Method Article

מבחן מוריס מים מבוך: אופטימיזציה לזני עכבר ובדיקת איכות סביבה

DOI:

10.3791/52706

⸱

June 22nd, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, Behavioral Neuroscience, West Virginia University, 2Department of Physiology and Pharmacology, West Virginia University, 3Department of Neurology, N. Bud Grossman Center for Memory Research and Care, University of Minnesota, 4Department of Neuroscience, N. Bud Grossman Center for Memory Research and Care, University of Minnesota, 5GRECC, VA Medical Center, 6Center for Neuroscience, Center for Basic and Translational Stroke Research, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מבוך מים של מוריס (MWM) המותאם לשימוש עם מודל עכברי נפוץ של מחלת אלצהיימר. ה-MWM נמצא בשימוש נרחב במודלים של עכברים טרנסגניים. יישום הליך רגיש למתח הרקע של מודל העכבר חיוני לאיתור הבדלים בין קבוצות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבוך המים של מוריס (MWM) הוא מטלה נפוצה להערכת למידה וזיכרון מרחביים תלויי היפוקמפוס במודלים של מחלות עכברים טרנסגניים, כולל הפרעות נוירו-קוגניטיביות כגון מחלת אלצהיימר. עם זאת, למתח הרקע של מודל העכבר בו נעשה שימוש יכולה להיות השפעה משמעותית על הפנוטיפ ההתנהגותי הנצפה, כאשר זנים מסוימים מציגים יכולת למידה טובה יותר ביחס לאחרים. כדי להבטיח שניתן לזהות הבדלים בין עכברים שליליים לטרנסגנים חיוביים, זיהוי הליך אימון רגיש לזן הרקע הוא חיוני. כישלון בהתאמת פרוטוקול MWM למתח הרקע של מודל העכבר עלול להוביל לאימון חסר או יתר, ובכך להסוות את ההבדלים בין הקבוצות בניסויי בדיקה. כאן, מתואר פרוטוקול MWM המותאם לשימוש עם רקע F1 FVB/N x 129S6. זהו זן רקע המשמש לעתים קרובות לחקר ההשפעות תלויות הגיל של עכברי P301L tau מוטנטיים (rTg(TauP301L)4510) על ליקויי הזיכרון הקשורים למחלת אלצהיימר. כמו כן מתוארת אסטרטגיה לאופטימיזציה מחדש, כפי שמוכתבת על ידי סביבת הבדיקה המסוימת בה נעשה שימוש.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים עכבר מהונדסים כבר סייעו בהערכת הפתופיזיולוגיה של מחלת אלצהיימר (AD), כמו גם את הפוטנציאל של התערבויות טיפוליות. משימות קוגניטיביות, כגון מבוך המים של מוריס (MWM), משמשות בדרך כלל עם מודלים אלה כדי לזהות את הקושרת המולקולרית של גירעונות זיכרון ועל מנת להעריך את היעילות של תרופות פרה-קליניות. זה חיוני, עם זאת, כי הטווח הדינמי של המשימה קוגניטיבית להיות רחב מספיק כדי לזהות השפעות טיפול עדינות. עם מודלים עכבר של הספירה, ליקויים קוגניטיביים הם בדרך כלל תלוי גיל, ועכברים להציג ירידות מתקדמות בביצועים (לדוגמא, 1). שימוש במשימה קוגניטיבית רגישה יכול לאפשר זיהוי של הבדלים דקים מוקדם יותר בחיים של בעלי החיים, ובכך להפחית את העלויות הכרוכות בבעלי החיים הזדקנות. לדוגמא, צמצום מספר ניסויי הכשרה ברנס בהיפוקמפוס תלוי מבוך 15-5 הגדיל את הקושי של המשימה, וכתוצאה מכך דetection של גירעונות במודל 3xTg בגיל צעיר יותר מאשר דווח בעבר 2. איתור מוקדם יותר של גירעונות מציע לא רק זמן ניכר וחיסכון בעלויות, זה גם מעלה את הסבירות שניתן לזהות השינויים המולקולריים שבבסיס ליקויים קוגניטיביים.

גורם אחד המשפיע על הרגישות של משימות קוגניטיביות הוא זן הרקע הגנטי של מודל העכבר. לדוגמא, עכברי BALB / ג להפגין ביצועים מעולים במשימות למידה וזיכרון בהשוואה לזנים אחרים, כגון C57BL / 6 3. FVB / N x 129S6 רקע F1 משמש לשני הדגמים המועסקים נרחב ביותר של הספירה, Tg2576 וRTG (TauP301L) 4510 דגמים. זן זה מציג יכולת למידה מעולה בMWM ביחס לזנים אחרים, כולל B6 / עכברי SJL 4. בגלל יכולת למידה מעולה זה, השימוש בבדיקה אחת לאחר הכשרה מקיפה עלולה להסוות הבדלים בין קבוצות כתוצאה מאימון יתר. בנוסף, sensitivity של ניסויי בדיקה עשוי להיות תלוי גיל. הראינו בעבר כי ניסויי בדיקה קודם לכן, לאחר אימון פלטפורמה נסתרת מוגבל, רגישים יותר להבדלים בTg2576 הצעיר בהשוואה לביקורות littermate צעירות transgene-שלילי מאשר ניסויי בדיקה מוכנסים לאחר הכשרה מקיפה יותר 5. לעומת זאת, ניסויי הבדיקה הבאים הכשרה מקיפה רגישים יותר במבוגרים (20-25 חודש) עכברי Tg2576 לעומת המלטה מבוגרת יותר הם ניסויי בדיקה קודם לכן 5. על ידי interspersing ניסויי בדיקה לאורך אימון, הסבירות שמשפט רגיש יזוהה הוא גדל, במיוחד אם בדיקות אורך מתבצעת ואת הרגישות של בדיקה בדיקה מסוימת היא תלוי גיל. איור 1 מציג את הביצועים מעולים של x F1 FVB / N עכברי 129S6 תחת הפרוטוקול מותאם לזן זה, בהשוואה לעכברים של רקע B6 / SJL התאמן תחת פרוטוקול עם הכשרה מקיפה יותר.

