מאמר שיטה

יישום של ה- DNA ספציפי הכתם מתיל הירוק בתיוג פלורסנט של עוברים

DOI:

10.3791/52769

⸱

2 במאי 2015

 ,  ,  , 
1Institut Pasteur de Montevideo, 2Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארת שיטה לצביעה פלואורסצנטית של חומר ביולוגי קבוע עם תווית ה-DNA הספציפית מתיל ירוק. מתיל ירוק משמש בתמיסה מימית מדוללת ועמיד מאוד בפני פוטוהלבנה. הפליטה האדומה הרחוקה שלו מאפשרת הדמיה עמוקה של דגימות, מה שהופך אותו למתאים במיוחד לעוברים שלמים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתיל ירוק ידוע זה מכבר ככתם היסטולוגי בעל זיקה ספציפית ל-DNA, אם כי תכונותיו הפלואורסצנטיות נותרו לא נחקרו עד לאחרונה. במאמר זה, אנו מדגימים את השיטה להכנת תמיסת מלאי מימית מתיל ירוק, שכאשר היא מדוללת יכולה לשמש כתווית גרעינית פלואורסצנטית נוחה מאוד לתאים ורקמות קבועות. נהלים קלים לתיוג עוברי דג זברה ואפרוח שלמים מפורטים, ומוצגות דוגמאות לתמונות המתקבלות. מתיל ירוק נרגש באופן מקסימלי על ידי אור אדום, ב-633 ננומטר, ופולט בספקטרום חד יחסית שמגיע לשיא של 677 ננומטר. הוא זול מאוד, לא רעיל, יציב מאוד בתמיסה ועמיד מאוד בפני פוטו-הלבנה כאשר הוא קשור ל-DNA. הפליטה האדומה שלו מאפשרת הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של גרעינים בדגימות עבות. לבסוף, פרוטוקול צביעת מתיל ירוק זה תואם להליכי צביעת תאים אחרים, כגון תיוג נוגדנים, או תיוג חוטי אקטין עם פלואורופור מצומד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צביעה פלואורסצנטית של DNA משמשת באופן נרחב ושגרתי הן במחקר ביולוגי והן באבחון קליני, בין אם למחקר מפורט של מבנה גרעיני וכרומוזומי, לצביעה נגדית של רקמות ותאים או לחקר פרמטרים של מחזור התא1. למרות שקיימים מספר כתמי DNA, הנפוצים ביותר היו אלה הנרגשים מאור UV ופולטים בכחול, המתאימים למערכות שלושת המסננים הרגילות המשמשות ברוב המיקרוסקופים האפיפלואורסצנטיים הקונבנציונליים בשילוב עם פלואורופורים פולטים ירוק וכתום-אדום, כגון חלבונים פלואורסצנטיים או מולקולות קטנות המחוברות לנוגדנים. מבין כתמי ה-DNA הפולטים כחול אלה, הנפוצים ביותר הם חומרי קשירת חריץ מינוריים DAPI ו-Hoechst2,3. עם זאת, השילוב של מגוון רחב של קווי פליטת לייזר וזיהוי ספקטרלי במיקרוסקופים סורקים בלייזר, אפשר לחוקרים לבחור להשתמש בכתמים גרעיניים הפולטים אדום רחוק כגון פרופידיום יודיד (PI) או TO-PRO3 4. יתרונם של כתמים אלה הוא שהם מתגברים על בעיית האוטופלואורסצנציה המצויה בתאים ורקמות רבים, במיוחד בעוברים5, אך לרבים מהם יש בעיות שונות כגון פרופילי פליטה רחבים או רגישות רבה לפוטו-הלבנה6.

החוקר השוויצרי פרידריך מישר גילה את הדנ"א בשנת 1869, והפיק אותו מגרעיני תאי דם לבנים המצויים במוגלה. הוא קרא לו נוקליאין, וכמה שנים מאוחר יותר הראה שהוא יוצר משקעים עם הכתם החדש יחסית מתיל ירוק. מתיל ירוק מורכב משלוש טבעות אנילין, בדרגות שונות של מתילציה, ויש לו שני מטענים חיוביים המאפשרים לו להיקשר חזק לחריץ העיקרי של DNA7,8. צביעת DNA על ידי מתיל גרין הוכחה בשלב מוקדם מאוד כספציפית, מה שהוביל לפיתוח על ידי Unna ו-Pappenheim של כתם משולב עם פירונין, המסמן באופן ספציפי RNA. מתיל ירוק-פירונין נמצא מאז בשימוש נרחב בטכניקה היסטולוגית שגרתית9.

