הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

8.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52754

⸱

23 באפריל 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

במאמר זה

סיכום

מוצג פרוטוקול להדפסה רובוטית של ספרואידים של תאים סרטניים בפורמט צלחת של 96 בארות בתפוקה גבוהה באמצעות מערכת דו-פאזית מימית.

תקציר

ספרואידים של תאים סרטניים מציגים מודל רלוונטי במבחנה של גידולים אווסקולריים ליישומים לבדיקת תרופות נגד סרטן. פרוטוקול מפורט לייצור ספרואידים חד-תרבתיים וקו-תרבויות בפורמט צלחת של 96 בארות בתפוקה גבוהה מתואר בעבודה זו. גישה זו משתמשת במערכת דו-פאזית מימית כדי להגביל תאים לטיפה של השלב המימי הצפוף יותר השקוע בתוך השלב המימי השני. הטיפה מונחת על פני הבאר ושומרת על תאים בסמיכות ליצירת ספרואיד יחיד. טכנולוגיה זו הותאמה למטפל בנוזלים רובוטיים כדי לייצר ספרואידים מבוקרי גודל ולזרז את תהליך ייצור הספרואידים ליישומי סינון תרכובות. ספרואידים שטופלו בתרופה בשימוש קליני מראים ירידה בכדאיות התאים עם עלייה במינון התרופה. השימוש בצלחת מיקרו-באר סטנדרטית ליצירת ספרואידים מקל על ניתוח הכדאיות של תאים סרטניים של ספרואידים שטופלו בתרופות עם קורא מיקרו-צלחות. טכנולוגיה זו פשוטה ליישום הן באופן רובוטי והן עם כלים אחרים לטיפול בנוזלים כגון פיפטות ידניות.

מבוא

מבחני מבוססי תאים לספק כלי חשוב לפיתוח והגילוי של תרופות אנטי-סרטניות חדשות. 1,2 מבחינה הסטורית, תרבויות monolayer של תאי הסרטן להיות מועסקת לחקור את היעילות של תרכובות מועמד מפני סוגים מסוימים של תאים סרטניים. קלות התחזוקה של תרבויות monolayer בתרבות צלחות סטנדרטית, התאימות של צלחות סטנדרטיים עם כלים רובוטיים מסחריים לתוספת של חומרים כימיים, ועם ציוד הקרנה לניתוח במורד הזרם של תגובות תאיות לתרכובות כימיות הם היתרונות העיקריים שהופכים את תרבויות 2D כלי אטרקטיבי לבדיקת סמים. 3 למרבה הצער, מבחני תא monolayer לעתים קרובות אינם מצליחים לחזות את היעילות של תרכובות in vivo, מה שהופך את פיתוח תרופות וגילוי תהליך יקר מאוד. 4,5 למרות השקעה משמעותית ומאמץ על ידי חברות תרופות ויחידות אקדמיות, ~ 1% בלבד תרופות אנטי-סרטני תרופות בניסויים קליניים אושרועל ידי ה- FDA בשני העשורים האחרונים. 6 פער בין תרבויות 2D and 3D הסביבה המורכבת של תאי סרטן בגוף חי הוא חסרון עיקרי של מערכות תרבות monolayer. 7 לכן, ההקרנה של תרכובות מועמד נגד תאים סרטניים בסביבה שדומה יותר ל סביבת גידול 3D עשויה לזרז פיתוח של תרופות כימותרפיות רומן. 8

