מאמר שיטה

בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש Branchiomeric

DOI:

10.3791/52802

⸱

20 ביולי 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthodontics and Craniofacial Biology, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, 2Department of Biological Structure, University of Washington School of Medicine, 3Department of Biochemistry, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי לוויין משרירי ראש מסועפים של חולדה בת 9 שבועות. מקורם של השרירים בקשתות ענפיות שונות. לאחר מכן, תאי הלוויין מתורבתים על ציפוי נקודתי בגודל מילימטר כדי לחקור את ההתמיינות שלהם. גישה זו מונעת התרחבות ומעבר של תאי לוויין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיברוזיס והתחדשות שרירים פגומה עלולים לפגוע בהתאוששות התפקודית של שרירי החך הרך לאחר תיקון חיך שסוע. זה גורם לבעיות מתמשכות בדיבור, בבליעה וביניקה. מערכות תרבית חוץ גופית המאפשרות חקר תאי לוויין (תאי גזע מיוגניים) משרירי הראש חיוניות לפיתוח טיפולים חדשים המבוססים על הנדסת רקמות לקידום התחדשות השרירים לאחר ניתוח. מערכות אלו יציעו נקודות מבט חדשות לטיפול בחולי חיך שסוע. מוצג פרוטוקול לבידוד, תרבית והתמיינות של תאי לוויין משרירי הראש. הבידוד מבוסס על עיכול אנזימטי וטריטורציה לשחרור תאי הלוויין. בנוסף, פרוטוקול זה כולל שיטה חדשנית המשתמשת בציפויי ג'ל מטריצה חוץ-תאיים בגודל מילימטר, הדורש רק מספר נמוך של תאי לוויין לבדיקות התמיינות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על 1: 500 עד 1: 1000 תינוקות תערוכה שסועים מעורבים השפה ו / או חיך (CLP); כך זה מום המולד הנפוץ ביותר בבני האדם 1. השרירים של החיך הרך הם קריטיים לתפקודו של החיך הרך בדיבור, בליעה, ומציצה. אם שסוע של החיך הרך הוא הווה, שרירים אלה מוכנסים באופן חריג לקצה האחורי של עצם החיך.

החיך הרך נע מעלה ומטה במהלך נאום, מניעת אוויר לברוח דרך האף. ילדים עם שסע בחיך אין לי פונקצית שליטה זו וכתוצאה מכך תופעה הידועה בתפקוד velopharyngeal 2,3. למרות שפרוטוקולי הטיפול משתנים, התיקון ניתוחי של החיך הרך מתרחש בילדות המוקדמת (6-36 חודשים של גיל) 4. השרירים מוכנסים באופן חריג של החיך הרך ניתן לתקן בניתוח 5-7, לעומת זאת, תפקוד לקוי של velopharyngeal נמשך ב -7% עד 30%של החולים 2,3,8-10.

יכולתו של שריר שלד להתחדש דרך הפעולה של תאי לווין (SCS) היא מבוססת היטב 11,12. על פגיעה בשרירים, מאמנים מופעלים ולעבור לאתר של פציעה. לאחר מכן הם מתרבים, להבדיל, ולמזג ליצירת myofibers החדש או אלה תיקון פגום 13. מאמנים רגיעה להביע גורם שעתוק Pax7 14,15, בעוד צאצאיהם, myoblasts מתרבים, גם להביע גורם myogenic נחישות 1 (Myod) 16. myoblasts ההבחנה להתחיל להביע myogenin (MyoG) 17. בידול המסוף של myoblasts מסומן על ידי ההיווצרות של myofibers, והביטוי של חלבוני שריר ספציפי כגון שרשרת שרירן כבדה (MyHC) 16,18.

לאחרונה, מספר אסטרטגיות כבר בשימוש ברפואת רגנרטיבית לשפר התחדשות שריר של שרירי גפיים 19-23. מחקרים ספציפיים עלשרירי ראש branchiomeric חשובים גם משום שהוא הוכיח לאחרונה כי הם שונים משרירים אחרים בכמה היבטים 24. בניגוד לשרירי גפיים, זה כבר הציע שרירי ראש branchiomeric מכילים פחות SCS 25, להתחדש איטי יותר, ורקמת חיבור סיבית יותר נוצר לאחר פציעת 26 בנוסף, מתרבות מאמנים משרירי ראש branchiomeric גם להביע את גורמי שעתוק אחרים. לדוגמא, Tcf21, גורם שעתוק לבניית שריר craniofacial בחום לידי ביטוי בהתחדשות שרירי ראש אבל לא בהתחדשות שרירי גפיים 25. השרירים בחיך הרך של חולי CLP הם בדרך כלל קטנים ומאורגן היטב פחות בהשוואה לשרירי חיך רגיל 27,28. סיבים איטיים ומהירים גם נמצאים בשרירי החיך הרכים אבל הסיבים איטיים הם שופעים יותר. לעומת זאת, שרירים שסועים מכילים שיעור גבוה יותר של סיבים מהירים וגם אספקת נימים מופחתתלעומת שרירי חיך רכים נורמלים 29-31. סיבים מהיר נוטים יותר לפגיעה הנגרמת על-התכווצות 31-33. אספקת נימי עניים הנלווית עשויה גם לקדם סיסטיק 34,35. כל ההיבטים הללו עשויים לתרום לעניי ההתחדשות של שרירי חיך רכים לאחר סגירה שסועה כירורגית 36. לאור זאת, פרוטוקול לבידוד והאפיון של שריר ראש branchiomeric SCS הוא חיוני. זה מספק את האפשרות ללמוד ביולוגיה SC של שרירי ראש branchiomeric. בנוסף, ניתן לפתח טיפולים חדשים המבוססים על הנדסת רקמות לקידום התחדשות שריר לאחר הניתוח בCLP ותנאים אחרים להתפשר אזור craniofacial.