עד לאחרונה, מעט מאוד היה ידוע על התכונות הפלואורסצנטיות של מתיל ירוק. עם זאת, עבודתנו הקודמת חשפה כמה מהיתרונות הספקטרליים של מתיל ירוק6 כגון העירור שלו ב-633 ננומטר, הסטה נוחה של סטוקס, פליטתו בחלק הקרוב לאינפרא אדום של הספקטרום האלקטרומגנטי, יציבות פוטו-יציבות גבוהה יותר מכתמי DNA זמינים מסחרית עם תכונות ספקטרליות דומות ובעלות נמוכה מאוד. זו הסיבה שהחלטנו לבדוק את השימוש בו כזיקה גבוהה מאוד ותווית פלואורסצנטית ספציפית לדנ"א על רקמות עובריות ובעוברים שלמים. יתר על כן, עד כה בוצע צביעה גרעינית מתיל ירוק ב-pH נמוך, מה שהקשה על השילוב עם צביעת נוגדנים. מטרת השיטה המפורטת כאן היא ליצור פרוטוקול לצביעת DNA גרעיני פלואורסצנטי המתגבר על אי הנוחות הנ"ל על ידי ביצוע הליך הצביעה ב-pH פיזיולוגי, ובכך הופך אותו לכתם נגד מתאים לתיוג חיסוני על חלקים ורקמות שלמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טיהור של הצבע

  1. הכן תמיסה מימית 4% מתיל ירוק על ידי המסת 0.4 גרם של אבקת כתם ב 10 מיליליטר מים מזוקקים. מערבבים היטב עד פירוקה לחלוטין.
  2. תחת מכסה המנוע קטר-, לערבב אותו עם לפחות 2 חלקים של כלורופורם. חשוב לבדוק מראש אם הצינורות הם כלורופורם עמיד.
  3. מערבבים היטב וצנטריפוגות 1 דקות XG ב 2000 כדי להאיץ הפרדת שלב.
  4. לאחר צנטריפוגה, שלב מימי עליון עם מתיל ירוק ושלב אורגני נמוך עם כלורופורם וסגול גביש המזהם הרגילה מתקבלים.
  5. לשחזר את השלב העליון וחזור על שלב זה עד שלב תחתון מופיע נטול לחלוטין של סגול גביש.
  6. בסוף, בשלב העליון הוא התאושש ומדולל במים לריכוז סופי של 2% מתיל ירוק. פתרון מניות זה הוא יציב על שולחן העבודה במשך חודשים ולא צריך להיות מוגן מפני אור.

"Jove_title"> 2. פלורסנט גרעיני מכתים של כל הפריטים עוברי דג הזברה באמצעות תיל ירוק

  1. תקן את עוברי פורמלדהיד% הלילה ב 4 (מparaformaldehyde) בופר פוספט (PBS).
    הערה: זה יכול לקחת בין כמה שעות ללילה בהתאם לעובי של העוברים. בדוגמא, אנו קבועים לאחר הפריה עוברי דג הזברה (hpf) 48 שעות לילה.
  2. לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBS-T (1% Triton X-100 ב PBS) במשך 5 דקות. הריכוז הגבוה של חומר ניקוי permeabilizes לציפורן.
  3. הכן 1: פתרון 10,000 ירוק מתיל (2% ממניות פתרון) בPBS-T: 5,000-1. הנוכחות של חומר ניקוי במהלך הדגירה היא שימושית עבור דגימות עבות, כגון עוברי דג הזברה וזחלים.
  4. דגירה עובר בפתרון במשך לפחות 6 שעות על 4 מעלות צלזיוס, עם נדנדה עדינה. שוב, העובי של העובר הוא פרמטר הכיול לאורכו של הדגירה.
  5. לשטוף את העוברים 3 times עם PBS למשך 30 דקות כדי להסיר את עודפי חומר הניקוי. הקרינה ירוקה מתיל היא רק ביטוי כאשר חייב DNA, ומכאן רקע מהמולקולה מאוגד הוא זניח.
  6. הר בשקופית נחפרה או קאמרי תוצרת בית עם פתרון הרכבה (גליצרול 75%, 0.1 מ 'טריס · HCl pH 8).
    הערה: אם ההכתמה הגרעינית היא שיש לבצע לאחר immunolabeling, ירוק מתיל יכול להיות משולב לפתרון ההרכבה בריכוז העבודה, ללא צורך לשטוף אותו משם.
  7. חנות בקירור או להתחיל הדמיה באופן מיידי. לבצע הדמיה עם confocal סריקת לייזר (או הקרינה אחרת) מיקרוסקופ עם עירור ב 633 ננומטר ומסנני פליטה שנקבעו לרישום ב650-750 ננומטר בהתחשב בכך שתיל פליטה ירוקה מגיעה למקסימום שלה ב677 ננומטר.
    הערה: אנו מספקים נתונים שנמדדו בפרופיל הפליטה הירוק מתיל, כדי להיות טעון לתוך תוכנת הרכישה, כחומר משלים.

