טכניקת העשרה אופטימלית עבור הבידוד של Arthrobacter Bacteriophage מינים מדגימת הקרקע מבודדת

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול העשרה לבידוד בקטריופאג'ים המדביקים חיידקים בסוג Arthrobacter. פרוטוקול העשרה זה מייצר תוצאות מהירות וניתנות לשחזור עבור בידוד והגברה של פאג'ים Arthrobacter מבודדי קרקע.

תקציר

בידוד בקטריופאג'ים מדגימות סביבתיות מבוצע במשך עשרות שנים תוך שימוש בעקרונות שנקבעו על ידי חלוצים במיקרוביולוגיה. הבידוד של פאג'ים המדביקים מארחי Arthrobacter היה מוגבל, אולי בשל שיעור ההצלחה הנמוך של טכניקות בידוד קודמות רבות, וכתוצאה מכך קבוצה לא מיוצגת של פאג'ים Arthrobacter זמינה למחקר. טכניקת ההעשרה המתוארת כאן, בניגוד לרבים אחרים, משתמשת בתמצית מסוננת ללא חיידקים מזהמים כבסיס לצמיחת חיידקי אינדיקטורים, Arthrobactersp. KY3901, באופן ספציפי. על ידי הסרת חיידקי הקרקע הראשונים, פאג'י המטרה אינם מונעים על ידי תחרות עם חיידקי קרקע מקומיים הנמצאים בדגימות קרקע ראשוניות. שיטת העשרה זו הביאה לעשרות פאג'ים ייחודיים מכמה סוגי קרקע שונים ואף ייצרה סוגים שונים של פאג'ים מאותו מבודד דגימת קרקע מועשר. ניתן להרחיב את השימוש בהליך זה לרוב המדיה האירובית העשירה בחומרים מזינים לבידוד פאג'ים במגוון עצום של חיידקים מארחים מעניינים.

מבוא

המצאות בכל מקום של מיני Arthrobacter בסביבות אדמה מציעה מספר ומגוון עצומים של פאגים מסוגלים להיות מבודד ממין זה של חיידקי מארח. חברי חיידקים ממשפחת Acintobacteriaceae הם בולטים ביותר למסלולי קטבולי של משפיל תרכובות סוררות כמו אטרזין וחומרי הדברה שונות ^ו1,2,3 קוטלי עשבים. למרות שרוב המחקר שנעשה באמצעות זנים סביבתיים של Arthrobacter, מבודדים קליני של הסוג הזה נמצא בדם, שתן, עיניים, ומקורות רבים אחרים אדם כולו מוצגות ההטרוגניות פילוגנטי ^4.

אמנם יש גוף נרחב למדי של מחקר על חיידקי Arthrobacter, רק מעט מחקרים לדווח על פאגים מסוגלים להדביק בני מין מגוון זו. מעניין אם כי, שנעשתה בעבר על Arthrobacter עבודת פאגים נגיעות בכמה נושאים שונים מפתח כגון ההקלדה של אדמה מיני Arthrobacter ⁵ שימושים תעשייתיים, במטרה להפחית את הקצף מזיק במפעלים לטיפול בבוצה משופעלת ^6, ועבודה המדגישה רקומבינציה ספציפית באתר וגני אינטגראז ^7.

פרוטוקולי טכניקת העשרה שונים נוצלו כדי ליצור טהור הפאג מבודד במינים Arthrobacter. נהלים מוקדמים כוללים incubations של אדמה עם סוכנים רעילים הוסיפו כמו מלחי ניקוטין לתקופות של למעלה משנת ⁸ עלייה נותנת לפאגים מסוגלים א מדביק רק globiformis. מחקרים שנעשו באמצעות אדמה חלחלו עם אורגניים יציב הופיע לייצר פאגים לזיהוי באמצעות טכניקות assay פלאק, השמטת תקופות דגירה ארוכה ^8. מעניין אם כי, טכניקה הדומה ציפוי ישיר שימשה בעבר והוליד כמה פאגים בעוד שיש עדיין שיעור הצלחה נמוך במיוחד על-ידי החוקרים ^5, בצטטו מחקרים האחרונים עם אחוזי הצלחה נמוכות 8.