באופן כללי, ניתן לקבל SCS לאחר הניתוק של רקמת שריר 14. ממינסינג, עיכול אנזימטי, וטחינה הדקה נדרשים בדרך כלל כדי לשחרר מאמנים מהנישה שלהם. יכול להיות מטוהר SCS ידי מראש ציפוי על מנות ללא ציפוי 14,37,38, fractionation על Percoll 39,40, תא או ניאון או מגנטי מיון 41-43. כאן אנו מציגים פרוטוקול כלכלי ומהיר חדש לבידוד של תאי לווין משרירי ראש branchiomeric של חולדות מבוגרות צעירות. פרוטוקול זה מבוסס על כתב יד קודמת 14 ומותאם ספציפית לדגימות רקמה קטנות. הבידוד של מאמנים משרירי נציג מקורם -1, 2 nd, ו -4 קשתות branchial ה מתואר. לאחר בידוד, מספרים נמוכים של תאי לווין בתרבית על כתמי ג'ל מטריקס בגודל מילימטר ללמוד הבידול שלהם. גישה זו תמנע את הדרישה להרחבה וpassaging של מאמנים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים המתוארים במסמך זה אושרו על ידי הדירקטוריון המקומי לניסויים בבעלי חיים מRadboud ניימיכן האוניברסיטה בהתאם לחוקים ולתקנות (RU-DEC 2,013-205) הולנדיים.

1. כתמים תאי מטריקס ג'ל

  1. בצע את השלבים הבאים יום אחד לפני הבידוד:
    1. להפשיר ג'ל מטריקס aliquot (100 μl) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1.5 שעות. לדלל 1:10 ב הבינוני של הנשר שונה Dulbecco; עם 4,500 מ"ג / גלוקוז L, 4 המ"מ L- גלוטמין, ו -110 מ"ג / מיליליטר נתרן פירובט (DMEM). שמור את הג'ל מטריקס על 4 מעלות צלזיוס בכל העת. הערה: שינויי טמפרטורה פתאומיים יגרמו ציפוי אחיד והיווצרות גבישים.
    2. שמור את פתרון ג'ל מטריקס המדולל על קרח במשך 15 דקות.
    3. טרום צמרמורת micropipette 20 μl במשך 10 דקות.
    4. שים שקופיות קאמריות 8 היטב לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ ולהעביר את הצלחת על גבי משטח קר (לדוגמא חבילת מקפיא) למשך 10 דקות.
    5. השתמש micropipette מראש צונן לשים טיפה של ג'ל מטריקס 10 μl בכל טוב. שמור את צלחת פטרי על פני השטח הקרים לפחות עוד 7 דקות (איור 1 א).
    6. להסיר לחלוטין את הג'ל מטריקס הנותר (איור 1), ולייבש את הבארות על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה.

2. שרירי Dissection של הראש (Masseter, Digastric, וLevator Veli Palatini)

  1. לפני הנתיחה, להכין 50 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS) בתוספת 2% פניצילין, סטרפטומיצין (P / S). שמור על קרח.
  2. לאחר המתת חסד של עכברוש אחד צעיר מבוגר (9 שבועות) עם CO 2 / O 2, לערוף את הראש ולהסיר את העור מהראש. העבר את הראש לPBS קר כקרח בתוספת 2% P / S בשפופרת 50 מיליליטר.
  3. שריר המלעס (הנגזר מקשת branchial 1)
    1. מניחים את הראש עם צד אחד עד על כרית סיליקון ולתקן עם n המזרקeedles (איור 2 א).
    2. זהה את בלוטת הפרוטיד ועצב פנים (איור 2 א). לחשוף את fascia העמוק מכסה את הבלוטה. חותך את fascia ולהסיר את הבלוטה באמצעות מספריים לנתיחה. זהה את תעלת השמע החיצונית. עקוב אחר עצב הפנים מנקב stylomastoid ולהסיר בזהירות את הסניפים זמניים, הזיגומטית, ולחי עם להב מס '15 אזמל.
    3. לשחרר את הראש השטחי של השריר המלעס ידי הסרת fascia. לזהות ראשי שני שטחיים ועמוקים של השריר המלעס. עקוב אחר הראש השטחי עד אָלָל tendinous העבה שלה הוכנס בתהליך הזיגומטית של הלסת העליונה.
    4. הפרד את הגיד ממקורו בתהליך הזיגומטית עם מלקחיים ישר. לחתוך אותו בסכין אזמל מס '15 או מספריים לנתיחה ובזהירות חיים זה (איור 2).
    5. לנתח את הראש השטחי של masseter עד כניסתה בזווית וחצי הנחותה של tהוא רוחב פני השטח של Ramus של הלסת התחתונה עם מס '15 להב סכין מנתחים (איור 2 ג). עכשיו, להסיר לחלוטין את השריר.
  4. בטן אחורית של שריר digastric (הנגזרת מקשת 2 nd branchial)
    1. מניחים את הראש במצב שכיבה על משטח סיליקון ולתקן עם מזרקים (איור 3 א).
    2. הסר את השומן תת עורי שמעל שני sublingual ובלוטות submandibular. בשלב הבא, להסיר את fascia ובלוטות באמצעות מספריים לנתיחה השטחיים. לחשוף את השרירים digastric (קדמית ואחורית בטן).
    3. החזק את הגיד הקדמי של הבטן האחורית עם מלקחיים ישר, לחתוך אותו, ולנתח אותו בזהירות עד שמקורו בבולת התוף (איור 3). לעשות את אותו הדבר בצד הנגדי.
  5. שריר Levator palatini Veli (הנגזר מקשת branchial 4)
    1. לאחר הנתיחה של הבטן האחורית של שריר digastric, למקם את השרירים stylohyoid, למשוך אותו לרוחב, ולהסיר אותו (איור 4 א) בזהירות.
    2. למקם את הגיד של palatini Veli Levator שמחדיר בבולת התוף (איור 4 א). לנתח את זה בזהירות ולחתוך אותו משני הצדדים.
    3. חפש את קנה הנשימה והוושט שפועל מאחוריו. הרם את הוושט, ולחשוף את הלוע, הגרון וחיך הרך.
    4. למקם את האזור של החיך הרך שבי palatini Veli Levator מוכנס ולחתוך אותו רופפים (איור 4).
      הערה: מייד לאחר נתיחה, להסיר בזהירות גיד ורקמות חיבור מכל שריר מתחת למיקרוסקופ סטריאו. לצלול כל הדגימות במהירות באתנול 70%, ולהעביר אותם לPBS קר כקרח בתוספת 2% P / S בשפופרת 15 מיליליטר.