MWM הואבדרך כלל חשב לספק אמצעים אמין כי הם לשחזור פני הזמן ומעבדות 6. לדוגמא, הפרוטוקול העיקרי המשמש במקור על ידי 1,7 המעבדה מינסוטה יושם בהצלחה עם שינויים קלים באוניברסיטת מערב וירג'יניה 8. כמו כן, רמות שווה ערך לירידת הערך נצפו בRTG (TauP301L) 4510 עכברים ביחס לשליטה המלטה אם שוכנו בתנאי הפתוגן ללא או קונבנציונלי 9. עם זאת, סביבת הבדיקות יכולה להשפיע על הרגישות של משימת MWM. גורמים כגון תאורה בחדר, פתחי אוורור, טמפרטורה הדרגתיים, ורעשים כולם תורמים לרמזים סביבתיים 4 שיכולים להשפיע על ביצועי סופו של דבר. כאשר המעבדה מינסוטה והביבר הועברו לבניין חדש, עד לירידה של 38% בביצועי wild-type נצפה, צמצום משמעותי את הטווח הדינמי של המשימה ואת היכולת לזהות את גירעונות הקשורים transgene. שינוי בPE זהrformance התרחש למרות עיצוב חדר הבדיקות להיות בגודל שווה ותצורה, ובאמצעות אותו הרמזים חזותיים שימושיים. "מחדש אופטימיזציה" של הפרוטוקול המקורי נדרשה להגדיל את הטווח הדינמי של משימת MWM בסביבת הבדיקות החדשה.

הנה הפרוטוקול המקורי המותאם לשימוש עם F1 FVB / N x רקע 129S6 5 מתואר. בגלל כמה מחקרים מראים לחץ קשור לביצועים ירודים MWM 10 ולפני טיפול יכול להקל גירעון מתח מושרה זה בביצועים 11, פרוטוקול טרום טיפול נועד להסתגל העכברים להקדמה וההסרה של הבריכה לפני בדיקת MWM . בעקבות מראש טיפול, עכברים לעבור הכשרת פלטפורמה גלויה, שבו במה מוגבהת מסומנת בדגל. אימון פלטפורמה גלוי משמש לזיהוי עכברים עם בעיות ביצועים הקשורים להפרעות הסנסורית. תוך שימוש בקריטריונים שמתוארים בהדרת protסעיף ocol, עכברי ביצועים-פסול יוסרו מהבדיקות הבאות של ניסויי הכשרת פלטפורמה ובדיקה סמויים. ליקויים בניסויי אימוני פלטפורמה ובדיקה סמויים מתפרשים כליקויים קוגניטיביים, כי ביצועים הסנסורית הוא בחשבון את הנתונים. לאחר השלמת הכשרת פלטפורמה גלויה, עכברים להתחיל אימוני פלטפורמה נסתרים שבו הפלטפורמה היא שקועה במים ונשארה באותו המיקום היחסי לרמזים חיצוניים. ניסויים שבי הפלטפורמה מוסרת (ניסויי בדיקה) משובצים בכל אימון פלטפורמה נסתר כדי להעריך את ההשפעה של אימון נוסף. בגלל ניסויי בדיקה להתרחש בתחילתו של כל יום, לפני אימון פלטפורמה נסתר נוסף, ניסויי בדיקה מודדים את היכולת של בעלי החיים כדי לזכור את המיקום של הפלטפורמה לאחר עיכוב של 20 שעות, שנחשב למדד לזכרון התייחסות 12. לבסוף, דרכים שבהן פרוטוקול מקורי זה מחדש מותאם כאשר שינויים בסביבת הבדיקותביצועי שליטה שיבשו מתוארים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הליכי הניסוי נערכו בהתאם לסטנדרטים של הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) ואושרו על ידי IACUC המערבי של אוניברסיטת וירג'יניה.

1. טרום טיפול

  1. להגדיר את הבריכה
    1. לתמוך בריכה מראש טיפול ולכן הוא העלה לגובה נוח.
    2. מניחים 2 ליטר מים (21 מעלות צלזיוס) בבריכה מראש טיפול לרמה של כ 1 סנטימטר.
      הערה: אל תוסיף צביעה.
  2. הליך
    1. להביא את העכברים מהביבר לחדר הבדיקות.
    2. ודא זיהוי הנושא (מספר נושא, קעקוע זנב, קליפ אוזן, וכו '.).
    3. הזנב של מארק העכבר עם סמן קבע להבחין עכברים בתוך הכלוב שעבר לפני טיפול בדיקות מאלו שנותרו כדי להיבדק. סמן את כל העכברים בכלוב אחד עם אותו הצבע.
    4. מניחים את העכבר בכוס ההעברה לapproximately 5 שניות. ואז, בעדינות לשפוך את העכבר מחוץ לכוס לבריכה מראש הטיפול.
    5. שימוש בשעון עצר, לאפשר העכבר כדי להישאר בבריכה במשך 20 שניות.
    6. לאחר 20 שניות, מניח בעדינות את הסקופ (ללא לדוג אותו) מול העכבר. בקצרה לאפשר העכבר כדי לחקור את הסקופ, ואם יש צורך, לעודד את העכבר על מנת לקבל את הסקופ על ידי בעדינות הזזה את הסקופ מתחת לעכבר בזמן ההרמה לאט. יש להיזהר שלא להפחיד את העכברים עם הסקופ.
    7. ברגע שהעכבר הוא בסקופ, להעביר אותו בחזרה לכלוב האחזקה.
    8. חזור על נהלים אלה לכל עכבר בכלוב פעם ביום במשך 10 ימים. במרווחי זמן קבועים (למשל אחרי כל חיה), להרים Boli צואה ומצעים מהברכה באמצעות רשת.
    9. יש לשטוף את כוס ההעברה במים במרווחי זמן קבוע (לדוגמא לאחר השלמת כלוב של עכברים).
    10. ברגע שהצעדים אלה הושלמו, יש לשטוף את כוס ההעברה עם מים מספר פעמים, לזרוק את מים מהבריכה, ולשטוף את הבריכה כשתי פעמים עם מים.