spheroids תאים סרטניים להציג מודל 3D גידול רלוונטי במבחנה. 9,10 Spheroids הוא אשכולות קומפקטיים היוצרים באמצעות הרכבה ספונטנית או מושרה של תאים סרטניים על משטחים שאינם חסיד או בהשעיה תוך שימוש בטכניקות כגון בקבוק טווה, כיסוי נוזל, מיקרו microfabricated . גם מערכים, מיקרופלואידיקה, וטיפות תלויות 11-16 Spheroids לחקות תכונות עיקריות של גידולים מוצקים כוללים גיאומטריה ותחבורה מוגבלת של חמצן, חומרי מזון, ותרכובות תרופה לאזור המרכזי; ומכאן, שהם להתחדש respon התרופה באופן הדוק יותרse של גידולים מוצקים בהשוואה לתרבויות monolayer. 17-19 למרות היתרון הבולט הזה, spheroids אינו בשימוש שיגרתי עבור הקרנה של תרכובות כימיות כנגד תאים סרטניים. קושי לייצר spheroids בגודל אחיד בהגדרת תפוקה גבוהה סטנדרטית שתואמת לרובוטיקה זמינה מסחרי וכלים הקרנה / הדמיה פוגע שילוב של תרבות אליפטית לצנרת פיתוח תרופות. למרות שחומרים מותאמים אישית וצלחות הפכו זמינים מסחרי לאחרונה לתת מענה לצורך זה, שיקולי עלות להרתיע השימוש הנרחב שלהם.

שתי טכניקות עיקריות עם היכולת לייצר spheroids בגודל עקבי בתפוקה גבוהה להשתמש פלטפורמת ירידת תלייה חדשה ומיקרו-בארות microfabricated. 13,16,20 עם זאת, שתי הגישות דורשות צלחות ומכשירים שהם יקרים כדי להמציא ולא נוחים למשתמשי קצה מיוחדים במרכזי מחקר ליבה והפרמצבטיקה בי EF הגדול ביותרמבצרים לגילוי של תרופות אנטי-סרטניות חדשות מתקבלות. למרות שיפור מסוים ביציבות של טיפות המכיל תא עם עיצוב האחרון של תליית צלחות ירידה, כל חור אחר רק של הצלחת עדיין משמש בתרבות, כדי למנוע התפשטות / מיזוג של טיפות. 16 זה מקטין את התפוקה ניסיונית באופן משמעותי. בנוסף לסמים והתחדשות קשה עם ידני או רובוטית pipetting וspheroids צריך להיות מועבר לתוך צלחת סטנדרטית לאנליזה ביוכימית כי תצורת צלחת זה לא בקלות בקנה אחד עם ציוד הקרנה קונבנציונלי כגון קוראי צלחת. 21 מיקרו-בארות מפוברקות באמצעות ליתוגרפיה הרכה גם לאפשר ייצור אליפטית גודל מבוקר. 13,20 עם זאת, אי התאמה של פלטפורמה זו עם כלים pipetting סטנדרטיים מונעת טיפול של spheroids הבודד עם תרכובות סמים / ריכוזים שונים, חושפת את כל spheroids למצב טיפול בודד. לכן, שיטה זו אינה מתאימה לגבוההקרנת מתחם תפוקה שדורשת בדיקות סימולטני של תרכובות / ריכוזים מרובים.

כדי להתגבר על המכשולים הללו, טכניקה חדשה לייצור תפוקה גבוה של spheroids תאים סרטניים בגודל באופן עקבי ב96-גם צלחות סטנדרטי פותחה. 22,23 הגישה מבוססת על מערכת פולימרים מימית שני שלבים (ATPS) עם פוליאתילן גליקול ( לאחרונה PEG) וdextran (DEX) כמו פולימרים יוצרי שלב. 24 ATPSs כבר נוצל במגוון רחב של יישומים ביולוגיים תא הרומן לאפשר micropatterning תא ומקומי מסירה של חומרים כימיים ביולוגיים לתאים בתקשורת מימית מאוד. 25-32 כדי ליצור אליפטית, תאי סרטן מעורבבים עם שלב DEX המימי וירידה תת-microliter של ההשעיה וכתוצאה מכך הוא pipetted לפתרון שלב PEG המכיל גם הטבילה מימית. הירידה נשארה immiscible מהשלב הטבילה ותאי גבולות כדי להקל על היווצרות אליפטית. שֵׁדוֹןortantly, שלב הטבילה המימי מאוד מספק חומרים מזינים לתאים של אליפטית וממזער את הבעיה הידועה של אידוי תקשורת משותפת לכמה מבחני אחרים שגורמים לשינויים בosmolality תקשורת ותנודות של ריכוזי תרופה. טכניקה זו מאפשרת ייצור אליפטית וטיפול תרופתי רק באמצעות חומרים כימיים, זמינים מסחרית וכלים pipetting ב96-גם צלחות סטנדרטית. חשוב לציין, ניתוח של תגובות תאיות של spheroids מתבצע באותה הצלחת באמצעות מבחני ביוכימיים סטנדרטיים וקוראי צלחת. הקלות של עבודה עם ATPS וכושר הסתגלות של הגישה לטיפול נוזל רובוטית עושה דור תפוקה גבוה של שני מונו-תרבות ושיתוף התרבות spheroids טכניקת מעבדה פשוטה. גישה חדשה זו תהיה צעד גדול קדימה לכיוון אינטגרציה של spheroids תאים סרטניים בתהליכי פיתוח תרופות וגילוי עם תפוקת בדיקות משופרת ועלות-תועלת (מספר גדל והולך של תרכובות וredu נבדקוצריכת CED מגיב) ויעילות (הפחתת ידיים על זמן).

