מפעילה תגובתי דבקה<em&gt; In vivo</em&gt; על ידי המוח הקדמי דקירת פגיעה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירת פגיעת דקירה קדמית בעכברים בוגרים. פגיעת הדקירה גורמת לגליוזיס תגובתי חמור ולהיווצרות צלקת גליה שניתן לבחון לאחר מכן בשיטות אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיות.

תקציר

בעקבות פגיעה במערכת העצבים המרכזית, אסטרוציטים עוברים מגוון רחב של שינויים ביוכימיים, מורפולוגיים ומולקולריים המכונים ביחד אסטרוגליוזיס תגובתי. לאסטרוציטים תגובתיים יש השפעות דלקתיות ומגנות שמעכבות ומקדמות, בהתאמה, תיקון עצבי. המנגנונים העומדים בבסיס התכונות התפקודיות המגוונות של אסטרוגליוזיס תגובתי אינם מובנים היטב. השגת הבנה טובה יותר של מנגנונים אלה היא קריטית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות לטיפול במערכת העצבים המרכזית הפגועה. כאן אנו מדגימים שיטה להפעלת אסטרוגליוזיס תגובתי במוח הקדמי של עכבר בוגר באמצעות נגע דקירה במוח הקדמי. מודל נגע זה הוא פשוט, אמין ודורש רק מכשיר סטריאוטקסי ולהב אזמל כדי לייצר את הפציעה. השימוש בנגעי דקירה כמודל פגיעה במוח הקדמי מבוסס היטב ומתאים למחקרים העוסקים במגוון רחב של תוצאות נוירופתולוגיות, כגון ניוון עצבי, דלקת עצבית ושיבושים במחסום הדם המוחי (BBB). לפיכך, מודל פגיעת הדקירה במוח הקדמי משמש ככלי רב עוצמה שניתן ליישם במגוון רחב של מחקרים על תגובת מערכת העצבים המרכזית לטראומה.

מבוא

אתגר מרכזי לפיתוח טיפולים מוצלחים לטיפול במערכת העצבים המרכזית הפגועה הוא הבנה חלקית של האירועים הרב-תאיים המורכבים המופעלים על ידי הטראומה. אסטרוציטים ריאקטיביים זוכים להכרה הולכת וגוברת כמטרה מבטיחה לטיפולים חדשים¹. למרות שהיסטורית נחשבים עוינים לתיקון עצבי, אסטרוציטים ריאקטיביים מוכרים כיום כמרכיבים קריטיים של תגובה נוירו-פרוטקטיבית מורכבת ורב-תאית הכוללת הנחתה של תהליכים דלקתיים והגבלת נזק משני וניוון עצבי^2-6. למרות שהמאפיינים הנוירופתולוגיים של גליוזיס תגובתי הוגדרו זה מכבר היטב, המנגנונים התאיים והמולקולריים המווסתים גליוזיס תגובתי והמערך המגוון של השלכות במורד הזרם נותרו לא מובנים היטב. הבנת המנגנונים המניעים גליוזיס תגובתית, כמו גם האירועים התאיים והמולקולריים הבאים, היא צעד חשוב לקראת פיתוח אסטרטגיות שמטרתן לקדם את התכונות הנוירו-פרוטקטיביות של גליוזיס תגובתית, תוך החלשת ההשפעות המזיקות.

כאן אנו מדגימים שיטה לגרימת אסטרוגליוזיס תגובתי חמור במוח הקדמי של עכברים בוגרים באמצעות פגיעת דקירה. בניגוד למודלים אחרים של פגיעה מוחית טראומטית (TBI), כגון פגיעה מבוקרת בקליפת המוח (CCI) או פגיעה בכלי הקשה נוזליים (FPI), הדורשים ציוד מיוחד כדי לייצר פציעה, הדקירה הקדמית דורשת רק מכשיר סטריאוטקסי כדי לייצב את הראש ולהב אזמל מס' 11. לפיכך, מודל נגע הדקירה במוח הקדמי נגיש באופן נרחב יותר למגוון רחב של מעבדות שאין להן גישה למכשירים המיוחדים הדרושים ליצירת פגיעה FPI או CCI. השיטה המתוארת כאן מאפשרת לחוקרים לעורר באופן אמין וחוזר תגובת גליוזיס חזקה כדי לחקור אירועים תאיים ומולקולריים עוקבים. לאחר ההתאוששות מהניתוח, בעלי חיים שקיבלו פגיעה בדקירה קדמית יכולים לשרוד תקופות ממושכות ללא צורך בטיפול מיוחד וניתן להחזירם למושבה למחקרים אקוטיים, בינוניים או כרוניים. למרות שפחות ניתן לתרגום קליני ממודלים של FPI או CCI של TBI, נגע מוחי קדמי המיוצר על ידי פגיעת דקירה משמש כמודל ניסיוני פשוט אך שימושי לחקירת מנגנונים ביולוגיים בסיסיים העומדים בבסיס גליוזיס תגובתי ואירועים נוירופתולוגיים אחרים בעקבות טראומה למערכת העצבים המרכזית.