2. הדרכת פלטפורמה גלויה

  1. התקנת עכבר ביצועי תוכנה למעקב לדוגמא מציג (ראה טבלה של חומרים).
    1. כייל את הווידאו כדי להתאים את הממדים של המבוך תחת 'התצורה' - "מסננים ואובייקטים" כרטיסייה.
    2. להגדיר מסננים כדי שהתוכנה יכולה להבדיל עכבר מהרקע.
      1. התאם את "הרגישות" מתחת לאזור "מסנן רקע", כך שתוכנת המעקב מזהה את בעלי החיים.
      2. לחץ על האפשרות "קיבל" פעם אחת תוכנת המעקב מזהה את בעלי החיים. בחר באפשרות "העריכה" לאפלת אזורים מחוץ לאזור המבוך.
      3. בחר "מסנן בעלי החיים" המתאים ו" דקות. גודל חיה ".
  2. יצירת גיליונות הפעלה
    1. צור גיליון ריצת רישום כל עכבר, כל מיקום פוטנציאלי, ומקום להערות המכילות מידע על התנהגות חריגה.
    2. מקומות למבחן הפלטפורמה הגלוי שהם אותו הדבר לכל קבוצה של עכברים לקבוע מראש. כך, במשפט הראשון, מראש לקבוע-שהפלטפורמה תוצב בצד הנגדי למקום שבי העכבר ממוקם לתוך המבוך, בצד הימין הקרוב לקיר. למשפט השני, מראש לקבוע-שהפלטפורמה תוצב במיקום שונה לאורך הקיר האחורי לכל עכבר וכי המצב זה יימשך לכל אחד 6 הניסויים.
  3. להגדיר את החדר
    1. וילונות מסתובבים בחדר, כך שכל רמזים מרחביים מטושטשים.
  4. להגדיר את האמבטיה.
    1. הנח את האמבטיה כך שיתאים לתצורה בתוכנת המעקב על ידי הבטחת המבוך תואם עם התקנת התצורה על "התצורה" - כרטיסיית "הגדרת האזור". הערה: helps כדי להבטיח את האמבטיה היא במיקום הנכון לפני מילויו במים כגיגית לא בקלות עברה מילאה פעם אחת.
    2. למלא את האמבטיה במים ברז, ובאמצעות מדחום, להבטיח את טמפרטורת המים היא כ -21 מעלות צלזיוס. ודא שהמים נשארים בתואר אחד מטמפרטורה זו בכל בדיקות, כמו מים קרים יכולים להשפיע על ביצועים במיוחד בעת שימוש בעכברים בגיל 8.
      הערה: אל תוסיף צביעה.
    3. שימוש במקומות שנקבעו מראש, הנח את הפלטפורמה, שבו יש דגל רכוב שמגיע לגובה של 13 סנטימטר והוא 4.5 סנטימטרים X 4.5 סנטימטר עם "S" נועז אופי בצורה בולט על זה, במיקום הראשון של האמבטיה, כך שהוא הוא כ 1 אינץ 'מעל פני השטח של המים.
  5. הליך
    1. קח את העכבר הראשון מהכלוב, לאמת את זיהוי הנושא, לסמן את הזנב באמצעות סמן קבוע של הצבע הנכון, ומקום בכוס.
    2. מניח בעדינות mousדואר לאמבטיה, להפעיל את הטיימר, ולהבטיח שתוכנת המעקב היא מעקב של בעלי החיים. אפשר העכבר עד 2 דקות לאתר את הפלטפורמה. לאחר העכבר מאתר את הפלטפורמה, תאפשר שניות עכבר 20 על הרציף.
    3. אם בעלי החיים מוצאים את הפלטפורמה וממשיך לקפוץ או ליפול, לגרוף את העכבר ולמקם את העכבר על הרציף. אם העכבר ממשיך לקפוץ או ליפול הפלטפורמה, להחזיק את העכבר על הפלטפורמה, כך העכבר מגלה כי נותר על הפלטפורמה מובילה לבריחה מהאמבטיה.
      הערה: העכבר צריך להישאר על הרציף לזמן משולב של 20 שניות; כך, אם העכבר קופץ לאחר 5 שניות, כמות הזמן שנותרה על הפלטפורמה היא 15 שניות ולא לאפס עד 20 שניות.
    4. אם בעלי החיים לא מצליח למצוא את הפלטפורמה בתקופה 2 דקות, לגרוף את העכבר ולמקם אותו על הפלטפורמה במשך 20 שניות.
    5. בעקבות 20 שניות על הפלטפורמה, להסיר את העכבר מהפלטפורמה כפי שנעשה בהכשרת טיפול מראש ומניח את העכבר בהכלוב מחומם דואר מרופד במגבות נייר וחימם ל~ 31 ° C על ידי כרית חימום ומנורת חום למשך 30 שניות. לבצע הערכה תקופתית של טמפרטורת גוף במדחום רקטלי, כדי להבטיח שזנים מסוימים של עכברים או עכברים בגיל מסוים אינם רגישים באופן דיפרנציאלי היפותרמיה הנגרמת על ידי חשיפה למים.
    6. לאחר 2 דקות לכלוב האחזקה עם מנורת החימום, להעביר את העכבר לכלוב ההחזקה רק עם כרית חימום, אבל אין מנורת חום, להתאושש בין ניסויים. סופו של דבר, למקם את כל העכברים מכלוב בבית אחד לאותו כלוב ההחזקה במהלך בדיקה.
    7. נקה את המבוך של פסולת עם נטו לאחר כל עכבר השלים משפט, לשבש רמזי חוש הריח.
  6. חזור על שלבים אלה עבור כל עכבר בקבוצה. אחרי כל עכבר השלים את המשפט הראשון, להעביר את הפלטפורמה למיקום שנקבע מראש השני.
    הערה: הפלטפורמה תישאר באותו מיקום לכל עכבר במשפט אחד ותהיהעברתי למקומות שנקבעו מראש האחרים לניסויים שלאחר מכן. הדבר נעשה כדי להבטיח שעכברי 1) ללמוד שם היא פלטפורמה לברוח מ, 2) לשחות ישירות לפלטפורמה גלויה, ובכך מפגינים יכולת חזותית שלמה, ו 3) אין לי גירעונות מנוע.
  7. לבצע הליכים אלה למשך 6 ניסויים במשך 3 הימים הראשונים של בדיקות. לפיכך, לבצע אימונים גלויים בימי בדיקה 1, 2, ו -3, עם כ 10 דקות בין כל ניסוי (איור 2).
  8. במהלך אימון פלטפורמה גלוי, להשתמש בתוכנת המעקב של בעלי החיים כדי למדוד חביון להגיע הפלטפורמה, לעקוב אחר pathlength של בעלי החיים, ולשחות במהירות. להשיג מדידות אלה מהכרטיסייה "מבוך מים" תחת "רשימה ניסויית" ויצוא ישירות לגיליון אלקטרוני Excel.
    הערה: השימוש ביד טיימר יכול גם להיות מועילה כדי להבטיח את הדיוק של תוכנת המעקב.