3. בידוד של תאי לווין

  1. בצע את שלבי ההכנה הבאות לבידוד SC מ 3 קבוצות של שרירים:
    1. הכן 7.5 מיליליטר של pronase 0.1% בDMEM. סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. טרום חם הפתרון על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות לפני הבידוד.
    2. הכן 35 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% על סוסים סרום (HS) ו -1% P / S. טרום חם גם על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    3. הכן 15 מיליליטר מדיום התרבות אשר מורכב DMEM בתוספת 20% בסרום שור עוברי (FBS), 10% HS, 1% P / S ו 1% תמצית עובר עוף (CEE). טרום חם על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    4. שש טפטפות טרום מעיל פלסטיק (10 מיליליטר) עם HS ויבש במשך לפחות 10 דקות לפני השימוש.
  2. בשכונה התרבות, להעביר כל שריר לתוך באר של צלחת 6-היטב. שימוש במספריים לנתיחה, לחתוך את השריר בחתיכות קטנות של כ -2 מ"מ. היזהר שלא לקצץ את הרקמה יותר מדי.
  3. בזהירות להוסיף 2.5 מיליליטר של 0.1% פתרון pronase היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. נער בעדינות את הצלחת אחרי 20, 40, ו -60 דקות. הערה: duratio המדויקn של הדגירה תלויה בגורמים כמו גיל ומתח של בעלי החיים.
  4. צג מתחת למיקרוסקופ. בדוק את שברי השריר ולהפסיק את עיכול אנזימטי כאשר חבילות הסיבים לקבל מראה רפוי (איור 5).
  5. להוסיף 2.5 מיליליטר של DMEM בתוספת HS 10% ו -1% P / S. העבר לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות הצינורות ב 400 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant ידי decantation.
  6. הוסף 5 מיליליטר DMEM בתוספת HS 10% ו -1% P / S. פיפטה הפתרון למעלה ולמטה עם פיפטה 10 מיליליטר פלסטיק (טחינה דקה) לפחות 20 פעמים כדי homogenize הרקמה.
  7. בצנטריפוגה הצינורות ב XG 200 במשך 4 דקות. לאסוף את supernatant ולהעביר לתוך צינור 15 מיליליטר.
  8. הוסף 5 מיליליטר DMEM בתוספת HS 10% ו -1% P / S. פיפטה שוב עם טפטפת פלסטיק 10 מיליליטר עד שברי הרקמות עוברת בקלות דרך פיפטה.
  9. בצנטריפוגה הצינורות ב XG 200 במשך 4 דקות ולאסוף את supernatant בצינור 15 מיליליטר.
  10. Put מסננת תא (40 מיקרומטר) על צינור 50 מ"ל ולהעביר את supernatant המכיל את התאים ניתקו על המסנן. לשטוף עם DMEM 1 מיליליטר להתאוששות תא מקסימאלי.
  11. צנטריפוגה הצינורות XG ב 1000 עבור 10 דקות וזורקים supernatant עם pipet.
  12. Resuspend גלולה במדיום תרבות 300 μl ולספור את התאים בhemocytometer.