3. פלורסנט הגרעיני Staining של כל הפריטים צ'יק עוברים באמצעות מתיל ירוק

  1. דגירה ביצי תרנגולת מופרות לשלב של עניין. תקן את עוברי הלילה בפורמלין 4% (מparaformaldehyde) PBS ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף עוברים 3 פעמים ב PBS-T לשעה 2.
  2. הכן 1: פתרון 10,000 ירוק מתיל (2% ממניות פתרון) בPBS-T: 5,000-1. דגירה עובר בפתרון מכתים הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את העוברים 3 פעמים ב PBS, 1 שעה כל אחד. הר בתא עם גליצרול 75%, 0.1 מ 'טריס, pH 8.

4. ההדמיה שכותרתו fluorescently גרעינים בעוברים רכוב שלמים

  1. הכן תא הדמיה על ידי דבק כמה שכבות של קלטת חשמל על שקופיות מיקרוסקופ ובזהירות לחתוך חור לתוכו עם אזמל למקם את העוברים בתוך. זה ימנע מעוברי הריסוק במהלך הדמיה.
  2. להעביר בזהירות את העוברים לחדר ההדמיה ולמלא את התא לראש עם גליצרול 75%, 0.1 מ 'טריס HCl, pH = 8 להיווצרות בועת חלל.
  3. מכסים בcoverslip # 0 הימנעות או ביטול עולה על גדותיו בינוניות. לאטום אותו עם לק.
  4. לרכוש תמונות של הדגימה במיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן 633 עירור או קו לייזר.
    הערה: מסנני פליטה צריכים לכסות את מקסימום 677 פליטה ירוקה מתיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכתמה גרעינית של דגימות עבות. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר להשגת צביעה הומוגנית של מבנים עמוקים בכל עוברים. טופס גרעיני 48 hpf עוברי דג הזברה עדשת פיתוח הומוגנית מסומנים (איור 1).

צביעת DNA ירוקה מתיל מאפשרת אפליה של הבדלים מורפולוגיים תלויים מחזור התא כגון זיהוי של דמויות mitotic או גרעינים אפופטוטיים (איור 2 א). מבני Subnuclear ברזולוציה גבוהה ניכרים גם כפי שמוצגים לגרעיני א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתפתחות המתקדמת של טכניקות מיקרוסקופיה בעשורים האחרונים, עם דגש מיוחד על וריאציות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הובילה לאפשרות לחקור את הדינמיקה והמבנה של דגימות רקמה שלמות, כולל עוברים שלמים10,11. מגבלה עיקרית אחת הייתה, עם זאת, הזמינות של פלואורופורים באיכות טובה שניתן להשתמש בהם כדי לצבוע באופן ישיר ומהיר מבנים תת-תאיים.

כתמי ה-DNA הפלואורסצנטיים הנפוצים ביותר, כגון DAPI או Hoechst, נרגשים באור UV ופולטים באזור הכחול של הספקטרום הנראה2,3, מה שהופך אותם לבלתי מתאימים ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות ל-Patxi Jaso על הפקת הסרטון, PEDECIBA ו-Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) למימון חלקי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516
מתיל ירוקDr. G. Grü blerנבדק גם Sigma-Aldrich 323829, שהוא פרפורמלדהיד ללא סגול קריסטל
Sigma-Aldrich158127
סריקת לייזר מיקרוסקופיה קונפוקלית Leica TCS-SP5Leica Microsystems
Phalloidin– טטרמתילרודמין B איזותיוציאנטסיגמא-אולדריץ'
P1951 
כלורופורםסיגמא-אולדריץ' 372978
צנטריפוגה 5810 Reppendorf5811 000.010   
שקופיות מיקרוסקופDeltalabD100004
כיסוי מחליקEsco אופטיקהR525025

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
  2. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
  3. Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).
  4. Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
  5. Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).
  6. Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).
  7. Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).
  8. Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).
  9. Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).
  10. Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).
  11. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).
  12. Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAPBST

מאמרים קשורים