הדרכת 3. מוריס מבוך מים נסתר פלטפורמה

  1. Set את החדר
    1. לתלות את הווילונות בחדר לטשטש רמזים מרחביים במעבדה.
    2. הנח רמזים אסטרטגיים על הווילונות. ודא שהרמזים הם גדולים ומכיל צבעים מנוגדים (לשעבר .: שחור ולבן) לנראות טובות יותר. רמזים חכה במרחק וגובה שבו הם גלויים לעכברים מתוך האמבטיה. הערה: הרמזים הם סטטי ולא זזו במהלך הבדיקה.
  2. התקנת תוכנת עכבר ביצועי מעקב
    1. כייל את הווידאו כדי להתאים את הממדים של המבוך תחת 'התצורה' - "מסננים ואובייקטים" כרטיסייה.
    2. הגדר את המסננים כך שהתוכנה יכולה להבדיל עכברים מהרקע.
      1. השתמש באותם הנהלים כפי שמתואר בבדיקות הפלטפורמה הגלויות (שלבים 2.1.2.1-2.1.2.3) כדי להגדיר את המסננים לאימוני פלטפורמה נסתרת מבוך המים של מוריס.
    3. צור ארבעה רביעים שווים בתוך המבוך
      1. לחץאפשרות "אליפסה" תחת הלשונית "הגדרת האזור" ראשון, וליצור מעגל התואם את המבוך על המסך. הערה: בכרטיסייה זו, המבוך בפועל הקים מוצג, כך שהוא מאפשר את האפשרות להתאים את התקנת המחשב עם התקנת המבוך בפועל.
      2. לחץ על האפשרות "המלבן" וליצור ארבעה ריבועים שווים. מניחים ריבועים אלה במסך כדי ליצור ארבעה רביעים שווים בתוך המעגל החדש שנוצר.
    4. צור הפלטפורמות במבוך.
      1. בחר באפשרות "אליפסה", וליצור מעגל בגודל של הפלטפורמה שתשמש. הערה: הצבת הפלטפורמה במבוך מראש יכולה להיות מועילה כדי ליצור אליפסה בגודל של הפלטפורמה המדויק.
      2. הנח את מיקום הפלטפורמה החדש שנוצר במרכז ברבע היעד. (מומלץ לשם "יעד" זה אובייקט להבחין פלטפורמות הנכונות משאר). צעד קריטי: בתיבה רק BELow "רשת", בחר באפשרות "להפסיק" תחת "הדק" עבור פלטפורמת היעד. זה יגרום התכנית להפסיק פעם אחת על העכבר מגיע לפלטפורמה.
      3. צור שלושה תחומים פלטפורמה זהים אחרים, ולמקם אותם במיקומים המדויקים ברביעים האחרים. אל תבחר "עצור" באפשרות "ההדק".
  3. יצירת גיליונות הפעלה
    1. צור גיליון ריצת רישום כל עכבר, כל משפט, מקום לכתוב את הזמן כדי להגיע לפלטפורמה, וחלל לציין התנהגות חריגה (טבלה 1).
    2. טרום לקבוע את נקודת השחרור של כל עכבר באופן פסוודו. השתמש באפשרות פסאודו אקראיים, כך שהמרחק לפלטפורמה הוא שווה כל יום, כל אחד 4 המקומות משמש באותה מידה, והזווית מההתחלה לפלטפורמה (כלומר., משמאל או מימין) הוא מאוזנת בתוך ובין ימים.
      הערה: המיקום של הפלטפורמה במנוסהגיליון כדי להבטיח את המיקום של הפלטפורמה לא זז ממקומו המקורי. ודא שהפלטפורמה היא במרכזו של אחד מארבעת האזורים שנוצרו בתוכנת המעקב.
      הערה: אם בדיקת אורך מתנהלת בגילים שונים, להזיז את הפלטפורמה למיקום חדש בכל גיל.
  4. להגדיר את המבוך
    1. התאם או מבוך מים או המצלמה כך שיש התאמה בין המבוך והגדרת התצורה ב" התצורה "- כרטיסיית" אזור הגדרה ".
    2. תווית ארבעה רביעים סמויים של המבוך (N, S, E, W). בדוק שהמשחק הבאים עם התצורה בתוכנת המעקב כדי להבטיח עכברים ששוחרר מנקודות המוצא הנכונות.