4. התמיינות של תאי לווין בכתמים תאי מטריקס ג'ל

  1. לדלל את ההשעיה התא להשיג 1.5 x 10 3 תאים ב 10 μl של מדיום התרבות.
  2. אבטח את הכיסויים של שקופיות תאים עם קלטת ולסמן את הנקודות עם טוש שחור בצד התחתון של זכוכית האובייקט.
  3. באמצעות micropipette, לשים טיפה של השעיה תא 10 μl על מקום ג'ל מטריקס. בדוק תחת מיקרוסקופ אם הירידה של השעיה תא הושמה כהלכה במקום. דגירה במשך שש שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  4. זהירly להוסיף 400 μl של מדיום התרבות (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / S CEE ו -1%) ודגירה במשך שלושה ימים על 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: בשלב זה, SC מבודד טרי חשופים לטראומה מסיבית (תקציר האנזימטית וטחינה דקה קשה) והם צריכים להתאושש. נא לא להפריע לתאים במהלך שלושת הימים הראשונים 37. בשלב הבא, מדיום התרבות יכול להיות שונה בהתאם לסוג של ניסוי.
    ניתן נזרעו כתמי מטריקס ג'ל עם צפיפות גבוהה של תאים (1.5-2.5 x 10 3/20 μl) עבור assay בידול. תרבות בינונית (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / S ו 1% תמצית עובר עוף) יכול להיות מוחלף בכל יום שלישי.
  5. לחלופין, אם הרחבה וחולפת היא רצויה לבצע את השלבים הבאים:
    1. להפשיר ג'ל מטריקס aliquot (500 μl) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1.5 שעות. לדלל 1:10 ב DMEM ולבצע את ההמלצות בנקודה 1.1.1.
    2. טרום צמרמורת פיפטה 10 מיליליטר במשך 10 דקות ב 4 ו# 176; ג.
    3. העבר את שלוש צלוחיות T75 על גבי משטח קר (לדוגמא חבילת מקפיא) למשך 10 דקות.
    4. השתמש פיפטה מראש צונן לשים 1 מיליליטר ג'ל מטריקס לכל בקבוק. בדוק שהשטח מכוסה לחלוטין. שמור את צלוחיות על פני השטח הקרים לפחות עוד 7 דקות (איור 1 א).
    5. להסיר לחלוטין את הג'ל מטריקס נותר עם פיפטה 10 מיליליטר, ולייבש את הבארות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    6. לאחר הספירה, resuspend SCS המבודדים הטרי ב 10 מיליליטר של מדיום תרבות (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / S ו 1% תמצית עובר עוף) וזרע בצלוחיות T75 מצופה מראש.
    7. אחרי שלושה ימים, לשנות הבינוני (ובכל יום שלישי) עד מפגש 80% הוא הגיע. לpassaging, לשטוף את צלוחיות T75 שלוש פעמים עם PBS. הבא להוסיף 1 מיליליטר 0.25% פתרון טריפסין ודגירה של שלוש דקות על 37 מעלות צלזיוס. גלול ב9 מיליליטר של מדיום התרבות (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / Sו 1% תמצית עובר עוף) וצנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. בטל supernatant. לאחר הספירה, resuspend 1 x 10 6 תאים ב1,000 μl של מדיום התרבות ולהקפיא את התאים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות פרוטוקול זה, שריר המעסה (צד אחד) מניב 0.8-1 x 106 תאים, השריר הדיגסטרי (הבטן האחורית) מניב 1.5-2 x 105 תאים, ושריר levator veli palatini מניב 1-1.5 x 105 תאים. תפוקת התאים תלויה בסוג השריר, המתח והגיל של החיה. לשם השוואה בין שלוש קבוצות השרירים, SCs טריים שבודדו נזרעו באותה צפיפות תאים (1.5 x 103/10 מיקרוליטר). מיד לאחר הבידוד, יותר מ-90% מהתאים המבודדים הטריים מבטאים Pax7 (איור 6).

תרביות יום 4, 7 ו-10 הוכתמו בנוגדנים נגד צביעה חיסונית של Pax7, MyoD, MyoG ו-MyHC. חמישה שדות שרירותיים נספרו לכל תרבית באמצעות יעד של פי 20. ביום 4 Pax 7 ו-Myo D באים לידי ביטוי בכל קבוצות השרירים (איורים 6 ו-7 ו-8), אולם הצאצאים של SatCs מהשרירים המאסטר והדיגסטריים מתחילים לבטא מיוגנין מוקדם יותר משריר ה-levator veli palatini (איור 9). ביום העשירי, הביטוי של MyoG מופחת מאוד בכל הקבוצות (איור 9). מספר ימים לאחר הזריעה על כתמי הג'ל של המטריצה החוץ-תאית, התאים המתרבים מתחילים להתמזג וליצור צינורות מיוטיובים מרובי גרעינים, המבטאים שרשרת כבדה של מיוזין. צינוריות קטנות נראות בבירור ביום השביעי (איור 10). ביום העשירי ניתן להבחין בעוויתות של השרירים (וידאו 1).

figure-results-1
איור 1: כתמי ג'ל מטריצה חוץ-תאיים בשקופית תא. (A) למניפולציה קלה, הנח את מגלשת תא 8 הבארות לתוך צלחת פטרי של 100 מ"מ. פיפט 10 מיקרוליטר ג'ל מטריקס חוץ-תאי בכל תא והניח אותו על משטח קר (7 דקות). (B) החלקה בתא לאחר הסרת עודף ג'ל המטריצה החוץ-תאית.

figure-results-2
איור 2: דיסקציה של שריר המאסטר. (א) ראש החיה במבט לרוחב. אוזן (E), בלוטת הפרוטיד (P) ועצב הפנים (VII). (B) אפונורוזיס גיידי (Te) של הראש השטחי של שריר המאסטר (Ms) והשריר הטמפורלי (T). הפרד את הגיד מהחדרתו בעזרת מלקחיים. (C) לנתח בזהירות את השריר עד להחדרתו בראמוס של הלסת התחתונה. E: אוזן, P: בלוטת הפרוטיד, VII: עצב פנים, T: שריר טמפורלי, Ms: ראש שטחי של שריר המעסה, Te: גיד, Mp: ראש עמוק של שריר המעסה.

