוס מ -2.3.
  5. לבנות יומן עותק בדיקה קשה על ידי הזנת הקודים לעמודות (עמודה אחת / בקבוקון) בגיליון אלקטרוני דומה לטבלת 1.
  6. , שימוש ביומן הבדיקות כמדריך לסדר בקבוקוני מזון מקודדים עם זבובים ובקבוקוני בדיקות ריקים למערכי התאמה בחדר הבדיקה.
    הערה: מספר מרבי סביר של בקבוקונים לבדוק הוא 24 (כלומר, 6 סטים של 4 בקבוקונים כל אחד).
  7. העברת זבובים מבקבוקוני מזון להתאמת בקבוקוני בדיקות ריקות שכותרתו / ולהכניס מייד תקעים אצטט תאית לתוך צלוחיות בדיקות עד תקעים אצטט תאית הם 2 סנטימטר מתחת לצמרות הבקבוקון.
  8. מכאן והלאה, לטפל בכל שורה של ארבעה בקבוקונים כערכה במרווחים דק 'מדורגים 1.
  9. להערכה זמן 0, לתפוס כל בקבוקון בנפרד wאגודל ואצבע ה- i, לטפוח בעדינות על השולחן שלוש פעמים לדפוק זבובים לתחתית של הבקבוקון, לחכות 30 שניות ואז לספור את מספר הזבובים שהם נייחים / מתים. רשום את מספר הזבובים נייחים / מתים עבור כל בקבוקון בזמן 0 דקות ביומן הבדיקות המודפסת.
  10. הפעלת טיימר ספירה ברציפות בזמן 0 ומייד מתחיל הוספת 1 מיליליטר של אתנול לתקעים אצטט תאית בבקבוקונים לשורה / הסט הראשון של 4 בקבוקונים. הוסף 1 מיליליטר של אתנול לתקעים אצטט תאית בבקבוקונים במרווחים של 5 שניות על מנת שייבחנו. הוספת אתנול לתקעים אצטט תאית בתנועה סיבובית, כך שאתנול נספג באופן שווה לאורך כל התקעים אצטט תאית. כאשר אתנול נוספו לכל 4 בקבוקוני הבדיקה בסט, להכניס תקע סיליקון בכל בקבוקון כדי לאטום אותו.
  11. בזמנים 1, 2, 3, 4 ו -5 דקות, להוסיף 1 מיליליטר של אתנול לרביעי, סטים השני, שלישיים, החמישי והשישי של 4 בקבוקונים, בהתאמה. המשך החדרת פקקי סיליקון לאחרהוספת אתנול לכל סט של 4 בקבוקונים.
  12. בזמן 6 דקות, לבדוק את הסט הראשון של 4 בקבוקונים ידי אחיזת כל בקבוקון עם אגודל ואצבע, הקשה בעדינות על השולחן שלוש פעמים לדפוק זבובים לתחתית של הבקבוקון, מחכה 30 שניות ולאחר מכן ספירה ורישום המספר הכולל של זבובים שהם מסוממים. ציון עף כמו מסומם אם הם (i) עומדים על רצפת הבקבוקון אבל לא ללכת או (ii) לשכב על גבם, עם או בלי נפנוף הכנפיים שלהם.
  13. לטפל בכל בקבוקון בתוך נקבע על 5 מרווחי שניות באמצעות לוח הזמנים בטבלה 2.
  14. לפעמים 7, 8, 9, 10 ו -11 דקות, לבדוק את הסטים שני, שלישיים, רביעי, חמישי והשישי של בקבוקונים, בהתאמה, כפי שנעשה לסט הראשון.
  15. בדקות זמן 12, לבדוק את הסט הראשון של 4 בקבוקונים שוב כפי שמתואר ב2.12 ולהמשיך הבדיקה רביעית, הסטים שני, שלישיים, חמישי והשישי של בקבוקונים בגיל 13, 14, 15, 16 ו -17 דקות, בהתאמה.
  16. המשך זבובי בדיקה כמתואר ב2.12 עד שכל הזבובים שלedated.
  17. הזן את המספר הכולל של זבובים בכל בקבוקון ביומן עותק הבדיקה הקשה. לצנזר זבובים נייחים / מתים בזמן 0 מהמספר הכולל של זבובים.
  18. לחשב את זבובי אחוזים פעילים בכל נקודת זמן הערכה ונתונים עלילה כזבובי% פעילים (ציר y) לעומת זמן (ציר x). לכמת הרגעה אתנול על ידי ביון סדציה זמן 50 ערכים (ST50, זמן להרגעת 50%) מסדר שלישי עקום פולינום או sigmoidal מתאים או חישוב שטח מתחת לעקומה.
  19. לאסוף נתונים מבקבוקונים מפוענחים ולבצע ניתוחים סטטיסטיים (למשל, בכיוון אחד ANOVA עם מבחן השוואה מרובה Bonferroni) מתאים כלתכנון ניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נתונים הגולמיים מassay ההרגעה אתנול זה הם המספרים של זבובים שהם מסוממים כפונקציה של זמן חשיפת אדי אתנול. הם נתונים גולמיים הוסבו לזבובים הפעילים אחוזים כפונקציה של זמן (נתונים ראשוניים, איורים 1 א ', ב', ד '- ו'). רגישות להרגעת אתנול מנתונים הראשוניים ניתן נרשמת כסדציה זמן 50 (ST50), את הזמן הנדרש עבור 50% מזבובים להפוך מסומם או AEA מתחת לעקומה (AUC), באמצעות אינטרפולציה מהעקומה מתאימה. בעבר דיווח 18 עקומות פולינום מסדר שלישי להתאים את ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מבחני פשוטים שreproducibly לכמת פנוטיפים משמעותיים הם בעלי ערך רב לניתוח ההתנהגות. העבודה המתוארת כאן מטפלת במספר היבטים מעשיים של assay למדידת רגישות הרגעה אתנול וסובלנות מהירה בדרוזופילה. למרות שלא להתמקד על עבודה זו, ניתוחי התנהגות הם הקלו על ידי שמירה על איכות הסביבה וקבועה רקע גנטי לבדיקת נושאים במחקר. יתר על כן, השוואה צריכה בדרך כלל נקבעת בין קבוצות של זבובים שגדלו ונבדקו צד-by-side. לשם כך, כל הזבובים בתוך ניסויי פרט בעבודה זו היה אותו הרקע הגנטי וגודלו זה לצד זה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקרים אלה נתמכו על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לאלכוהוליזם ושימוש לרעה באלכוהול ל-M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). המחברים מודים לג'יל בטינגר על הדיונים המועילים ולז'קלין דלויט על הסיוע הטכני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוקוני מזוןVWR89092-772
זיזים צריםGenesee/flystuff.com49-102
פקק סיליקוןפישר סיינטיפיק09-704-1l#4
אתנולPharmaco-Aaper111000200200 הוכחה
צר

מקורות

  1. Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
  2. Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
  3. Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
  4. Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
  5. Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
  6. Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
  7. Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
  8. Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
  9. Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
  10. Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
  11. Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
  12. Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
  13. Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
  14. Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
  15. Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
  16. Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
  17. Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
  18. Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
  19. Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
  20. Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
  21. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
  22. Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
  23. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  24. Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
  25. Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
  26. Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541(2011).
  27. Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
  28. Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
  29. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
  30. Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
  31. Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Drosophila melanogaster50

מאמרים קשורים