פרוטוקול מפורט לייצור הרובוטית של spheroids תאים סרטניים ב96-גם צלחות בגישת ATPS מתואר להלן. בנוסף, פרטים של טיפול התרופתי של spheroids וכתוצאה מכך וניתוח במורד הזרם של תגובות תאיות באמצעות assay ביוכימיים מסחרי מוצגים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מערכת שלב שתי פולימרית מימית (ATPS)

  1. שוקל 0.5 גרם של פוליאתילן גליקול (PEG) (MW: 35,000) ולהוסיף אותו ל9.5 מיליליטר של מדיום גידול מלא בחרוטי 15 מיליליטר סטרילי כדי להכין 10 מיליליטר של 5% (w / v) שלב PEG המימי.
    הערה: הוספת מחצית בינונית לחרוטים הראשונים ואחרי הוספת הפולימר ולאחר מכן את יתרת הסכום של מדיום ממזער הידבקות של הפולימר לקירות חרוטי ומסייע הפולימר יתמוסס מהר יותר.
  2. שוקל 0.128 גרם של dextran (DEX) (MW: 500,000) ולהוסיף אותו ל.872 מיליליטר של מדיום גידול מלא בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge סטרילי כדי להכין 1 מיליליטר של 12.8% (w / v) שלב DEX המימי.
  3. מערבולת שני פתרונות לדקות על 1 לפזר הפולימרים במדיום.
  4. שמור את שני הפתרונות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להבטיח פירוק ותערובות הומוגנית. שמור את הכובעים מעל פני המים, כדי למנוע האפשרות של זיהום של פתרונות מהאמבטיהמים.
  5. טען את פתרון שלב PEG לתוך מזרק סטרילי, פלסטיק ולהעביר אותו דרך מסנן מזרק של גודל נקבובית 0.2 מיקרומטר כדי להסיר זיהומים.
    הערה: מלא את המזרק עם פתרון PEG, למקם אותו בהכנסה של המסנן על גבי צינור חרוטי ותוך שימוש בכוח, לדחוף את הפתרון באמצעות המסנן לאט. זה נורמלי לחוות התנגדות נגד תנועה של בוכנת המזרק. הפסד קטן של פתרון הפולימר מתרחש כחלק מהפתרון יישאר במסנן, אבל ריכוז הפולימר לא ישתנה.
  6. פיפטה 10 μl של פתרון שלב DEX ולדלל אותו ב 10 μl של מדיום בצינור נפרד ללגרום 6.4% (w / v) פתרון שלב DEX. לשאוב מפתרון שלב PEG 100 μl ומוציא אותו לתוך צלחת פטרי.
    1. לוותר 0.5 μl של 6.4% (w / v) פתרון שלב DEX לפתרון שלב PEG. חזותי לאשר הקמת ATPS מוצלחת על ידי התבוננות ירידת DEX תחת מיקרוסקופ. גבול הירידהצריך להישאר גלוי, המצביע על נוכחותם של שני שלבים יציבים, נפרדים מימי.
  7. אחסן את המניה המימית PEG ופתרונות שלב DEX ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    הערה: מומלץ שפתרונות פולימר מוכנים טריים לפני כל ניסוי ושימוש בתוך 24 שעות של אחסון.