figure-results-3
איור 3: דיסקציה של הבטן האחורית של השריר הדיגסטרי. (A) ראש החיה במצב שכיבה. מקם את הבלוטה התת-לסתית (Sg), שריר המאסטר (M), עצב הפנים (VII) ושריר הסטרנוקלידומסטואיד (SCM). הסר את הבלוטה התת-לסתית. (B) למקם את השריר הדיגסטרי הקדמי (AD) והבטן האחורית (PD). בעזרת מלקחיים ישרים, קח את הגיד הקדמי של הבטן האחורית, חתוך אותו ונתח אותו בזהירות עד למקורו בבולה התוף (ty). E: אוזן, Sg: בלוטה תת-לסתית, VII: עצב פנים, M: שריר מאסטר, SMC: שריר סטרנוקלידומסטואיד, AD: שריר דיגסטרי בטן קדמית, PD: שריר דיגסטרי בטן אחורית, Ty: בולה טימפנית.

figure-results-4
איור 4: דיסקציה של שריר levator veli palatini. (A) מבט כללי לאחר דיסקציה של השריר הדיגסטרי (הבטן האחורית). ניתן למקם את שריר הסטילוהיואיד (St) והגיד של levator veli palatini. שימו לב לקנה הנשימה (T) ולוושט (Es) העוברים מאחוריו. (B) אחרי הרמת קנה הנשימה והוושט, הלוע (P) נחשף. ה-levator veli palatini העובר לרוחב לכיוון החך הרך נראה כעת. החץ מציין את שריר מכווץ הלוע העליון שנותח; שימו לב לשרירי levator veli palatini משני הצדדים. E: אוזן, St: שריר סטילוהיואיד, VII: עצב פנים, M: שריר מאסטר, AD: שריר דיגסטרי בטן קדמית, PD: שריר דיגסטרי בטן אחורי, T: קנה הנשימה, Es: וושט, P: לוע, *שריר levator veli palatini.

figure-results-5
איור 5: הופעת רקמת השריר (A) לפני ו-(B) לאחר עיכול אנזימטי עם פרונאז. שימו לב שנראה כי צרורות השרירים משתחררים לאחר עיכול אנזימטי.

figure-results-6
איור 6: צביעה חיסונית של Pax 7. SCs מבודדים טריים, מוחלים על ג'ל מטריקס חוץ-תאי בתום הבידוד (כ-6 שעות לאחר עיכול הרקמות הראשוני). חמישה שדות שרירותיים נספרו באמצעות יעד פי 10 עם ממוצע של 210 תאים לשדה. כ-90% מהתאים חיוביים ל-Pax 7. DAPI: כחול, Pax7: אדום. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.

figure-results-7
איור 7: פקס 7, צביעה חיסונית של MyoD. תרביות יום 4, 7 ו-10 הוכתמו בנוגדנים נגד Pax7, וצביעה חיסונית של MyoD. (A-C) ו-(D-F) פוטומיקרוגרפים מייצגים של תרביות יום 4 ו-7 משריר המאסטר. (G ו-H) מספר גרעיני Pax7+ ו-MyoD+ לכל שדה מיקרוסקופי נספר ובא כאחוז ממספר הגרעינים הכולל (DAPI). DAPI: כחול, Pax7: אדום ו-MyoD: ירוק. סרגל מאזניים, 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: התפלגות Pax7±/MyoD± בתרביות מתאים חד-גרעיניים בתרביות משריר המעסה, הדיגסטרי וה-levator veli palatine. (א-ג) תרביות יום 4, 7 ו-10 הוכתמו בנוגדנים נגד Pax7, וצביעה חיסונית של MyoD. המספר הכולל של התאים מבוסס על המספר הכולל של הגרעינים (DAPI). (D) כימות נתונים של תאי Pax7±/MyoD±. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 9: צביעה חיסונית של מיוגנין. תרביות יום 4, 7 ו-10 הוכתמו בנוגדנים נגד מיוגנין. (א-ד) פוטומיקרוגרפים מייצגים של תרביות יום 4 ו -7 משריר ה- levator veli palatine. (E) מספר גרעיני MyoG+ לכל שדה מיקרוסקופי נספר ובא כאחוז מהמספר הכולל של הגרעינים (DAPI). (F) כימות נתונים של תאי MyoG+. DAPI: כחול, מיוגנין: ירוק. סרגל מאזניים, 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10
איור 10: צביעה חיסונית בשרשרת כבדה של מיוזין. תרביות יום 4, 7 ו-10 הוכתמו בנוגדנים כנגד שרשרת כבדה של מיוזין (MyHC). פוטומיקרוגרפים מייצגים של תרביות יום 4, 7 ו -10 מהשריר הדיגסטרי (DIG). ביום השביעי נוכחים צינוריות שריר קטנות ואילו ביום העשירי ניכרים צינורות ארוכים ומאורגנים היטב. סרגל מאזניים, 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: עווית מיוטיוב. דוגמאות לשני שדות מייצגים עם מיוטיובים מתעוותים מוצגות עבור תרביות יום 10 משריר דיגסטרי. אנא לחץ כאן לצפייה בסרטון זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SCs משרירי ראש מסועפים שונים בודדו מחולדת וויסטאר אחת בת 9 שבועות ותרבית ישירות על כתמי ג'ל מטריקס חוץ-תאיים ללא התרחבות ומעבר מוקדמים. לאחר הבידוד, התאים נספרו ונזרעו באותה צפיפות תאים. לבידוד מקביל של שלושה שרירים שונים, שיטה זו אורכת כ -4 שעות. כדי למנוע זיהום תרבית, שלב קריטי הוא שטיפה מהירה באלכוהול 70% לאחר דיסקציה של השרירים.

