השימוש ברזולוציה גבוהה אינפרא אדום תרמוגרפיה (HRIT) לחקר הקרח נוקלאציה וקרח רביה בצמחים

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לדמיין אתרים של היווצרות קרח ודרכים של התפשטות קרח בצמחים תוך שימוש בתרמוגרפיה אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה (HRIT).

תקציר

אירועי הקפאה המתרחשים כאשר צמחים גדלים באופן פעיל יכולים להיות אירוע קטלני, במיוחד אם לצמח אין סבילות להקפאה. לאירועי כפור כאלה יש לעתים קרובות השפעות הרסניות על הייצור החקלאי ויכולים גם למלא תפקיד חשוב בעיצוב מבנה הקהילה באוכלוסיות טבעיות של צמחים, במיוחד במערכות אקולוגיות אלפיניות, תת-ארקטיות וארקטיות. לכן, הבנה טובה יותר של תהליך ההקפאה בצמחים יכולה למלא תפקיד חשוב בפיתוח שיטות להגנה מפני כפור והבנת מנגנוני הימנעות מהקפאה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להמחשת תהליך ההקפאה בצמחים באמצעות תרמוגרפיה אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה (HRIT). השימוש בטכנולוגיה זו מאפשר לקבוע את האתרים העיקריים של היווצרות קרח בצמחים, כיצד קרח מתפשט ונוכחות מחסומי קרח. יתר על כן, הוא מאפשר לבחון את תפקידם של גרעינים חיצוניים ופנימיים בקביעת הטמפרטורה שבה צמחים קופאים ולהעריך את יכולתן של תרכובות שונות להשפיע על תהליך ההקפאה או להגביר את סבילות ההקפאה. השימוש ב-HRIT מאפשר לדמיין את ההתאמות הרבות שהתפתחו בצמחים, המשפיעות באופן ישיר או עקיף על תהליך ההקפאה ובסופו של דבר מאפשרות לצמחים לשרוד אירועי כפור.

מבוא

טמפרטורות מקפיאות המתרחשות כאשר צמחים גדלים באופן פעיל יכול להיות קטלני, במיוחד אם המפעל יש סובלנות הקפאה קטנה או לא. יש אירועים כאלה לעתים קרובות כפור השפעות הרסניות על ייצור חקלאי וגם יכולים לשחק תפקיד חשוב בעיצוב מבנה קהילה באוכלוסיות טבעיות של צמחים, במיוחד באלפיני, מערכות אקולוגיות תת-ארקטי והארקטי ^1-6. פרקים של כפור האביב החמור היו השפעות עיקריות על ייצור פירות בארה"ב ובדרום אמריקה בשנים האחרונות ^7-9 והוחמרו על ידי ההתפרצות המוקדמת של מזג אוויר חם ואחרי טמפרטורות נמוכות ממוצעים אופייניות יותר. מזג האוויר החם גורם לתחילת ניצנים לשבור, הפעלת הצמיחה של יורה, עלים, פרחים וחדשים שכולן יש מעט מאוד לא סובלנות כפור ^1,3,10-12. דפוסי מזג אוויר בלתי יציבים כגון דווחו להיות השתקפות ישירה של שינויי האקלים מתמשכים וצפויים להיות דפוס מזג אוויר משותף לforesעתיד eeable ^13. מאמצים כדי לספק טכניקות חסכוניות, יעילות, וידידותיות לסביבה ניהול או להגנת הצומח שיכול לספק סובלנות כפור מוגברת היו הצלחה מוגבלת לשורה של סיבות, אבל זה יכול להיות מיוחס בחלקה לאופי המורכב של הקפאת סובלנות והקפאת מנגנוני הימנעות בצמחים. ¹⁴