2. הכנה לSpheroids Cell ההדפסה של הסרטן

  1. לגדל תאי סרטן של עניין (למשל, תאי סרטן השד מד"א- MB-157) ל- 90% -100% monolayer מחוברות. למד"א-MB-157 תאים, להשתמש בינוני מורכב DMEM המכיל 10% FBS, גלוטמין 1%, ואנטיביוטיקת 1%.
    1. קציר תאים באמצעות חיץ ניתוק תא (על פי הפרוטוקול של היצרן) ולטעון את ההשעיה לחרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה זה במשך 5 דקות ב173.3 XG, להסיר supernatant, ותאי resuspend ב 1 מיליליטר של מדיום גידול שלם.
  2. תאי עומס על hemocytometer ולספור אותם על מנת לחשב את המספר הדרוששל תאים לצפיפות תאי אליפטית רצויה. Monolayer ומחוברות של מד"א-MB-157 תאים שגודלו בבקבוק T75 בדרך כלל נותנת ~ 7 x 10 6 תאים.
    הערה:. צפיפות תאים דרושה לירידת נפח כדי ליצור אליפטית אחת תהיה תלויה בסוג התא 22 לדוגמא, צפיפות של 1.5 x 10 4 או גדולים יותר למד"א-MB-157 תאים מומלצת לכל טיפת שלב DEX 0.3 μl ל להבטיח היווצרות אליפטית יחידה.
  3. תאי צנטריפוגה בפעם שנייה במשך 5 דקות ב173.3 XG וresuspend אותם בנפח מתאים של מדיום גידול להתרכז תלוי על צפיפות תאים רצויה.
    הערה: לדוגמא, אם 7 x 10 6 תאים סרטניים נקצרו, הנפח הכולל של השעיה תא הנדרשת ליצירת אליפטית של צפיפות 1.5 x 10 4 תאים בירידת שלב DEX 0.3 μl יהיה 140 μl. עם זאת, בשל דילול עם פתרון שלב DEX בשלב הבא, להשתמש רק 70 μl של מדיום תרבית תאים לresuspend תאים.
  4. הוסף להשעית תא וכתוצאה מכך נפח שווה של 12.8% (w / v) פתרון שלב DEX המימי ערוכים 1.2. לדוגמא אליפטית צפיפות 1.5 x 10 4 תאים, 70 μl של פתרון שלב DEX מתווסף 70 μl של השעיה תא.
  5. לערבב ביסודיות את ההשעיה התא על מנת להבטיח פיזור אחיד של תאים וערבוב של פתרון DEX. Pipetting למעלה ולמטה צריכים להיעשות בעדינות כדי למנוע היווצרות בועה.