במהלך בידוד SC חשוב לחתוך את רקמת השריר לחתיכות קטנות (כ-2 מ"מ) אך להימנע מטחינה רבה מדי מכיוון שהדבר יגרום לתפוקת תאים קטנה בגלל נזק לתאים. כמו כן, יש לבדוק היטב את משך העיכול האנזימטי תחת המיקרוסקופ כדי למנוע נזק נוסף. מטרת העיכול היא לנתק את סיבי השריר. מכיוון שיותר מ-90% מהתאים המבודדים מבטאים Pax7, אין צורך בטיהור נוסף (איורים 6-8). זה מונע שלבי טיהור נוספים בשיטות אחרות כגון ציפוי מראש על כלים לא מצופים14,37,38, פיצול על פרקול39,40, או מיון תאים פלואורסצנטיים או מגנטיים41,43. לצורך טריטורציה חיוני לגרום לגזירה בין שברי הרקמה לפתיחת קצה הפיפטה מכיוון שהדבר מאפשר שחרור מכני של ה-SCs. אם הטריטורציה עם פיפטה של 10 מ"ל (קצה קוטר פנימי: 1 מ"מ) קשה, ניתן להשתמש תחילה בפיפטה של 5 מ"ל (קצה קוטר פנימי: 2 מ"מ). לחלופין, ניתן לחתוך פיפטות פסטר מזכוכית בקוטר הרצוי ולהשתמש בהן. שיטה זו פשוטה, יעילה ומאפשרת בידוד בו זמנית של SC מדגימות שרירים שונות.

ניתן גם לצפות את לוחות התרבית של SCs בג'לטין או קולגן, אך המחקרים הקודמים שלנו מראים שג'ל מטריצה חוץ-תאית טוב בהרבה לשמירה על הפוטנציאל המיוגני מאשר קולגן38. כתמי הג'ל החוץ-תאיים בגודל מילימטר (10 μl/Ø 2 מ"מ או 20 μl/Ø 4 מ"מ) מאפשרים לחקור התפשטות והתמיינות של SCs עם מספר מוגבל של תאים. לצורך בדיקת ההתמיינות נדרשים בערך פי 8 עד 20 פחות תאים בהשוואה לצלחת של 24 בארות (Ø 15.6 מ"מ), וכ-80 עד פי 200 פחות בהשוואה לצלחות פטרי של 35 מ"מ (Ø 35 מ"מ)14,38.

מכיוון שג'ל מטריקס חוץ-תאי הוא יקר, שיטה זו גם חסכונית יותר. בנוסף, ניתן להחליף את מגלשות החדר בהחלקות כיסוי מפלסטיק כדי להפחית עוד יותר את העלויות. להכנת כתמי הג'ל של המטריצה החוץ-תאית ייבוש לילה של מגלשות החדר הוא חיוני. מכיוון שכתמי הג'ל החוץ-תאיים של המטריצה שקופים, יש צורך לסמן את הכתמים בצד התחתון באמצעות תאורה אחורית. מגלשות התאים מקובעות בצלחת פטרי למניפולציה קלה. אין צורך בהרחבה נוספת של תרבית תאים, מה שמציע אפשרות לחקור את ה-SCs של שרירים קטנים יותר או דגימות שרירים קטנות. לחלופין, למשל עבור PCR או מבני שריר אם יש צורך בתאים נוספים, ניתן להרחיב תחילה את ה-SCs המבודדים הטריים בצלוחיות T75 כפי שצוין לעיל.

SCs שבודדו באמצעות פרוטוקול זה אינם מתאימים לטיהור נוסף עם ציטומטריית זרימה מיד לאחר הבידוד. העיכול עם פרונאז גורם לעיכול נרחב של אנטיגנים פני השטח14. יש לאפיין תחילה כראוי סרום סוסים וסרום בקר עוברי המשמשים לתרבית תאים לפני הבידוד, מכיוון שמספרי אצווה שונים השפיעו באופן דיפרנציאלי על התפשטות והתמיינות המיובלסטים.

בשנים האחרונות גובר העניין בשרירים שמקורם בקשתות המסועפות ובמזודרם הראש (למשל השרירים החוץ-עיניים)24. הוכח בבירור כי לשרירי הראש והגפיים יש תכונות שונות מאוד. נראה כי שרירי המעסה מבעלי חיים זקנים שומרים על יכולת ההתחדשות שלהם בהשוואה לשרירי הגפיים25,26. ל-SCs מהשרירים החוץ-עיניים יש יכולת התפשטות והתמיינות חזקה הדומה ל-SCs משרירי הראש, ומראים פוטנציאל חריטה גדול יותר מאשר SCs של שרירי הגפיים24.