בסך הכל, טכניקות הבידוד שימשו בעבר היו ראויות לציון על כך שיעילות קטנה בפועל למרות סוג Arthrobacter המייצג את האדמה האירובית השכיחה ביותר לבודד בטבע ^4,9,, ואן Twest וKropinski ¹⁰ שיטות העשרה הנוכחיות לבידוד פאגים ממים ואדמה מותאם מטכניקות קודם לכן משמשות להעשרה מבודדת חיידקים סביבתיים, אלא טכניקות העשרה אלה הוכיחו יעילים בבידוד פאגים Arthrobacter. מטרת השיטה המתוארת כאן היא להראות "הוכחה של מושג" שניתן להתאים את שיטות ההעשרה המוקדמות בעקביות וביעילות כדי לבודד פאגים Arthrobacter, להתגבר על אתגרים טכניים קודמים הקשורים לבידוד פאגים מסוג חיידקים זה.

פרוטוקול

1. הכנת תאי Arthobacter לבידוד הפאג

• sp Arthrobacter התרבות. KY3901 מושבות מפוספסות על צלחת לוריא Bertaini (LB) אגר טופחה על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. פיק מושבה ולהשתמש בלולאת סטרילי כדי להוסיף אותו ל -250 מיליליטר של מרק LB בבקבוק תרבות מבולבל ודגירה בחממה רועדת ב 225 סל"ד ב 30 מעלות צלזיוס.
• לאפשר כ 24 שעות של צמיחה להשיג תאים מאוחר מעריכי / תחילת נייחות שלב ניסויי זיהום הפאג. לפקח על המצב של התפתחות חיידקים באופן הדוק כדי למנוע מתאים מלהיכנס לאמצע למצב צמיחה נייח מאוחר.
  הערה: צמיחת תא צריכה להיות מורכבת של OD צפיפות אופטי ₆₀₀ בין 0.5-.0.7 לנהלי בידוד הפאג וטיהור / השלבים מתוארים להלן.

2. אוסף של הפאג מדגימות קרקע

1. לאסוף 200-400 גרם של אדמה ממקום רצוי. הערה: מאחר שחיידקים בArthrobaסוג cter הם חיידקי קרקע משותפים להם וניתן למצוא פאגים המדביקים אותם ובמחלחלים ברוב סוגי הקרקע.
2. הוסף לפחות 400 מיליליטר של הפאג הצפת (PB) [68 מ"מ NaCl, 10 מ"מ MgSO _4, 10 מ"מ טריס-CL (pH 7.5)] לאדמה ולערבב בבקבוק מספיק גדול כדי שלפחות 200 מיליליטר של PB הוא בsupernatant והוא מסוגל לחלץ.
3. מערבבים בעדינות על ידי ערבוב או מתערבלים עד הקרקע מושעה ולאפשר משקעי האדמה להתיישב, בדרך כלל 30 דקות.
4. להעביר את "תמצית האדמה" דרך נייר סינון על ידי סינון כוח משיכה כדי להסיר שאריות משקעים אדמה.
5. להוסיף אבקת LB ולערבב כדי להפוך את פתרון 2% (4 אבקת g LB ב200 מיליליטר תמצית אדמה).
6. להעביר את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר על ידי סינון ואקום להשיג תסנין סטרילי. במידת האפשר, להמשיך לשלב 2.7 באופן מיידי. אם יהיה צורך, חנות מסוננת דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני שתמשיך, עם זאת, מספרם של חלקיקי phage קיימאיהיה קטן יותר.
7. מספר Aliquot 50 מיליליטר מנות של תערובת תמצית LB / אדמה מעוקרת מסנן לתוך 250 מיליליטר בודד המעוקרות רועדים תרבות צלוחיות מבולבלות תוך שימוש בטכניקות aseptic. הוסף פתרון ₂ M CaCl סטרילי 2.0 לריכוזים הרצויים הסופיים (0-50 מ"מ) מאז פאגים Arthrobacter שונים לגדול בצורה אופטימלית תחת CaCl ₂ תנאים שונים.
   הערה: אנו מוצאים כי הרוב המכריע של פאגים Arthrobacter המזוהים על ידינו הוא בטווח של 1 מ"מ 2.5 מ"מ CaCl _2. עם זאת, כמה מפאגים המבודדים גדלו על ידינו באופן בלעדי ב0 מ"מ CaCl .or ₂ בCaCl ₂ ריכוזים גבוהים מאוד. פנה מייד לשלב 3.1.