מנגנוני ההסתגלות הקשורים להישרדות כפור בצמחים באופן מסורתי מתחלקים לשתי קטגוריות, הקפאת סובלנות והימנעות ההקפאה. הקטגוריה לשעבר מזוהה עם מנגנונים ביוכימיים מוסדרים על ידי קבוצה מסוימת של גנים המאפשרים לצמחים לעמוד בעקות קשורות בנוכחות והשפעת dehydrative של קרח ברקמות שלו. בעוד הקטגוריה השנייה היא בדרך כלל, אך לא רק, הקשורים להיבטים מבניים של צמח שקובעים אם, מתי והיכן צורות קרח במפעל ^14. למרות השכיחות של הימנעות הקפאה כמודעהמנגנון aptive, מחקר קטן הוקדש בתקופה האחרונה להבנת מנגנוני ויסות של הימנעות הקפאת הבסיס. הקורא מופנה לסקירה האחרונה ¹⁵ לפרטים רבים יותר בנושא זה.

בעוד היווצרות הקרח בטמפרטורות נמוכות אולי נראית כמו תהליך פשוט, גורמים רבים תורמים לקביעת הטמפרטורה שבה הקרח nucleates ברקמות צמח וכיצד הוא מתפשט בתוך המפעל. פרמטרים כגון הנוכחות של חיצוני ופנימי קרח nucleators, אירועי נוקלאציה הטרוגנית לעומת הומוגנית, תרמית-hysteresis (נוזל לרדיאטור) חלבונים, נוכחות של סוכרים ספציפיים וosmolytes האחר, וכן שורה של היבטים מבניים של הצמח יכול לשחק כל משמעותי תפקיד בתהליך ההקפאה בצמחים. באופן קולקטיבי, פרמטרים אלה משפיעים על הטמפרטורה שבה צמח קופא, שבו קרח הוא יזם ואיך הוא גדל. הם יכולים גם להשפיע על המורפולוגיה של גבישי קרח שנוצרו.שיטות שונות שימשו ללמוד את תהליך ההקפאה בצמחים בתנאי מעבדה, כוללים ספקטרוסקופית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ^16, הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) ^17, cryo-מיקרוסקופיה ^18-19, ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק בטמפרטורה נמוכה (LTSEM ). ²⁰ הקפאה של צמחים שלמים בהגדרות מעבדה ושדה, לעומת זאת, בעיקר במעקב עם צמדים תרמיים. השימוש בצמדים ללמוד הקפאה מבוסס על השחרור של חום (אנתלפיה של היתוך) כאשר מים עוברים שלב מעבר מנוזל למוצק. הקפאה אז נרשמה כאירוע אקסותרמית. ^21-23 למרות צמדים הם השיטה האופיינית לבחירה בלימוד הקפאה בצמחים, יש שימושם מגבלות רבות המגבילות את כמות המידע שהושג במהלך אירוע הקפאה. לדוגמא, עם צמדים קשה כמעט בלתי אפשרי לקבוע היכן קרח הוא יזם בצמחים, איך זה מתפשט,אם זה מתפשט באפילו שיעור, ואם כמה רקמות להישאר חופשיות של קרח.

התקדמות בתרמוגרפיה ברזולוציה גבוהה אינפרא אדום (HRIT) ^24-27, לעומת זאת, הגדילה באופן משמעותי את היכולת לקבל מידע על תהליך ההקפאה בכל צמחים, במיוחד בעת שימוש במצב הדמיה ההפרש. ^28-33 בדו"ח הנוכחי, אנחנו מתאר את השימוש בטכנולוגיה זו כדי ללמוד היבטים שונים של תהליך ההקפאה ופרמטרים שונים המשפיעים בו ובאיזה טמפרטורת קרח הוא יזם בצמחים. פרוטוקול יוצג שידגים את היכולת של חיידק קרח התגרענות-אקטיבי (INA), Pseudomonas syringae (CIT-7) לפעול כnucleator חיצוני ייזום הקפאה בצמח עשבוני בטמפרטורה גבוהה, שמתחת לאפס.

