טכניקת העשרה אופטימלית עבור הבידוד של<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriophage מינים מדגימת הקרקע מבודדת

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול העשרה לבידוד בקטריופאג'ים המדביקים חיידקים בסוג Arthrobacter. פרוטוקול העשרה זה מייצר תוצאות מהירות וניתנות לשחזור עבור בידוד והגברה של פאג'ים Arthrobacter מבודדי קרקע.

תקציר

בידוד בקטריופאג'ים מדגימות סביבתיות מבוצע במשך עשרות שנים תוך שימוש בעקרונות שנקבעו על ידי חלוצים במיקרוביולוגיה. הבידוד של פאג'ים המדביקים מארחי Arthrobacter היה מוגבל, אולי בשל שיעור ההצלחה הנמוך של טכניקות בידוד קודמות רבות, וכתוצאה מכך קבוצה לא מיוצגת של פאג'ים Arthrobacter זמינה למחקר. טכניקת ההעשרה המתוארת כאן, בניגוד לרבים אחרים, משתמשת בתמצית מסוננת ללא חיידקים מזהמים כבסיס לצמיחת חיידקי אינדיקטורים, Arthrobactersp. KY3901, באופן ספציפי. על ידי הסרת חיידקי הקרקע הראשונים, פאג'י המטרה אינם מונעים על ידי תחרות עם חיידקי קרקע מקומיים הנמצאים בדגימות קרקע ראשוניות. שיטת העשרה זו הביאה לעשרות פאג'ים ייחודיים מכמה סוגי קרקע שונים ואף ייצרה סוגים שונים של פאג'ים מאותו מבודד דגימת קרקע מועשר. ניתן להרחיב את השימוש בהליך זה לרוב המדיה האירובית העשירה בחומרים מזינים לבידוד פאג'ים במגוון עצום של חיידקים מארחים מעניינים.

מבוא

המצאות בכל מקום של מיני Arthrobacter בסביבות אדמה מציעה מספר ומגוון עצומים של פאגים מסוגלים להיות מבודד ממין זה של חיידקי מארח. חברי חיידקים ממשפחת Acintobacteriaceae הם בולטים ביותר למסלולי קטבולי של משפיל תרכובות סוררות כמו אטרזין וחומרי הדברה שונות ^ו1,2,3 קוטלי עשבים. למרות שרוב המחקר שנעשה באמצעות זנים סביבתיים של Arthrobacter, מבודדים קליני של הסוג הזה נמצא בדם, שתן, עיניים, ומקורות רבים אחרים אדם כולו מוצגות ההטרוגניות פילוגנטי ^4.

אמנם יש גוף נרחב למדי של מחקר על חיידקי Arthrobacter, רק מעט מחקרים....

פרוטוקול

1. הכנת תאי Arthobacter לבידוד הפאג

• sp Arthrobacter התרבות. KY3901 מושבות מפוספסות על צלחת לוריא Bertaini (LB) אגר טופחה על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. פיק מושבה ולהשתמש בלולאת סטרילי כדי להוסיף אותו ל -250 מיליליטר של מרק LB בבקבוק תרבות מבולבל ודגירה בחממה רועדת ב 225 סל"ד ב 30 מעלות צלזיוס.
• לאפשר כ 24 שעות של צמיחה להשיג תאים מאוחר מעריכי / תחילת נייחות שלב ניסויי זיהום הפאג. לפקח על המצב של התפתחות חיידקים באופן הדוק כדי למנוע מתאים מלהיכנס לאמצע למצב צמיחה נייח מא....

תוצאות

כדי להדגים שחזור של טכניקת ההעשרה משופרת לפאגים Arthrobacter, 30 דגימות קרקע שונות שמשו בזמנים ובמקומות שונים באביב ובקיץ של שנת 2014 של דגימות קרקע 30 אלה פאגים Arthrobacter ייחודיים התקבלו משל 22 דגימות קרקע שנאספו באמצעות העשרה זו הליך. הליך ההעשרה הסטנדרטי הניב פאגים ייחודיים משל 3 אותו דגימות הקרקע. דגימות ההעשרה יכולה להיות כייל הפאג גבוה מאוד הזקוק לדילול ראשוני לבודד את לוחות או כייל הפאג נמוך יחסית הדורש נפח גדול יותר של Arthrobacter מועשר לזיהו.......

דיון

למרות ניסיונות רבים קודמים לבודד פאגים מסוגלים להדביק מארחי Arthrobacter, היו לנו הצלחה קטנה באמצעות הליכי העשרה סטנדרטיים. השיטה הכללית של העשרת חיידקים פיתחה והתאימה על ידי ואן Twest וKropinski ¹⁰ להעשיר פאגים מדגימות סביבתיות הוא הבסיס למרבית הליכי העשרה. ראיות ממחקרים קודמים מצביעות על כך ששיטות של ציפוי ישיר הפיקו לוחות זיהוי על זנים של Arthrobacter אם כי בשיעורי הצלחה נמוכים מאוד של בידוד ^5. בשיטת הציפוי הישירה, פאגים מופקים מדגימות קר.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אבקת מרק LB	פישר	BP9722-2	עדיף להזמין אותם בכמויות גדולות.
אגר פישר מגורען		BP1423-2	עדיף להזמין אותם בכמויות גדולות.
מסנני מזרק 0.22 אום	פישר	09-719A
0.22 מסנני בוכנר אום	פישר	430320	ניתן להשיג יותר מ-50 מ"ל נוזל על ידי החלפה בזהירות של צינור הקבלה.
צינורות אפנדורף	פישר	05-408-129
5 מ"ל פיפטים בודדים	פישר	13-678-11D
50 מ"ל צינורות חרוטיים	פישר	76002844
15 מ"ל צינורות חרוטיים	פישר	76002845
10 מ"ל פיפטים בודדים	פישר	13-676-10J
25 מ"ל פיפטים בודדים	פישר	13-676-10K
נייר סינון איכותי של ווטמן	פישר	1001-824