בידוד 3. הפאג

1. להוסיף 1-2.5 מיליליטר של תרבות מעריכי / תחילת סוף נייחת חיידקי שלב לכל אחד מהצלוחיות. לOD ₆₀₀ 0.5-0.7, להשתמש 1 מיליליטר של תאים. לOD ₆₀₀ גבוה מOD של 0.7 להשתמש 2.5 מיליליטר שלתאים.
   הערה: תאים בגידול שלב מעריכי בדרך כלל תשואה יותר פאגים וtiters גבוה יותר מאשר תאים בגידול שלב נייח.
2. Shake צלוחיות ב 250 סל"ד ב 30 מעלות צלזיוס למשך כ 24 שעות בתוך חממה רועדת.
3. לאחר תקופת דגירה 24 שעות להסיר את צלוחיות העשרה מן החממה הרועדת ולדלל את דגימות ההעשרה פי עשרה במאגר הפאג.
4. הגדרת צינורות תרבות עם 0.5 מיליליטר של תרבות מעריכי / תחילת סוף נייחת חיידקי שלב ולהוסיף כמויות שונות של תרבות ההעשרה (5 μl 500 μl של דילול 10 ^-1 בPB) לצינורות התרבות.
   הערה: מומלץ לבדוק מגוון רחב של ריכוזים מאז כל דגימת קרקע יוצרת titers הפאג שונה לאחר העשרה.
5. להוסיף CaCl ₂ לצינורות תרבות כדי להפוך את ריכוז סופי שווה להווה הריכוז בבקבוק ההעשרה המקורי. השתמש במגוון של CaCl ₂ ריכוזים שונים כדי לבחור לפאגים רבים wה- i משתנה CaCl ₂ תלות.
   הערה: רוב פאגים יהיו מבודדים בטווח של 1-2.5 CaCl ₂ מ"מ אבל יש פאגים המבודדים ביותר בצורה אופטימלית בכל מקום 0-50 CaCl ₂ ריכוזי מ"מ. בגלל זה הוא הטוב ביותר לבדוק מגוון של CaCl ₂ ריכוזים כדי למקסם את מספר פאגים Arthrobacter המבודדים ייחודיים.
6. מערבבים 4.5 מיליליטר של אגר העליון LB בצינור התרבות ויוצקים את התערובת על צלחת אגר LB. מערבולת בעדינות כדי לפזר באופן שווה על פני הצלחת ולאפשר לאגרת עליון כדי לחזק למשך כ 15 דקות.
   הערה: Top אגר יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות יותר (250 מיליליטר) ואגרתי עליון נוסף יכול להיות מאוחסן על RT ושימוש חוזר בניסויים הבאים לשבועות לפחות. אמנם יש נוסחות שונות המשמשות לייצור אגר עליון, אנו עושים העליונים אגר באמצעות 7G / L של אגר מעורבב עם קילו אגר עליון מקום באמבט המים C ° 60 כדי לשמר את המצב הנוזלי במהלך ניסוי.
7. הפוך tהוא צלחת דגירה בטמפרטורה רצויה (טמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס) O / N 48 שעות. להשתנות בתנאים אלה כדי לייעל לפאגים הנוכחיים. פאגים המבודדים ביותר מגיעים מצלחות טופחו על 30 מעלות צלזיוס ב1-2.5 מ"מ CaCl ריכוז ₂ לאחר תקופת דגירה 24 שעות.