פרוטוקול

למבוגרים עכברים (ישנים 3-4 חודשים) גבריים על C57BL / 6 רקע מעורב שמשו בפרוטוקול זה. בעלי חיים הוחזקו בשעתי אור 12 / מחזור כהה, ואפשרו גישה חופשית למזון ומים. כל הפרוצדורות שבוצעו בפרוטוקול זה נערכו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת דרקסל האוניברסיטה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש.

1. הכנת אזור ניתוח

1. לחטא שולחן כירורגית עם 70% אתנול, ואז לכסות את הספסל כירורגית כל עם רפידות סופגים ולארגן מכשירי ניתוח בסמוך לstereotaxic.
2. הגדר את ציוד stereotaxic ללא זרוע מניפולטור. מסדרים את כרית החימום על stereotaxic ומוגדר 37 מעלות צלזיוס. למנוע התחממות יתר של בעלי החיים על ידי הצבת חתיכה קטנה של נייר מגבת או כרית כירורגית בין בעלי החיים וכרית החימום.
3. בעזרת המספריים autoclaved, לחתוך לחתיכות קטנות של gelfoam autoclaved לתוך צלחת פטרי המכילה סטרילי תמיסת מלח 0.9% סטרילי עד Ready לשימוש.
   הערה: לשמור על סביבת עבודה סטרילית ידי שימוש במכשירי autoclaved ואספקת ניתוח סטרילי. מחדש לעקר מכשירי ניתוח במהלך ההליך או בבעלי החיים בין על ידי טבילה למעקר חרוז במשך 10-15 שניות, בהתאם לצורך. לשמור על כפפות נקיות לאורך כל ההליך על ידי שפשוף ידיים עם 70% אתנול, במידת צורך, כדי לחטא.

2. prepping עכבר לכירורגיה

1. הסר עכבר מכלוב בבית ולשקול (ז).
2. עכבר מקום לתא אינדוקציה isoflurane וחמצן מוגדר 2 ליטר / דקה ומאדה isoflurane עד 5 כדי לגרום למטוס של הרדמה כירורגית, כ 3-5 דקות. לפקח על נשימה וחוסר תנועה מואטת. בדוק שהעכבר מסומם באופן מלא באמצעות רפלקס קמצוץ הבוהן.
3. כאשר עכבר מסומם לחלוטין, למקם במסגרת stereotaxic, לאבטח את האף בחרטום, אשר מצורף עם צינורות לisoflurane. הכנס ברים אוזן לתוך תעלת אוזן ולהדק, הבטחת הראש היא יציבה.
4. לגלח את ראשך מאוזן לאוזן, ומבין העיניים למאחורי האוזניים.
5. לעקר את העור עם מגבונים לסירוגין של אלכוהול איזופרופיל ותמיסת יוד בטאדין, 3 פעמים כל אחד.
6. החל דמעות מלאכותיות לשתי העיניים כדי למנוע מהם מהתייבשות במהלך ההליך הכירורגי.