      שלב קריטי: מקום תוויות אלה מחוץ למבוך ואת המבט של בעלי חיים שחיה בהתחשב בכך שרמזים בתוך המבוך מהווים משימה הלא-מרחבי, שאינה תלויה בהיפוקמפוס.
    3. מלא את המבוך עם wate הרזr (21 מעלות צלזיוס כ), כך שהפלטפורמה היא כ 5 מ"מ מתחת לפני השטח של המים.
    4. מניחים את הפלטפורמה במיקום שנקבע מראש.
      הערה: המיקום של הפלטפורמה יישאר זהה לכל העכברים שנבדקו בכל הימים וניסויים.
    5. השתמש צבע גוף לבן לא רעיל כדי להפוך את המים אטומים. האם זה כדי להבטיח שחלקו העליון של הפלטפורמה הוא בלתי נראה מגובה העיניים של בעלי החיים תוך כדי שחיה.
  5. הליך
    1. קח את העכבר מהכלוב, לסמן את הזנב באמצעות סמן קבוע של הצבע הנכון, ואת המקום בכוס.
    2. בעדינות לשפוך את העכבר למבוך, כך שהוא נכנס עם פנים לקיר. הערה: כל עכבר יוצב באותו מקום מוצא למשפט ייחודי.
    3. במהדורה הראשונית של העכבר, להתחיל את שעון העצר ולעמוד באזור שבו הבוחן הוא לא נראה בקלות על ידי העכברים. ודא שתוכנת מעקב חיה מעקב בעלי החיים כראוי.
    4. ברגע שבעלי החיים מגיעים לפלטפורמה, לאפשר לו להישאר על הפלטפורמה במשך 15 שניות.
      הערה: זה מאפשר לבעלי החיים לאוריינט למיקום המרחבי שלו בתוך החדר.
    5. לאחר 15 שניות על הפלטפורמה, להסיר את החיה מהמבוך ולהחזיר את העכבר לכלוב המחומם.
    6. אם העכבר מוצא את הפלטפורמה וממשיך לקפוץ או ליפול לפני 15 שניות, לגרוף את העכבר ולמקם אותו בחזרה על הפלטפורמה לשארית שניות 15 כך העכבר לומד לקשר את הפלטפורמה עם בריחה.
    7. אם העכבר לא מאתר את הפלטפורמה בתוך 60 שניות, בעדינות לגרוף את העכבר ולמקם אותו על הרציף. לאפשר לו להישאר על הפלטפורמה במשך 15 שניות, ולאחר מכן להסיר את החיה עם את הסקופ ולהחזיר אותו לכלוב המחומם.
    8. נקה את המבוך של פסולת עם רשת לשבש רמזי חוש הריח.
    9. חזור על נהלים אלה לעכברים שנותרו בקבוצה. כך, במשך ימי בדיקה 4 עד 9, לנהל ארבעה ניסויים של רכבת פלטפורמה מוסתרתing ליום כ 20 דקות בין כל ניסוי.
    10. לשנות את המיקום pseduorandomly מתחיל לכל ניסוי. לפיכך, במהלך משפט 1, לשחרר את כל העכברים מאותו מקום ההתחלה, ולאחר מכן לחזור על התהליך מנקודת התחלה שונה לניסויים שלאחר מכן. בכל יום, להשתנות נקודות השחרור כדי להבטיח חיות לא לפתח אסטרטגיה שאינה מרחבי, שאינה תלויה בהיפוקמפוס מוטורית. לדוגמא, אם עכברים משתחררים מN, S, E, ונקודות W ביום אחד, לא לשחרר אותם באותו סדר היום הבא.
    11. במהלך אימון פלטפורמה נסתר, להשתמש בתוכנת המעקב של בעלי החיים כדי למדוד חביון להגיע הפלטפורמה, pathlength של בעלי החיים, ואחוז זמן או להרחיק את החיה מבלה בכל רבע מבוך. להשיג מדידות אלה מהכרטיסייה "מבוך מים" תחת "רשימת ניסוי" וניתן לייצא ישירות לגיליון אלקטרוני Excel.
      הערה: השימוש ביד טיימר מבטיח את הדיוק של המעקבתוכנה.