מצלמה אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה

הפרוטוקול ודוגמאות מתועדות בדו"ח זה לנצל רזולוציה גבוהה אינפרא אדומותרדיומטר וידאו. מד הקרינה (איור 1) מספקת שילוב של תמונות ספקטרום אינפרא אדום ונראה לעין ונתוני טמפרטורה. תגובת הרפאים של המצלמה היא בטווח של 7.5-13.5 מיקרומטר ומספקת 640 x 480 פיקסלים ברזולוציה. תמונות ספקטרום הנראה נוצרו על ידי מצלמה ניתן התמזגה עם IR-תמונות בזמן אמת, המאפשר הפרשנות של תמונות מורכבות, תרמית-בנבנה. מגוון של עדשות למצלמה יכול לשמש להכנה מקרוב ותצפיות מיקרוסקופיות. המצלמה יכולה לשמש במצב עצמאי, או ממשק ובשליטה עם מחשב נייד באמצעות תוכנת propietary. התוכנה יכולה לשמש כדי להשיג מגוון רחב של נתונים תרמיים המשובצים בקטעי הווידאו המוקלטים. חשוב לציין כי מגוון רחב של radiometers אינפרא אדום זמין מסחרי. לכן, זה הכרחי כי החוקר לדון היישום המיועד שלהם עם מהנדס מוצר וידע שחוקר לבדוק את יכולתו של כל ספציפיתרדיומטר ג לספק את המידע הדרוש. רדיומטר ההדמיה משמש בפרוטוקול המתואר ממוקם בתיבת אקריליק (איור 2) מבודד עם קלקר אני n כדי להרתיע חשיפה לעיבוי בפרוטוקולי ההתחממות והתקררות. הגנה זו אינה נחוצה לכל המצלמות או יישומים.

פרוטוקול

1. הכנת צמח חומרים

1. השתמש באחת עלים או צמחים שלמים של חומר צמחי נושא (SPP Hosta. או vulgaris Phaseolus).

2. הכנת פתרונות מים המכילים חיידקים הקרח נוקלאציה פעילים (INA)

1. תרבות חיידק INA, Pseudomonas syringae (הזנים Cit-7) בצלחות פטרי של 25 מעלות צלזיוס בPseudomonas אגר F מוכן עם L / 10 גרם של 100% לגליצרול הכיוון של היצרן.
2. לאחר התרבויות גדלו מספיק, מקום על 4 מעלות צלזיוס עד צורך אבל לשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך יומיים לפני להבטיח רמה גבוהה של פעילות נוקלאציה קרח.
3. לגרד חיידקים מצלחת אחת מפני שטח של אגר עם פלסטיק, חד פעמי או לשימוש חוזר מרית מתכת בעת השימוש ומקום ב10-15 מיליליטר של מים ללא יונים בקובט חד פעמי 25 מיליליטר. הריכוז צריך להיות בטווח של 1 x ^07-01 אוקטובר x 10 ^{9 ·} מיליליטר ^-1. הפתרון יופיע מעונן. אין צורך לאשר את הריכוז באמצעות hemocytometer או ספקטרופוטומטר, כריכוז צריך רק להיות מקורב.
4. מערבולת קובט למינימום של 10 שניות כדי לפזר את החיידקים.
   הערה: הריכוז המסוים של תערובת INA וכתוצאה מכך הוא לא חשוב והפרוטוקול המתואר יספק יותר מ רמה נאותה של פעילות נוקלאציה קרח. תערובת זו של חיידקים ומים INA תשמש מאוחר יותר בניסויי ההתגרענות.