3. נוהל כירורגי

1. צג עומק ההרדמה על ידי צובט את הבוהן או זנב. העכבר הוא במישור הניתוחי המתאים כאשר אין תגובה, והנשימה איטית ואפילו.
2. לעשות חתך בעור parasagittal מרק מאחורי העיניים לכמעט בין האוזניים בתנועה אחת, חברה אחת באמצעות סכין אזמל מס '11. הזז עור בצד וקליפ צד ימין עם hemostat.
3. גולגולת ברורה של קרום שמעליה באמצעות הצד הקהה של אזמל מס '11 וכותנה הטתה applicators. לחלופין, למחוק את הגולגולת עם מוליך כותנה שקצהו טבול בשיעור של 0.9% תמיסת מלח. לאפשר לו להתייבש לחלוטין.
4. שלנוing שליט קטן, לסמן את הגבול הקדמי של פתיחת הגולגולת בזנב 1 מ"מ לתפר העטרה, והקצה השמאלי של פתיחת הגולגולת ליום 1 במ"מ לרוחב תפר sagittal (איור 1), עם סמן קבע. לאחר מכן לסמן את הזכות וגבולות הזנב של פתיחת הגולגולת ב 4 מ"מ מתפרי sagittal ו עטרה, בהתאמה (איור 1).
5. באמצעות מקדח 0.5 מ"מ, מתחיל לעשות craniotomy על ידי קידוח לאט הבא המתווה סמן הקבועה. הקפד שלא לפרוץ את הגולגולת לחלוטין. לחץ בעדינות על פיסת העצם הקודקודית עם מס '5 מלקחיים המבודדים, אזורים של חולשה ייתן דרך הלחץ. כאשר העצם דליל חלש מספיק לאורך ההיקף, חתיכת העצם מוכנה להסרת.
   הערה: אם קושי חוויות חוקר הסרת העצם בחתיכה אחת, זה מצביע על כך שהעצם לא היה דליל מספיק במהלך קידוח. שקול קידוח הגולגולת נוספת בבעלי חיים לאחר facilitaהסרה קלה te של חתיכת העצם.
6. באמצעות מצויד במחט G 23 מזרק 10 מיליליטר, למרוח כמות קטנה של תמיסת מלח 0.9% להשרות את העצם המבודד ואזור שנקדח.
7. צרף את זרוע מניפולטור לציוד stereotaxic. צרף להב סכין מנתחים מס '11 חדש לבעל הבדיקה עם הצד החד של הלהב מול rostrally.
   הערה: למרות שהרקמות מקורי ואת הזנב לחוות את הקצוות החדים ובוטים של הלהב, בהתאמה, הנזק המכני הנגרם על ידי הפציעה החודרת דומה בכל רחבי היקף הנגע. אנו צופים אין הבדלים משמעותיים במאפיינים עיקריים של דבק תגובה כוללים upregulation ביטוי GFAP או הפצה, בין חלקים מקורי ואת הזנב.
8. שמירת מהדרך זרוע מניפולטור, להרים בזהירות את העצם המבודד באמצעות 5/45 מלקחיים זווית. הכנס את קצה המלקחיים לצד של העצם והרמה המבודדים, שימוש במינוף למשוך את פיסת העצם שנשארה באחד פולתנועת l.
   הערה: היזהר שלא לדקור את המוח או להפריע הדורה מתחת לגולגולת.
9. קח חתיכה קטנה של קצף ג'ל נספג הספוג ומניח על המוח החשוף כדי למנוע ממנו להתייבש ולספוג את כל דם שעלולה להיות נוכח.
10. ברגע שקצף ג'ל הוא במקום, הנדנדה זרוע מניפולטור למקום ולהב להסתגל למרכז craniotomy מעל קצף ג'ל. הסר את קצף ג'ל ולהוריד את הלהב עד הקצה נוגע הדורה ללא ניקוב הדורה. מארק גב / קואורדינטות הגחון תוך שימוש בסולם ורניה על הזרוע האנכית של stereotaxic.
11. באמצעות זרוע מניפולטור, לאט לאט להוריד את הלהב 3 מ"מ בדיוק לתוך המוח. זו מושגת על ידי שימוש בסימונים בקנה מידה ורניה על זרוע מניפולטור. לאפשר להב להישאר במקום במשך 5-10 שניות. הזז את זרוע stereotaxic עם קובץ מצורף מקורי להב הזנב שלוש פעמים מאפשרות את הלהב כדי להגיע לגבולות מקורי ואת הזנב של פתיחת הגולגולת, לפני שעברתי לopposiסוף te.
    הערה: הדורה לא יוסר לפני החדרת הלהב. בניגוד לדורת החולדה, שהוא ~ 80 מיקרומטר בעובי ^7, הדורה העכבר היא משמעותי יותר רזה (רק כמה שכבות תאים עבים) ולא לייצר התנגדות ניכרת ללהב סכין המנתחים בכניסה. השתמש בלהב סכין מנתחים חדש עבור כל עכבר כדי להבטיח שכל חיה מקבלת פגיעה עקבית.
12. לאט לאט להעלות את זרוע stereotaxic, הסרת הלהב מהמוח. לאחר ההסרה של הלהב, מקום מייד חתיכת gelfoam אחרת על פני השטח של המוח כדי לספוג את כל דם או נוזלים עודפים.
13. בינתיים, להסיר את זרוע stereotaxic ולהשליך את להב סכין המנתחים מס '11. ברגע שהדימום נפסק, להסיר את gelfoam.
14. לסגור את הפצע על ידי תפירת העור עם תפר שאינו נספג, כגון ethilon או prolene. תפרים יש להסיר 9-10 ימים לאחר ניתוח.
15. החזר את העכבר לכלוב בבית שלה, ולאפשר העכבר כדי להתאושש לאט על חימוםכרית גרם ולפקח על כל סימני מצוקה. התאוששות מהרדמה מושרה isofluorane מתרחשת בדרך כלל בתוך 2-5 דקות לאחר ההסרה מisofluorane. אל תשאירו את בעלי החיים ללא השגחה עד שהוא חזר recumbancy sternal.
16. לנהל 0.5-1 מיליליטר של תת עורי תמיסה הרטמן כדי להבטיח לחות.