4. ניסויים בדיקה

  1. התקנת תוכנת עכבר ביצועי מעקב
    1. השתמש באותם נהלים כמו בהליך הפלטפורמה הנסתר מבוך המים מוריס (שלבים 3.2.1-3.2.4.3) עם חריג אחד. צעד קריטי: לניסויי בדיקה, להבטיח את אפשרות "העצור" ל" הדק "כבוי במהלך ניסויי בדיקה. זה ימנע את התכנית מהעצירה כאשר עכבר חוצה את אזור הפלטפורמה.
  2. יצירת גיליונות הפעלה
    1. צור גיליון ריצת רישום כל עכבר, כל משפט, וחלל לציין התנהגות חריגה. טרום לקבוע את נקודת השחרור בניסויי הבדיקה כזו שהם לסירוגין בין שני הצדדים מנוגדים הפלטפורמה. כך, מראש לקבוע את נקודות השחרור כך שהעכברים לא ישוחררו משני הצדדים הסמוכים זה לפלטפורמה.
  3. הליך
    1. לערוך ניסויי בדיקה דומים לאימון פלטפורמה נסתר, עם exception כי אין פלטפורמה היא במבוך.
    2. שחרר את העכבר מנקודת שחרור שנקבעה מראש. במהלך משפט הבדיקה, להסיר את הפלטפורמה ויש העכבר 60 שניות לשחות במבוך.
    3. במהלך בדיקה, לנהל 4 ניסויי בדיקה. לשנות את הנקודה של העכברים בין ניסויי הבדיקה השחרור. כך, לשנות את הנקודה של משפט הבדיקה הנוכחי שחרור מזו של משפט הבדיקה הקודם.
    4. במהלך ניסויי הבדיקה, להשתמש בתוכנת המעקב כדי לעקוב אחר בעלי החיים pathlength של בעלי החיים, אחוז זמן החיה מבלה בכל רבע של המבוך, ואת מספר הפעמים שחיה שוחה על פני השטח בעלת פלטפורמה בעבר. להשיג מדידות אלה מהכרטיסייה "ניתוח נתונים" ואת הכרטיסייה "מבוך מים" תחת "רשימה ניסויית", והיצוא ישירות לגיליון אלקטרוני Excel.
      הערה: השימוש ביד טיימר יכול גם להיות מועילה כדי להבטיח את הדיוק של תוכנת המעקב.
    5. לנהל משפט בדיקה לפניאימון פלטפורמה מוסתר בימים 6, 7, 8 ו -10 (איור 2). לאחר ניסויי בדיקה אלה, לבצע 4 ניסויים של פלטפורמה מוסתרת אימון בכל יום. לפיכך, לבצע בדיקה ראשונה, ומייד אחרי אימון פלטפורמה נסתרת לכל העכברים באמצעות אותם ההליכים כאמור בסעיף 3. בניגוד לכך, לא לבצע אימוני פלטפורמה נסתרים נוספים לאחר משפט הבדיקה ביום 10.

5. ניתוח

  1. הדרכת פלטפורמה גלויה
    1. לנהל מדידות חוזרות ANOVAs בנפרד ל( א) pathlength, חביון (ב) כדי למצוא את הפלטפורמה, ו- (ג) לשחות במהירות, עם transgene (או משתנה אחר, כגון טיפול) כבין-נושא משתנה וימים או בלוקים הכשרה כ משתנה בתוך-הנושא. הערה: עיצובים מורכבים יותר, התייעצות עם סטטיסטיקאי יכולה להיות שימושית. ראה 8,13 לקבלת מידע על קבוצת גדלים מספיק כוח משימה זו עם דגמים נפוצים של אלצהיימר כראוי7; של מחלה.
    2. אוזלת ביצועים
      1. לזהות עכברי ביצועים-פסול, כולל עכברים שלהפגין אוזלת חזותית או מנוע, או בעלי חיים שלא לרכוש את הרכיבים פרוצדורליים של הבדיקה, ולהסיר את העכברים האלה מהניתוחים סטטיסטיים הבאים של פלטפורמה נסתרת וביצועי בדיקה.
        1. לחשב את זמן האחזור הממוצע ולשחות במהירות ליום האחרון של אימון פלטפורמה גלוי לכל עכבר. הסר עכברים עם אמצעי 2 סטיות תקן מעל הקבוצה מתכוונים, מכיוון שהדבר עלולה להצביע על מנוע או ליקויי ראייה.
        2. לזהות ולהסיר עכברים שלא הצליחו לכוון לאו בצע את הסקופ הבריחה, או עכברים מציגים התנהגות חריגה, כגון שחייה פקק-בורג או צף.
  2. הדרכת מבוך מוריס מים נסתרת פלטפורמה
    1. לנהל ANOVAs צעדים חוזר ונשנה ב( א) pathlength, חביון (ב) כדי למצוא את הפלטפורמה הנסתרת, (ג) לשחות במהירות, ו- (ד) זמן אחוזים או אחוזיםמרחק ברבע עם transgene כמשתנה והניסויים בין-הנושא כמשתנה בתוך-הנושא.
  3. ניסויים בדיקה
    1. מהירות השחייה
      1. לנהל ANOVAs צעדים חוזרים ונשנים במהירות לשחות על פני ניסויי בדיקה עם transgene כמשתנה וניסויים בין-נושא כמשתנה בתוך-הנושא.
    2. מדד מעבר פלטפורמה
      1. שימוש בתצורת משפט הבדיקה לכל עכבר, מדד מעבר פלטפורמה (PCI) מחושב באמצעות הנוסחא הבאה: PCI = מספר הפעמים שהעכבר חוצה את מיקום היעד - מעברים של המיקום המקביל ממוצע ברביעים 3 האחרים.
        הערה: זה נערך כדי לקבוע אם העכבר משתמש באסטרטגית חיפוש מרחבית, כפי שצוינו על ידי יותר מעברים על מיקום הפלטפורמה המאומן, או אסטרטגיה לא-מרחבי של thigmotaxic שחייה, כפי שצוין על ידי מעברים כ שווים על פני כל ארבעת המקומות.
      2. התנהגות חוזרת ונשניתANOVAs אמצעים על PCI עם transgene כמשתנה והניסויים בין-נושא כמשתנה בתוך-הנושא.
    3. זמן אחוזים או מרחק אחוזים ברביע
      1. לחשב את זמן אחוזים או להרחיק כל עכבר מבלה בארבעת הרביעים של המבוך. לנהל ANOVAS צעדים חוזר ונשנה באחוזים מהזמן, או המרחק, עם transgene כמשתנה והניסויים בין-הנושא כמשתנה בתוך-הנושא. השתמש בזמן אחוזים כדי לקבוע אם נמצא בשימוש באסטרטגית חיפוש המרחבית; ממצאים של כ 25% מזמן ברבע היעד מצביעים עכברים מבצעים ברמת סיכוי ולא משתמשים באסטרטגית חיפוש מרחבית.
    4. O / N שוכח
      1. השווה את ההשהיה של מעבר אזור הפלטפורמה במשפט הבדיקה להשהיה כדי לאתר את הפלטפורמה על המשפט האחרון של היום הקודם. הערה: אם ההשהיה של מעבר הפלטפורמה במשפט הבדיקה היא באופן משמעותי יותר מחביון למצוא platforמ 'במהלך המשפט האחרון של פלטפורמה מוסתרת ביום הקודם, אז O / שכחת N של מיקום הפלטפורמה מתרחשת.
  4. ניתוח בדיעבד
    1. עקוב RMANOVAs משמעותי עם השוואות פוסט הוק של transgene בכל ניסוי.