4. הפאג טיהור

1. לאחר בדיקת דגירה 24 שעות להיווצרות הפלאק על צלחות. המשך דגירה של עד 72 שעות אם לא לוחות ניכרים או כדי לקבוע אם לוחות נוספים יופיעו. במידת צורך, צלחות חנות עם שלטים המשוערת לתקופה של עד שבוע ב 4 ° C לפני שתמשיך.
   הערה: אין זה נדיר למצוא מגוון רחב של מורפולוגיות שלט שונות בצלחת אחת. מציאת לוחות לאחר 3 ימים של דגירה אפשרית אך נדיר.
2. לטהר פאגים הרצויים מלוחות מבודדים באופן ברור בשיטת שלט פס. לגעת שלט עם מקל עץ סטרילי. Streak השלט על ידי הפעלת מקל עץ דרך להבה, allowing המקל להתקרר בקצרה, ולאחר מכן לשפשף את המקל על הצלחת אגר בתנועה העדינה, כפי שמוצג באיור 1. חזור על פעולה זו בעזרת מקל נקי לכל מעבר.
3. לחלופין, השתמש בassay כייל שלט המסורתי לבודד את הפלאק הפאג בודד. Assay כייל השלט דורש שימוש בחומרים כימיים יותר כגון אגר LB ואגר העליון LB וחומרים כגון צלחות פטרי לבידוד לוחית הפאג. יש לנו הצלחה רבה בשיטת שלט פס אבל זה יותר קל מבחינה טכנית לבודד את הפלאק בודד באמצעות assay כייל שלט.
4. ברגע שהצלחת אגר LB היא מפוספסת לפחות שלוש פעמים, סמן את השטח עם הריכוז הנמוך ביותר של חלקיקי phage משוערים ועדינות להחיל 0.5 מיליליטר של Arthrobacter ו -4.5 מיליליטר של אגר העליון LB המותך (המכיל את אותו ריכוז של סידן כלורי כצלחת ההורה ) ולאפשר לו להתפשט באופן שווה על פני הצלחת.
5. הפוך דגירה O צלחת / N. חזור על שלט הפסטכניקה לפחות שלוש חזרות כדי להבטיח מיני הפאג טהורים מבודדת. צלחות חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפי צורך בין פסים ללא אובדן משמעותי של כדאיות הפאג.
6. לוחות רצויים ברגע שכבר גדלו ומבודדים על צלחת הפס הסופית, לגעת שלט אחד מבודד היטב עם טיפ micropipette מחדש להשעות ב 100 PB μl. סדרתי לדלל פתרון 10 ⁰ זו לדילול 10 ^-8 על ידי העברת 20 μl של המדגם לμl 180 של PB הטרי.
7. הוסף 10 μl של דילול כל 0.5 מיליליטר של Arthrobacter גדל בצינור תרבות במשך 5 עד 10 דקות ב RT וצלחת על ידי ערבוב החיידקים הנגועים עם 4.5 מיליליטר של אגר העליון מותך LB המכיל את אותו הריכוז של CaCl ₂ משמש כדי לבודד את הפאג ממדגם הקרקע המקורי. שמור את כל דילולים נעשו על 4 מעלות צלזיוס עד ליום המחרת.
8. לקבוע את דילול סדרתי הפאג צריך לעשות תבנית אינטרנט באמצעות כייל השלט המסורתי כאומר. המטרה של assay כייל השלט היא לקבוע את כייל הפאג צריך להשיג צלחת דפוס אינטרנט. לזהות צלחת דפוס אינטרנט כבעיקר נטולת חיידקים אך מכילה שאריות של חיידקים שעדיין לא lysed ידי פאגים. הוסף 5 מיליליטר של תרבות Arthrobacter מאוחר מעריכי / תחילת נייחת לבקבוק תרבות 50 מיליליטר סטרילי.
   1. הוספה של הדילול (שנתן דפוס אינטרנט לתרבות Arthrobacter) בבקבוק התרבות 100 μl ולאפשר פאגים להדביק את תאי חיידקים במשך 5 עד 10 דקות ב RT. מערבבים עם אגר העליון מותך LB המכיל את אותו הריכוז של CaCl ₂ כבתחילה כדי לזהות את הפאג וצלחת 5 מיליליטר של תערובת זו על גבי 10 לוחות LB טריים. לאפשר לביסוס ודגירת צלחות הפוכות ב 30 מעלות צלזיוס.
9. למחרת, להציף את צלחות דפוס האינטרנט עם 5 מיליליטר של PB וO חנות / N ב 4 ° C או 4 שעות בRT.
10. סנן את lysate הפאג דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטרולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש מניות הפאג זה סופי לניסויים נוספים כגון תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של חלקיקי הפאג, בידוד הדנ"א הגנומי הפאג לניתוח אנזים הגבלת DNA ורצף הגנומי באמצעות נהלים סטנדרטיים. לאחסון ארוך טווח של מניית הפאג, להוסיף כמות שווה של lysate הפאג לגליצרול סטרילי בבקבוקונים קטנים לאחסון בארכיון המניה ב -80 ° C.
    הערה: למי שלא חווה עם טכניקות הפאג אלה, משאב נהדר הוא אתר www.phagesdb.org הנגיש באינטרנט.