התפלגות סוג הסיבים והרכב המיוזין משתנים בין קבוצות שרירים וגם בין מינים. שרירים שמקורם בקשת הענפים הראשונה בבני אדם מכילים סיבים איטיים ומהירים (תת-סוגים IIA ו- IIX), מיוזינים יילודים ומיוזינים האופייניים להתפתחות שריר הלב. במכרסמים שרירים אלה מכילים כ -95% סיבים מהירים מיוזין IIA ו- IIb) 44-46. מחקרים על שרירי עופות מראים כי SCs מסוגי סיבי שריר שונים משתנים ביכולת ההתמיינות. SCs מסיבים מהירים מתמיינים רק לסיבי שריר מהירים, בעוד SCs מסיבים איטיים יכולים להתמיין לשני סוגי הסיבים47. בנוסף, אחוז ה-SCs בסיבי שריר מהירים נמוך יותר מאשר בסיבי שריר איטיים48,49. זה מצביע על כך שיש לקחת בחשבון את התפלגות סוג הסיבים למחקרים על שרירים באזור הגולגולת. בדומה לשרירי חיך שסועים, ה- LVP במכרסמים מכיל כמעט אך ורק סיבים מהירים50. מסיבה זו, SCs מה-LVP מתאימים למחקרים פרה-קליניים בתחום החך השסוע.