3. הגדרת ניסוי הקפאה

1. מניחים את המצלמה ברזולוציה הגבוהה אינפרא אדום (SC-660) בתוך קופסא אקריליק מגן, כך שהפרויקטים העדשה דרך הפתח בחלק הקדמי של התיבה וחוטי חיבור המצלמה ליציאת מכשיר נייד או הקלטה דרך הפתח האחורי של התיבה . אבטח את מכסה הקופסה ולמקם את התיבה בתוך החדר או במקפיא הסביבתי במיקום שכל רצוןow להיראות החומר צמחי נושא.
   1. לספק רקע כהה סביב החומר הצמחי על ידי המצפה את הקירות של החדר עם נייר הבנייה שחור כדי למנוע הפרעות מאנרגיה אינפרא אדומה משתקפת.
   2. להתאים את החדר עם תאורת LED כדי למזער חימום ממקור האור כאשר תמונות הקלטה באורכי גל נראים לעין נדרש. רק מינימום של תאורה, כגון אור ארון הפועל על סוללות או מכשיר LED קטן אחר, נדרש לצמחים להיות גלויים על ידי המצלמה.
      1. ברגע שתמונות גלויות של החומר צמחי נושא נלקחות, לכבות את תאורת LED. להפיץ כל חיבורים החיצוניים קווית (חיבור FireWire למחשב, כבל חשמל, וכו ') למצלמה דרך יציאה או פתיחה אחרת בתא.
   3. מלא כל שטח נוסף בנמל או הפתיחה עם חומר בידוד קצף כדי למנוע או להפחית הדרגתיים טמפרטורה בתוך התא. הגדר את הטמפרטורה ההתחלתית של קאמרי ב 1 מעלות צלזיוס.
2. יישר צמחים או חלקי צמח, כך שהחומר הצמחי הוא בשדה הראייה של-של המצלמה והחומר הצמחי הוא גלוי על מסך הצפייה מרחוק או בתוכנה שבחר.
3. מאפשר לצמחים לאזן ל 1 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשעה 1, תלוי בגודל של החומר הצמחי, לפני ייזום ניסוי הקפאה מבוקר. זה מבטיח שהטמפרטורה של הצמח לא לפגר טמפרטורת אוויר על ידי מעלות רבות לאחר שניסוי ההקפאה הוא יזמה. איזון יושג כאשר הטמפרטורה של החומר הצמחי היא בתוך 0.5 מעלות צלזיוס בטמפרטורת אוויר.
   1. מניחים שכבת בידוד קלקר על גבי האדמה של עציצים אם עציצים משמשים. ברגע שהצמחים equilibrated, להתחיל קירור של החדר.
      הערה: שכבת הבידוד על פני הקרקע של הסיר מפחיתה את כמות איבוד חום המשיך מהסיר לאוויר המקיף את המפעל, ומונעת מהשורשים freezing, כמו זה לא מתרחש בדרך כלל במהלך אירוע כפור בטבע בשל המאגר העצום של הווה חום השיורי בקרקע.
4. הגדר את הפרמטרים הרצויים מצלמה (לוח צבעים, טווח טמפרטורות, אזורים ספציפיים של עניין, וכו '), כפי שנדון ב3.4.1-3.4.4.
   1. בחר את הצבעים הקשת כדי להציג את השינויים בטמפרטורה בזמן הצפייה בתמונה בשידור חי.
   2. הגדר את טווח הטמפרטורה עד 5 מעלות צלזיוס על ידי התאמת סרגל הטמפרטורה ממוקם בדיוק מתחת לתמונה בתוכנה.
   3. בחר את קנה המידה ליניארי (אלגוריתם) להמרת נתונים אינפרא אדומים לתמונת צבע השווא כהגדרתו בפלטה שנבחרה (קשת) ולהגדיר את טווח הטמפרטורה עד 5 מעלות צלזיוס ולעקוב אחר אופן אוטומטי בהתבסס על התמונה. לחלופין, להתאים מגוון להגדיר באופן ידני בעת ביצוע הניסוי.
      1. השתמש בטמפרטורה של נקודה ספציפית או טמפרטורה ממוצעת באזור המוגדר של עניין הניתן על ידי softwהם. לאחזר את נתוני הטמפרטורה של כל הפיקסלים מרצף וידאו המוקלט או מהמידע הגלום בקובץ התמונה. איור 3 מראה מסך טיפוסי מתוך תוכנת ResearchIR.
   4. מניחים את סמן על מיקום על רקמות הצמח שמייצגת נקודת העניין ספציפית. הגדר את תחומי עניין של נקודות (1 -3 פיקסלים בגודל), תיבות, קווים, אליפסות, או חוגים. שילובים רבים של נקודות או צורות יכולים להיות ממוקמים מעל התמונה.
5. הקלטת רצף וידאו
   1. הגדר את המצלמה כדי להקליט בתדר 60 הרץ ולהקלטה ללהיפסק באופן ידני.
   2. לציין את המיקום במחשב או בכונן חיצוני שבה קובץ וידאו המוקלט יוצב.
   3. להתחיל הקלטה.
      הערה: הקלטה לכונן קשיח חיצוני מומלצת ביותר מאז קבצי וידאו גדולים יופקו. קבצי וידאו מוקלטים ניתן מאוחר יותר עריכה ומכילים רק את החלק המכיל את neמידע cessary. זה מאוד יקטין את גודל הקובץ.
   4. מנמיכים את הטמפרטורה של החדר בהדרגה ב -0.5 -1.0 מעלות צלזיוס. חכה עד שטמפרטורת הצמח equilibrates עם טמפרטורת אוויר ולאחר מכן להוריד את הטמפרטורה שוב על ידי 0.5-1.0 מעלות צלזיוס. בהתאם למסה של רקמת הצמח שנצפה והמורפולוגיה שלה, איזון יכול לקחת 10 עד 15 דקות. לפיכך, נותן קצב קירור של כ -4 מעלות צלזיוס / שעה.
   5. המשך בדרך זו עד הצמח קופא ותצפיות הושלמו. לסיים את ההקלטה כאשר הושלם תהליך ההקפאה.
      הערה: רקמת צמח equilibrated עם טמפרטורת אוויר כאשר החומר הצמחי והרקע הוא באותו צבע שכן הם באותה הטמפרטורה. מאז טמפרטורת הרקע ואת הטמפרטורה של רקמת הצמח זהה, זה עלול להיות קשה לדמיין את החומר הצמחי עד ששוב מוריד את הטמפרטורה ויש ההפרש טמפרטורה בין רקמות הצמח וטמפרטורת IR.