תוצאות

כדי להדגים שחזור של טכניקת ההעשרה משופרת לפאגים Arthrobacter, 30 דגימות קרקע שונות שמשו בזמנים ובמקומות שונים באביב ובקיץ של שנת 2014 של דגימות קרקע 30 אלה פאגים Arthrobacter ייחודיים התקבלו משל 22 דגימות קרקע שנאספו באמצעות העשרה זו הליך. הליך ההעשרה הסטנדרטי הניב פאגים ייחודיים משל 3 אותו דגימות הקרקע. דגימות ההעשרה יכולה להיות כייל הפאג גבוה מאוד הזקוק לדילול ראשוני לבודד את לוחות או כייל הפאג נמוך יחסית הדורש נפח גדול יותר של Arthrobacter מועשר לזיהו...

דיון

למרות ניסיונות רבים קודמים לבודד פאגים מסוגלים להדביק מארחי Arthrobacter, היו לנו הצלחה קטנה באמצעות הליכי העשרה סטנדרטיים. השיטה הכללית של העשרת חיידקים פיתחה והתאימה על ידי ואן Twest וKropinski ¹⁰ להעשיר פאגים מדגימות סביבתיות הוא הבסיס למרבית הליכי העשרה. ראיות ממחקרים קודמים מצביעות על כך ששיטות של ציפוי ישיר הפיקו לוחות זיהוי על זנים של Arthrobacter אם כי בשיעורי הצלחה נמוכים מאוד של בידוד ^5. בשיטת הציפוי הישירה, פאגים מופקים מדגימות קר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אבקת מרק LB	פישר	BP9722-2	עדיף להזמין אותם בכמויות גדולות.
אגר פישר מגורען		BP1423-2	עדיף להזמין אותם בכמויות גדולות.
מסנני מזרק 0.22 אום	פישר	09-719A
0.22 מסנני בוכנר אום	פישר	430320	ניתן להשיג יותר מ-50 מ"ל נוזל על ידי החלפה בזהירות של צינור הקבלה.
צינורות אפנדורף	פישר	05-408-129
5 מ"ל פיפטים בודדים	פישר	13-678-11D
50 מ"ל צינורות חרוטיים	פישר	76002844
15 מ"ל צינורות חרוטיים	פישר	76002845
10 מ"ל פיפטים בודדים	פישר	13-676-10J
25 מ"ל פיפטים בודדים	פישר	13-676-10K
נייר סינון איכותי של ווטמן	פישר	1001-824