6. דוגמא של Re-אופטימיזציה לסביבה חדשה בדיקה

  1. טרום טיפול. לנהל מראש טיפול בחדר הדיור. מניחים את הכלובים ללא מכסים על עגלת תחבורה לכל הפגישה.
    הערה: יעדים לשינוי של ההליך שלפני הטיפול הם להציג יותר בהדרגה מניפולציות מטפל וחשיפה למכשירי התחבורה (כוס ולגרוף) ולהגדיל את עכברי הזמן נמצאים בכלוב בבית ללא מכסי microisolator ומחוץ לכלוב שלהם ב שדה פתוח ותנאי אור בהירים.
    1. ימי 1 ו -2
      1. לאפשר עכברים להסתגל לידות להיות בכלוב, ואחריו נוגע ללב עדין, ואחרי שהרים לבדיקת קעקוע וסימון של הזנב. החל ביום 2 של טרום טיפול, למקם את חומר קינון נוסף בכלוב כדי לספק חומר נוסף לבניית קן ומחסה תוך מכסים הוסרו 9.
    2. ימים 3 ו -4
      1. מניחים את כוס התחבורה, סקופ, והדגל של הפלטפורמה גלויה בתיבה טרום הטיפול ולאפשר עכברים לחקור עבור 2 ניסויים ב2 דקות לכל משפט.
      2. אין להשתמש במים בפרוטוקול זה בקדם-טיפול. במקום זאת, להבטיח את התיבה מכילה מצעים נקיים מספיק כדי לכסות את הרצפה וריחנית עם כמות קטנה של חול מלוכלך נשי וגברי, אם שני המינים נבדקים. לשנות את המצעים כל יום.
    3. יום 5
      1. עכברי מקום בתיבה טרום הטיפול המכילים חול מלוכלך קלה ודגל הפלטפורמה הגלוי ל3 ניסויים, במשך 20 שניות כל אחד. השתמש בכוס ואת הסקופ להעביר את העכברים ומהתיבה.
  2. הדרכת פלטפורמה גלויה
    1. טמפרטורת מים בגדר 27 ° C (בשימוש שיגרתי עבור סביבת בדיקות מינסוטה).
    2. להחזיר את העכברים לכלוב בבית על רכישת פלטפורמת הרמז.
    3. לאפשר עכברים עד 60 שניות כדי לרכוש את הפלטפורמה גלויה.
    4. לנהל אימונים בהיקף של 3 ניסויים ליום במשך 5 ימים.
  3. הדרכת פלטפורמה מוסתרת
    1. לשנות רמזים חזותיים. פרט לוילון אחד גדול כדי לטשטש את המטפל, או למנוע או להפוך את הווילונות אחרים צרים המקיפים את הבריכה כדי שתהיה לי חדר פתוח יותר. להניח חפצים נוספים על החדר (למשל, מדפים חשופים, פוסטר בד שחור עם סמל לבן, כדור חוף שחור ולבן, משפכים שחורים גדולים, מחברות, ובובת פרווה שחורה), וכתוצאה מכך cue- חזותי מאוזן אבל מגוון יותר להגדיר מאשר בשימוש בעבר.
    2. בגין ההשלמה נסתרת הכשרת פלטפורמת 72 שעות הבאות של Traini פלטפורמה הגלויng, עם מרווח של כ -30 דקות בין ניסויים.
    3. לנהל אימונים בהיקף של 2 ניסויים במשך 8 ימים.
  4. ניסויים בדיקה
    1. לבצע ניסויי בדיקה 72 שעות הבאות ניסויי אימונים נסתרים 8, 12, ו16.Include מרווח של 3 ימים בין ניסויי 8-9, ו12-13 אימונים.
    2. הגדר את משך זמן בדיקה למשך 30 שניות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו מבוך המים של מוריס כדי לחקור את ההשפעות של בטא-עמילואיד (עכברי Tg2576) וטאו P301L מוטציה (RTG (TauP301L) 4510 עכברים) בזיכרון המרחבי התייחסות (למשל, 1,5,7,8). איור 3 הוא תוצאת הנציג דיווחה במחקר שלנו בוחנת את ההשפעה של ביטוי גיל המבוגר טאו P301L על למידה וזיכרון 8, ניצול א איכות הסביבה בדיקות כדי להעריך את היכולות המוטוריות והחזותיות, עכברים הושוו על פני בלוקים הכשרת פלטפורמה גלויה, שבו כל בלוק אימונים כללו 3 ניסויים. Pathlen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משימת MWM נעשתה שימוש נרחב על מנת להעריך את למידה וזיכרון המרחביים. עם זאת, על חוסנו של משימה זו יכול להיות מושפע מגורמים רבים ודורש אופטימיזציה עבור שני מתח הרקע וסביבת בדיקות. כפי שניתן לראות באיור 4, באותו פרוטוקול אימון ומיושם רמזים חזותיים המשמשים בשני חדרים שונים בדיקות (גודל שווה ערך ופריסה) הניב ביצועי בדיקה שונים באופן משמעותי. מאז תכונות רבות של חדר הבדיקות עשויות לתרום לרמזים מרחביים 4, הועלה שערה ששני החדרים היו שונים באופן משמעותי בדרך כלשה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי רפואה כלליים (ריד / אנגלר-Chiurazzi - U54GM104942), המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (אש - R01NS33249, R01NS63249 וR01NS79374), Cobre (אנגלר-Chiurazzi - P20GM109098), אלצהיימר האגוד (ריד - NIRG-12-242,187), WVU פקולטה מחקר הסנאט גרנט (ריד), מענק WVU PSCOR (ריד), וקרנות פנימיות ממכללת WVU של משרד דיקן הרפואה (אנגלר-Chiurazzi). התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של NIH או אגודת אלצהיימר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תוכנת מעקב צופהBiobserveתוכנה מסוימת זו אינה דרישה - ישנן מערכות מעקב אחרות זמינות