תוצאות

פעילות הקרח nucleating של הקרח + חיידק, Pseudomonas syringae (זן Cit-7)

ירידה של 10 μl של מים ו -10 μl של מים המכיל פ syringae (CIT-7) הונחו על פני השטח abaxial של עלה Hosta (Hosta spp.) (איור 4). כפי שמודגם, הירידה של מים המכילים חיידקי INA קפאה ראשונה והייתה אחראי לגרימת העלה להקפיא בעוד טיפת מים על פני השטח העלה נשארה יצאה מן ההקפאה.

דיון

יש מים היכולת מדליקה לטמפרטורות נמוכות 0 מעלות צלזיוס והטמפרטורה בה מים יקפאו יכולים להיות משתנים לגמרי. ³⁶ מגבלת הטמפרטורה לקירור של מים טהורים היא על -40 מעלות צלזיוס ומוגדרת כנקודת נוקלאציה הומוגנית. כאשר מים קופאים בטמפרטורות חמה יותר מאשר -40 ° C זה הוא הביא על ידי הנוכחות של הטרוגניים nucleators המאפשרים עוברי קרח קטנים כדי ליצור שלאחר מכן ישמש כזרז להיווצרות קרח וצמיחה. ³⁷ יש שפע של מולקולות בטבע ש לפעול סוכני nucleating הקרח כיעילים מאוד, ולכן רוב ההק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מצלמת אינפרא אדום	FLIR	SC-660	דגמים רבים זמינים בהתאם ליישום
תוכנה אנליטית אינפרא אדום	FLIR	ResearchIR 4.10.2.5	$3,500
Pseudomonas syringae (זן Cit-7)			מסופק באדיבות על ידי ד"ר סטיבן לינדו, אוניברסיטת קליפורניה  ברקלי icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar F	Fisher Scientific	DF0448-17-1