פרוטוקול זה מציע אפשרויות חדשות לחקר SCs שמקורם בשרירי ראש מסועפים או שרירים קטנים אחרים או דגימות שרירים קטנות יותר. זה יקל על פיתוח טיפולים חדשים לשיפור התחדשות השרירים באזור הלסתות במצבים כמו חיך שסוע אך גם במצבים אחרים המשפיעים על שרירים קטנים יותר.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים סותרים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי מענק Mosaic (017.009.009) מהארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO) ומענק Start (S-13-167C) לחוקרים צעירים מקרן AO. Z.Y.R נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענק # AG021566, AG035377, NS090051).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחט היפודרמית 25  G 0.5  x  25  mBD Microlance300400
מספריים לניתוחבראוןBC154R
מיקרו מלקחיים ישרבראוןBD330R
להב אזמל כירורגי מס'  15Swann-Morton0205
אלכוהול 70%Denteck2,010,005
Permanox Slide, 8 ChamberThermo Scientific177445
6 באר צלחת תרבית תאיםGreiner bio-one657160
כלי תרבית תאים (100 x 20 מ"מ)Greiner bio-one664160
15 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי סטריליBD Biosciences352097
צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי 50 מ"לBD Biosciences352098
מסננת תאים (40 μ מ)גיבקו431750
10 מ"ל פיפטה סרולוגיתגריינר ביו-וואן607180
20  ומיקרו; l FT20Greiner bio-one774288
Matrigel, ללא פנול-אדוםBD Biosciences35623710 מ"ל
PronaseCalbiochem5370210  KU
פוספט בופרמלח Gibco14190-144500 מ"ל
Dulbecco's Modified Eagle Medium, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובאט ג'יבקו10569-010500 מ"ל
סרום בקר עוברי   פישר סיינטיפיק3600511500 מ"ל
סרום סוסיםגיבקו26050088500 מ"ל
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)גיבקו15140-122100 מ"ל
תמצית עוברי עוףMP ביומדיקל285014520 מ"ל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gritli-Linde, A. Molecular control of secondary palate development. Developmental Biology. 301, 309-326 (2007).
  2. Marrinan, E. M., LaBrie, R. A., Mulliken, J. B. Velopharyngeal function in nonsyndromic cleft palate: relevance of surgical technique, age at repair, and cleft type. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 35, 95-100 (1998).
  3. Morris, H. L. Velopharyngeal competence and primary cleft palate surgery, 1960-1971: a critical review. The Cleft Palate Journal. 10, 62-71 (1973).
  4. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  5. Boorman, J. G., Sommerlad, B. C. Musculus uvulae and levator palati: their anatomical and functional relationship in velopharyngeal closure. British Journal of Plastic Surgery. 38, 333-338 (1985).
  6. Bae, Y. C., Kim, J. H., Lee, J., Hwang, S. M., Kim, S. S. Comparative study of the extent of palatal lengthening by different methods. Annals of Plastic Surgery. 48, 359-362 (2002).
  7. Braithwaite, F., Maurice, D. G. The importance of the levator palati muscle in cleft palate closure. British Journal of Plastic Surgery. 21, 60-62 (1968).
  8. Inman, D. S., Thomas, P., Hodgkinson, P. D., Reid, C. A. Oro-nasal fistula development and velopharyngeal insufficiency following primary cleft palate surgery--an audit of 148 children born between 1985 and 1997. British Journal of Plastic Surgery. 58, 1051-1054 (2005).
  9. Phua, Y. S., de Chalain, T. Incidence of oronasal fistulae and velopharyngeal insufficiency after cleft palate repair: an audit of 211 children born between 1990 and 2004. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 45, 172-178 (1990).
  10. Kirschner, R. E., et al. Cleft-palate repair by modified Furlow double-opposing Z-plasty: the Children's Hospital of Philadelphia experience. Plastic and Reconstructive Surgery. 104, 1998-2010 (1999).
  11. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
  12. Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: still young and fascinating at 50. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59, 1041-1059 (2011).
  13. Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224, 7-16 (2010).
  14. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
  15. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102, 777-786 (2000).
  16. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210, 440-455 (1999).
  17. Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: the stem cell that came in from the cold. The Journal of Histochemistry And Cytochemistry. 54, 1177-1191 (2006).
  18. Andres, V., Walsh, K. Myogenin expression, cell cycle withdrawal, and phenotypic differentiation are temporally separable events that precede cell fusion upon myogenesis. The Journal of Cell Biology. 132, 657-666 (1996).
  19. Fukushima, K., et al. The use of an antifibrosis agent to improve muscle recovery after laceration. The American Journal of Sports Medicine. 29, 394-402 (2001).
  20. Grefte, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Skeletal muscle fibrosis: the effect of stromal-derived factor-1α-loaded collagen scaffolds. Regenerative Medicine. 5, 737-747 (2010).
  21. Jackson, W. M., Nesti, L. J., Tuan, R. S. Potential therapeutic applications of muscle-derived mesenchymal stem and progenitor cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 505-517 (2010).
  22. Sato, K., et al. Improvement of muscle healing through enhancement of muscle regeneration and prevention of fibrosis. Muscle, & Nerve. 28, 365-372 (2003).
  23. Tatsumi, R., Anderson, J. E., Nevoret, C. J., Halevy, O., Allen, R. E. HGF/SF is present in normal adult skeletal muscle and is capable of activating satellite cells. Developmental Biology. 194, 114-128 (1998).
  24. Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental biology. , (2014).
  25. Ono, Y., Boldrin, L., Knopp, P., Morgan, J. E., Zammit, P. S. Muscle satellite cells are a functionally heterogeneous population in both somite-derived and branchiomeric muscles. Developmental Biology. 337, 29-41 (2010).
  26. Pavlath, G. K., et al. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Developmental Dynamics. 212, 495-508 (1998).
  27. Koo, S. H., Cunningham, M. C., Arabshahi, B., Gruss, J. S., Grant, J. H. 3rd The transforming growth factor-beta 3 knock-out mouse: an animal model for cleft palate. Plastic and Reconstructive Surgery. 108, 938-948 (2001).
  28. Fara, M., Brousilova, M. Experiences with early closure of velum and later closure of hard palate. Plastic and Reconstructive Surgery. 44, 134-141 (1969).
  29. Lindman, R., Paulin, G., Stal, P. S. Morphological characterization of the levator veli palatini muscle in children born with cleft palates. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 38, 438-448 (2001).
  30. Hanes, M. C., et al. Contractile properties of single permeabilized muscle fibers from congenital cleft palates and normal palates of Spanish goats. Plastic and Reconstructive Surgery. 119, 1685-1694 (2007).
  31. Rader, E. P., et al. Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from normal and congenitally-clefted goat palates. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 44, 216-222 (2007).
  32. Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 45, 113-120 (2008).
  33. Macpherson, P. C., Dennis, R. G., Faulkner, J. A. Sarcomere dynamics and contraction-induced injury to maximally activated single muscle fibres from soleus muscles of rats. The Journal of Physiology. 500 (Pt 2), 523-533 (1997).
  34. Koch, K. H., Grzonka, M. A., Koch, J. The pathology of the velopharyngeal musculature in cleft palates). Annals of Anatomy. 181, 123-126 (1999).
  35. Fara, M., Dvorak, J. Abnormal anatomy of the muscles of palatopharyngeal closure in cleft palates: anatomical and surgical considerations based on the autopsies of 18 unoperated cleft palates. Plastic and Reconstructive Surgery. 46, 488-497 (1970).
  36. Carvajal Monroy, P. L., Grefte, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Wagener, F. A., Von den Hoff, J. W. Strategies to Improve Regeneration of the Soft Palate Muscles After Cleft Palate Repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. , (2012).
  37. Grefte, S., Kuijpers, M. A., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Myogenic capacity of muscle progenitor cells from head and limb muscles. European Journal of Oral Sciences. 120, 38-45 (2012).
  38. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7, 055004(2012).
  39. Kastner, S., Elias, M. C., Rivera, A. J., Yablonka-Reuveni, Z. Gene expression patterns of the fibroblast growth factors and their receptors during myogenesis of rat satellite cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 1079-1096 (2000).
  40. Yablonka-Reuveni, Z., Quinn, L. S., Nameroff, M. Isolation and clonal analysis of satellite cells from chicken pectoralis muscle. Developmental Biology. 119, 252-259 (1987).
  41. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119, 543-554 (2004).
  42. Gilbert, P. M., et al. Substrate elasticity regulates skeletal muscle stem cell self-renewal in culture. Science. 329, 1078-1081 (2010).
  43. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  44. Sciote, J. J., Horton, M. J., Rowlerson, A. M., Link, J. Specialized cranial muscles: how different are they from limb and abdominal muscles. Cells, Tissues, Organs. 174, 73-86 (2003).
  45. Rowlerson, A., Mascarello, F., Veggetti, A., Carpene, E. The fibre-type composition of the first branchial arch muscles in Carnivora and Primates. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 4, 443-472 (1983).
  46. Muller, J., et al. Comparative evolution of muscular dystrophy in diaphragm, gastrocnemius and masseter muscles from old male mdx mice. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 22, 133-139 (2001).
  47. Feldman, J. L., Stockdale, F. E. Skeletal muscle satellite cell diversity: satellite cells form fibers of different types in cell culture. Developmental Biology. 143, 320-334 (1991).
  48. Schmalbruch, H., Hellhammer, U. The number of nuclei in adult rat muscles with special reference to satellite cells. The Anatomical Record. 189, 169-175 (1977).
  49. Gibson, M. C., Schultz, E. The distribution of satellite cells and their relationship to specific fiber types in soleus and extensor digitorum longus muscles. The Anatomical Record. 202, 329-337 (1982).
  50. Carvajal Monroy, P. L., et al. A rat model for muscle regeneration in the soft palate. PloS One. 8, e59193(2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

תגיות

מאמרים קשורים