טיפול 4. לאחר ניתוח

1. באופן הדוק לפקח בעלי חיים שלאחר ניתוח עד להחלמה מהרדמה לפני ההחזרה למושבה.
   1. כדי להפחית את הכאב ואי נוחות לאחר ניתוח, לנהל 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות על ידי הזרקת IP ביצוע ההליך באופן מיידי.
   2. תצפיות על בעלי חיים במשך 2-3 ימים לאחר ניתוח לסימני מצוקה קשים כגון תנועות מוגבלות, חוסר הטיפוח, או ירידה במשקל. להרדים בעלי חיים מפגינים כל סימני מצוקה אלה ולהסיר מהמחקר.
2. כדי לבחון histopathology של רקמות פצועות, להרדים בעלי חיים על ידי סטןזלוף intracardial dard.
   1. בקצרה, להרדים חיות עם מנת יתר של קטמין / xylazine, אז perfused intracardially עם 15-20 מיליליטר של 0.9% NaCl, או עד שהכבד מתנקה מדם, ואחריו 60 מיליליטר של paraformaldehyde 4% בסיומו של הניסוי.
3. לנתח את מוח ולאחר תיקון-2-4 שעות בparaformaldehyde 4% לפני העברה לתמיסת סוכרוז 30%. מוח סעיף על cryostat ב40-60 מיקרומטר, ותהליך על ידי נהלים היסטולוגית או immunohistochemical סטנדרטיים, או כפי שמתואר בגרסיה ^8,9.

תוצאות

בגלל בעלי חיים שעברו הליך זה אינו דורשים תקופות הישרדות מיוחדות טיפול שלאחר ניתוח, קצרות או זמן ארוך טווח משולבים בקלות לתוך המחקר, בהתאם לצורך לחקור פתולוגיה אקוטית או כרונית בעקבות פציעה. תכונות עיקריות של דבק תגובתי, כגון גברת ביטוי של GFAP והיפרטרופיה של סומה, ניתן להבחין כבר ב2-3 ימים בעקבות פציעה. שלב השיא של התפשטות להאסטרוציטים תגובתי הוא בימים 3-5 בעקבות פציעה ^10. תוצאות הנציג שמוצגים להלן הן מבעלי החיים שקיבלו נגע דקירת פצע 7 ימים קודם לכן.

דיון

זה קריטי, כי הגולגולת או דורה שבבסיסם לא ניזוקו במהלך הקידוח. השתמש לחץ קל בעת קידוח על מנת להבטיח את הגולגולת לא ניקב. בנוסף, יש להקפיד בעת הרמת חתיכת הגולגולת כדי להבטיח את הדורה לא המריא עם העצם.

פציעת דקירת המוח הקדמי מתוארת כאן דגמי פציעה חודרת למערכת העצבים המרכזית. אם כי פחות מבחינה קלינית לתרגום מאשר דגמי TBI כגון FPI או CCI, מודל נגע דקירת המוח הקדמי משמש ככלי שימושי למגוון רחב של מחקרים שנועדו לבחון איר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
	Stereotax Harvard Apparatus	726049
מקדחה מיקרו במהירות גבוהה	מכשיר הרווארד	724950
להב אזמל נירוסטה, #11	MedVet	JOR581S
5/45 מלקחיים זוויתיים	Fine Science Tools	11251-35
ספוג קצף ג'ל 12 ס"מ x 7 מ"מ	פישר	NC9841478
Rb נגד GFAP	דאקו	Z033429-2	דילול - 1:20,000 (שדה בהיר); 1:1,000 (פלואורסצנטיות)
Shp anti-BrdU	Abcam	ab1893	דילול - 1:20,000 (שדה בהיר); 1:500 (פלואורסצנטי)
ביוטיניליזציה עז אנטי-ארנב	מעבדות וקטור	BA-1000	דילול - 1:400 (שדה בהיר)
ארנב ביוטיניל נגד כבשים	מעבדות וקטור	BA-6000	- 1:400 (שדה בהיר)
Alexafluor 488 עיזים נגד ארנב	Life Technologies	A-11008	דילול - 1:400 (שדה בהיר)
Alexafluor 568 חמור נגד כבשים	Life Technologies	A-21099	דילול - 1:1,000 (פלואורסצנטי)
DAPI טכנולוגיות חיים של כתמי חומצות גרעין		D3571	דילול - 1:1,000 (פלואורסצנטי)
קרזיל סגול אצטט	סיגמא אולדריץ'	C5042-10G	דילול - 1% (שדה בהיר)

דילול