3. הכנה לדפוס של Spheroids Co-תרבותי

  1. לגדל תאי סרטן (לדוגמא, מד"א-MB-157 תאים אנושיים של סרטן השד) ותאי תמיכה (למשל, fibroblasts אדם) ל- 90% -100% monolayer מחוברות. לקצור כל סוג תא באמצעות חיץ ניתוק תא (על פי הפרוטוקול של היצרן).
    1. לטעון כל השעיה לחרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב173.3 XG, וsupernatant לשאוב מכל חרוטי. תאי Resuspend של כל חרוטי ב 1 מיליליטר של g המלאבינוני rowth.
      הערה: צבעי ניאון כגון Calcein AM (כתם תא חי) וצבעים גרעיניים (Hoechst) ניתן להשתמש כדי להבחין בין שני סוגי התאים.
  2. לטעון כל סוג תא בנפרד על hemocytometer ולספור אותם על מנת לחשב את המספר הנדרש של כל סוג תא ליחס רצוי של תאי סרטן לתאים תומכים בspheroids שיתוף תרבותי. monolayers המחוברות של מד"א-MB-157 תאים וfibroblasts גדל בצלוחיות T75 בדרך כלל נותנים ~ 7 x 10 6 ו ~ 6 x 10 6 תאים, בהתאמה.
  3. הוסף את הנפח הנכון מההשעיה של תאים תומכים להשעיה תאים סרטניים לתת יחס רצוי של מספר שני סוגי תאים. לדוגמא, השתמש יחס של 50 תאים סרטניים לתאי פיברובלסטים 1.
  4. צנטריפוגה חרוטי המכילים את ההשעיה התא המעורבת במשך 5 דקות ב173.3 תאי XG וגלולים בנפח מתאים ללגרום לצפיפות סופית הכוללות כמויות שווה של מדיום גידול ו12.8% (w / v) DEX המימיפתרון שלב (שהוכן ב1.2).
  5. בעדינות פיפטה השעיה תא וכתוצאה מלמעלה ולמטה כדי להבטיח ההומוגניות של ההשעיה.

4. הדפסה של Spheroids גידול לתוך צלחת 96-היטב

  1. יום אחד לפני ניסויים, צלחות מעיל שאינם מטופלים, מסביב לתחתית 96-היטב עם 1% (w / v) pluronic על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ציפוי זה מונע תא קובץ מצורף על פני תקופת התרבות.
  2. לוותר 50 μl 5% המסוננים (w / v) שלב PEG המימי לבאר כל צלחת 96-היטב (צלחת יעד).
  3. בעזרת פיפטה, לערבב את ההשעיה התא (מוכן בשלב 2 או שלב 3 למונה ותרבות משותפת, בהתאמה), ולהוסיף 20 μl של ההשעיה לכל זה היטב מעמודה של צלחת 384 גם אחד (צלחת מקור) .
  4. הפעל את המטפל הנוזלי ו" הביתה "ראש pipetting לרשום קואורדינטות. לאחר מכן לאסוף פרוטוקול שהוגדר בעבר (להלן ב4.6) כדי להבטיח מעבדתי ופרמטרים מוגדרים נכוניםly. זה צעד "מתביית" עשוי להיות שונה עבור מפעילי נוזל שונים.
    הערה: הזרימה של הפרוטוקול, שמוצג צעד-אחר-צעד בהמשך ב4.6, יהיה דומה ללא קשר למטפל נוזל רובוטית משמש; עם זאת, ממשק תכנות עשוי להיראות שונה בשל השימוש בתוכנות שונות.
  5. מניחים את צלחת המקור, צלחת היעד, ותיבות קצה פיפטה בעמדות מוגדרות בתחנת העבודה של המטפל הנוזלי כפי שמוצג באיור 1.
  6. לבצע את הפרוטוקול הכולל את השלבים הבאים:
    1. עומס עמודה אחת של חביות מהראש pipetting של המטפל הנוזלי עם ערבוב הטיפים פיפטה (8 טיפים) מתחנת העבודה (איור 1).
    2. מערבבים את ההשעיה התא בבארות של צלחת המקור (איור 1). בחר ערבוב קטן יותר מתא ההשעיה הנפח בבארות כדי למנוע היווצרות בועת נפח.
    3. הוצא טיפים לתיבה ריקה טיפים פסולת (איור 1).
    4. עומס עמודה אחת של חביות מהראש pipetting עם טיפים פיפטה מחלק 10 μl (איור 1).
    5. לשאוב 0.3 μl של ההשעיה התא מצלחת המקור (איור 1) לכל קצה פיפטה.
    6. לוותר ההשעיה התא לתוך בארות של טור של צלחת יעד אחד (איור 1). השתמש בגובה לוותר של 0.5 מ"מ וקצב זרימה לוותר של μl הקטן מ 1 / sec.
    7. חזור על שלבים 4.6.1 באמצעות 4.6.6 עד הדפסת טור-by-טור לכל צלחת היעד היא מלאה.
  7. מוציא בזהירות את צלחת היעד ממשטח העבודה ולשים אותו בחממה לחה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לשמור אופקי צלחת כאשר נשא אותה לחממה כדי למנוע שיבוש של טיפות שלב DEX המכילות תאים.
  8. דגירה את הצלחת למשך 24 שעות כדי לאפשר צבירה של תאים לתוך אליפטית בתוך טיפת שלב DEX.
5. טיפול התרופתי של Spheroids תאים הסרטני