מקדים בבריכהמידות כ-1 רגל רוחב x 2 רגל אורך x 1.5 רגל
עומק1 ליטר
סקופ
רשת קטנה
שעון
צבעניתן להשתמש בכל צבע; עם זאת, רוב תוכנות המעקב דורשות שהצבע יהיה מנוגד לצבע החיה.
פלטפורמהצבע צריך להיות מנוגד לזה של
מבוך מוט
וילון וילונות
אמבטיהבדרך כלל בצבע לבן; בקוטר של כ-4 מטר
פלטפורמהצבועה באותו צבע כמו המים
טיפול פלסטיק עצר טמפרה לבן לא רעיל גלויה עגולה נסתרת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). The Journal of Neuroscience. 25, 10637-10647 (2005).
  2. Attar, A., et al. A shortened barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 8, e80355(2013).
  3. Johnson, J. M., Bailey, J. M., Johnson, J. E., Newland, M. C. Performance of BALB/c and C57BL/6 mice under an incremental repeated acquisition of behavioral chains procedure. Behavioural Processes. 84, 705-714 (2010).
  4. Crawley, J. N. What's wrong with my Mouse Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 1st edition, Wiley-Liss. 94-95 (2000).
  5. Westerman, M. A., et al. The relationship between abeta and memory in the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of Neuroscience. 22, 1858-1867 (2002).
  6. D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research Reviews. 36, 60-90 (2001).
  7. Santa Cruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309, 476-481 (2005).
  8. Hunsberger, H. C., et al. Effect size of memory deficits in mice with adult-onset P301L tau expression. Behavioural Brain Research. 272, 181-195 (2014).
  9. Yue, M., Hanna, A., Wilson, J., Roder, H., Janus, C. Sex difference in pathology and memory decline in rTg4510 mouse model of tauopathy. Neurobiology of Aging. 32, 590-603 (2011).
  10. Sandi, C. The role and mechanisms of action of glucocorticoid involvement in memory storage. Neural plasticity. 6, 41-52 (1998).
  11. Hölscher, C. C. impairs performance in spatial water maze learning tasks. Behavioural Brain Research. 100, 225-235 (1999).
  12. Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 11, 47-60 (1984).
  13. Reed, M. N., Liu, P., Kotilinek, L. A., Ashe, K. H. Effect size of reference memory deficits in the morris water maze in Tg2576 mice. Behavioural Brain Research. 212, 115-120 (2010).
  14. Huang, Y., Zhou, W., Zhang, Y. Bright lighting conditions during testing increase thigmotaxis and impair water maze performance in BALB/c mice. Behavioral Brain Research. 226, 26-31 (2012).
  15. Baker, R. Water maze. , Available from: http://www.watermaze.org (2013).
  16. Ivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puolivali, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behavioural Brain Research. 141, 207-213 (2003).
  17. Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Morris Water MazeSpatial LearningMemory AssessmentMouse Strain OptimizationHidden Platform TrainingProbe TrialsVisual Platform TaskAlzheimer s Disease ModelFVB N x 129S6 BackgroundCognitive Deficit Detection

Related Articles