שימו לב כי בפרוטוקול הבא הוא לטיפול תרופתי 4 ימים ויכלול את חידוש בתרופה טרי לאחר יום 2. זה יכול להיות שונה לתקופות טיפול אחרות.

  1. חזותי לאשר היווצרות אליפטית ב96-גם צלחות לאחר 24 שעות. במידת הצורך, בארות תמונה למדידת הגודל של spheroids על ידי ממוצע הקטרים ​​הקטנים ביותר והגדולים ביותר של כל אליפטית.
  2. הכן את פתרון המניות של תרופה רצויה על ידי המסתו בממס המומלץ על ידי היצרן בריכוז מסיסות שנקבע מראש. לדוגמא, לפזר ציספלטין במים ב2 מ"ג / מיליליטר.
    הערה: הגן על פתרון המניות של התרופה מהאור אם התרופה היא רגישה לאור.
  3. שימוש בטכניקת דילול סדרתי, להכין ריכוזי תרופה מדוללים עם מדיום תרבית תאים ממניות הפתרון מוכן בשלב הקודם. כל דילול צריך להיעשות פעמיים הריכוז הרצוי. דיליחסי ution ישתנו בהתאם לריכוז המניה מתחיל ורצויים ריכוזים עובדים.
  4. הוסף 50 μl של פתרון תרופה שהוכן בשלב הקודם לכל אחד. ניתן לעשות זאת על ידי רובוט או pipetting הידני.
    הערה: כל ריכוז תרופה יהיה מדולל במחצית לריכוז הרצוי על ידי שלב PEG המימי 50 μl כבר בכל טוב.
    1. השתמש spheroids משני טורים של צלחת 96-היטב (n = 16) עבור כל ריכוז.
    2. בבארות שליטה, להוסיף רק 50 μl של מדיום תרבות טרי 50 μl הקיים של שלב PEG המימי.
  5. דגירה spheroids עם התרופה במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, מוגנות מפני אור.
  6. לאחר 48 שעות של דגירה, להכין דילולים טריים של התרופה בריכוזים רצויים ולחדש את התרופה על ידי הוספת 50 μl של פתרון תרופה טרי היטב כל אחד.
    הערה: הבארות כבר מכילות ריכוז התרופה הרצויה מt התרופה הראשוןreatment. לכן בשלב זה חידוש, כל ריכוז הנו מוכן בריכוז הרצוי שכן אין דילול יתרחש.
  7. דגירה spheroids עם התרופה לעוד שעה 48 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, המוגנת מפני אור.

6. ניתוח סלולרי ליכולת הקיום בSpheroids

  1. לאחר 48 שעות של דגירה עם תרופה מחודשת (כלומר, זמן כולל של טיפול בspheroids עם סמים הוא 4 ימים), למדוד את הנפח הכולל של מדיום באחד היטב על ידי pipetting הידני.
    הערה: נפח אופייני ובאחד הוא ~ 140 μl (ירידה קטנה מתרחשת עקב אידוי).
  2. חשב את הנפח של מגיב תא כדאיות (למשל, PrestoBlue) כריכוז של 10% מכלל גם הנפח. הוספת נפח זה של מגיב כדאיות תא היטב כל אחד.
    הערה: עם קיים נפח תקשורת של 140 μl בבאר, בהיקף של 15.6 μl נדרש לתת ריכוז של 10% מכלל תושבי עיר היטב. זה מחושב על ידיהחלוקה הקיימת תקשורת על ידי 9 (140 μl / 9 = 15.6 μl) הנפח.
  3. דגירה את הצלחת עם מגיב כדאיות תא מתווסף גם כל 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס, המוגן מפני אור.
  4. מניחים את הצלחת בקורא מיקרו צלחת ולקרוא את אותות הקרינה ב 560 ננומטר ואורכי גל עירור 590 ננומטר ופליטה, בהתאמה.
  5. לחשב את כדאיות אחוזים מהתאים בspheroids ידי נרמול אות הניאון מבארות שטופלו לזה של בארות שליטה לאחר שקלול הערכים מאותם תנאי הטיפול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תחנת העבודה של המטפל הנוזלי רובוטית מוצגת באיור 1. ראש pipetting וכל התחנות בשימוש בהדפסה רובוטית של spheroids בסעיף 4.6 מסומנות. התמונה מציגה את השימוש בשתי תחנות שונות לתיבות קצה (סט אחד של טיפים לערבוב והסט השני לaspirating / מחלק של תערובת שלב תא השעיה מימי DEX). כל ההתקנה שוכנת בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטנדרטי כדי לשמור על סטריליות. איור 2 מתאר סכמטי של התהליך "ההדפסה" עם המערכת דו-שלב המימי. טיפ פיפטה עמוס ההשעיה התא בשלב המימי DE...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Spheroids להציג מודל מציאותי כדי להבין טוב יותר פיזיולוגיה גידול ויעילות תרופה ולספק כלי שימושי לגילוי תרופות אנטי-סרטני. יישומים כגון יפיקו תועלת רבה מטכניקות דור אליפטית ותחזוקה פשוטות שרק דורשים מעבדתי סטנדרטי, כלים טיפול נוזליים וציוד הקרנה. השימוש במערכת דו-שלב מימית תאי סרטן לצבירה באופן ספונטני במסגרת שלב הירידה מאפשרת ייצור יעיל ותחזוקה של spheroids עם מפעילי נוזל רובוטית, ובטיפול תרופתי באתר וניתוח נקודת סיום של תגובות תאיות עם ריאגנטים וכלים מסחריים. כך...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש לי המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים למימון מהמכונים הלאומיים לבריאות R21CA182333.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים וחומרים מתכלים
פוליאתילן גליקול, MW: 35,000סיגמא-אולדריץ'94646
דקסטרן, MW: 500,000Pharmacosmos5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6429
סרום בקר עובריSigma-Aldrich12306C
GlutamineLife Technologies35050-061
AntibioticLife Technologies15240-062
Clacein AMLife TechnologiesC3100MP
HoechstLife Technologies33342
CisplatinSpectrum Chemicals15663-27-1
PrestoBlueLife TechnologiesA-13261
Pluronic F-108Sigma Aldrich542342
טיפים חד פעמיים (10 ומיקרו; l)FluoticsC-P10V11.ST
טיפים חד פעמיים (70 ומיקרו; l)FluoticsC-P70V11.ST
צלחות 96 בארות עגולות תחתונותNunc268200
<חזק>ציוד
מטפל בנוזליםAgilent TechnologiesSRT Bravo
Microplate ReaderBiotek InstrumentsSynergy H1M

מקורות

  1. Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
  2. Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
  3. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  4. Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
  5. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
  6. Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
  7. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
  9. Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
  10. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
  11. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
  12. Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
  13. Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
  14. Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114(2013).
  15. Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250(2014).
  16. Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
  17. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
  18. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
  19. Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
  20. Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
  21. Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
  22. Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
  23. Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
  24. Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
  25. Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
  26. Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878(2014).
  27. Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
  28. Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
  29. Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
  30. Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
  31. Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
  32. Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
  33. Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
  34. Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444(2010).
  35. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
  36. Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
  37. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
  38. Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
  39. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
  40. Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

סריקה בתפוקה גבוההמערכת רובוטית לטיפול בנוזליםפורמט של פלטת 96 בארותפרוטוקול לבדיקת תרופותמבחן חיוניות תאיםטיפול ב-Cisplatinיצירת ספרואידיםקורא מיקרופלטות
הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.