מאמר שיטה

באתרו איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA

DOI:

10.3791/52836

⸱

21 במאי 2015

 ,  ,  , 
1Department of Oral Microbiology and Immunology, School of Dentistry and Dental Research Institute, Seoul National University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן תוארה שיטה לאיתור חיידקים בתוך רקמות משובצות פרפין באמצעות בדיקות DNA מכוונות 16S rRNA המכוונות ל-DIG. ניתן ליישם פרוטוקול זה כדי לחקור את תפקידם של חיידקים במחלות שונות כגון דלקת חניכיים, סרטן ומחלות חיסון דלקתיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוכחות חיידקים בתוך אפיתל הכיס ורקמת החיבור הבסיסית בביופסיות חניכיים מחולים עם דלקת חניכיים דווחה בשיטות שונות, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים, אימונוהיסטוכימיה או אימונופלואורסצנציה באמצעות נוגדנים ספציפיים לחיידקים, והכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) באמצעות בדיקה אוליגונוקלאוטידים עם תווית פלואורסצנטית. עם זאת, שיטות אלה אינן נמצאות בשימוש נרחב בגלל מגבלה טכנית או קשיים. כאן הוצגה שיטה לאיתור חיידקים בתוך רקמות משובצות פרפין באמצעות בדיקות DNA המסומנות ב-DIG. הרקמות המשובצות בפרפין הן הצורה הנפוצה ביותר של רקמות ביופסיה הזמינות בבנקים פתולוגיים. ניתן לזהות חיידקים באופן ספציפי למין או באופן אוניברסלי. אותות חיידקים מזוהים כצורות נפרדות (קוקוס, מוט, פוזיפורם וצורה שעירה) של חיידקים או צורות מפוזרות. הטכניקה מאפשרת לקבל מידע היסטולוגי אחר: האפיתליה, רקמת החיבור, ההסתננות הדלקתית וכלי הדם מובחנים היטב. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את תפקידם של חיידקים במחלות שונות, כגון דלקת חניכיים, סרטן ומחלות חיסון דלקתיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים לשחק תפקיד באטיולוגיה של מחלות פה שונות כגון חניכיים, דַלֶקֶת הַמוֹך, pericoronitis, צלוליטיס, ודלקת עצם. על מנת להבין את תפקידם של חיידקים בפתוגנזה של מחלה ולעקוב אחר ההשפעה של טיפולים, לוקליזציה של חיידקים בתוך הרקמה חשובה. הנוכחות של חיידקים בתוך רקמת חניכיים מחולים עם מחלת חניכיים הוכחה בשיטות שונות, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים 1,2, אימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence באמצעות חיידקים ספציפיים נוגדנים 3-7, וניאון הכלאה באתר (דגים) 8 באמצעות fluorescence- הבדיקה oligonucleotide שכותרתו מיקוד rRNA 16S. עם זאת, שיטות אלה אינן בשימוש נרחב בשל מגבלה או קשיים טכניים. לעומת נוגדנים, בדיקות מיקוד rRNA 16S קלות לייצר ולהשיג מינים-סגוליות. FISH הוכיח להיות כלי מצוין להדמיה של התרהeria בסביבתם הטבעית כגון biofilm שלט. עם זאת, יישום של דגים לדגימות רקמה מוגבל בשל autofluorescence של רכיבי רקמות שונים. לדוגמא, autofluorescence החזק של תאי דם אדומים לעתים קרובות מעכב את היישום של טכנולוגית הקרינה לרקמות מודלקות כשהם כרוכים בדימום 9.

כדי למקם חיידקים בתוך רקמות החניכיים המודלקות, ולכן, באתר שיטת הכלאה באמצעות digoxigenin (DIG) הבדיקה DNA -labeled פותחה ומיושמת בהצלחה 10,11. כאן פרוטוקול מפורט ללוקליזציה של חיידקים בתוך רקמות מוטבעים פרפין באמצעות פ בדיקות eubacterial -specific והאוניברסליות gingivalis תוארו. הוא התמקד בעיקר בסטנדרטיזציה של השיטה כדי שניתן תהיה לשכפל תוצאות דומות במעבדות אחרות. פרוטוקול זה מאפשר לוקליזציה של חיידקים בתוך ההקשר היסטולוגית שלהם וresuLTS הם מאוד לשחזור. הפרוטוקול המתואר ניתן להשתמש כדי למקם חיידקים או באופן מינים ספציפיים או אוניוורסלי ברקמות שונות. הבדיקה האוניברסלית שימושית במיוחד כדי לזהות חיידקים במחלות polymicrobial וללמוד את תפקיד פוטנציאלי של חיידקים במחלות שבי התפקיד של חיידקים מסוימים אינו ידוע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בדיקה הכנה

  1. ההגברה PCR של החללית
    1. לפ הבדיקה -specific gingivalis, להגביר קטע DNA 343-נ"ב של פ rRNA 16S gingivalis על ידי PCR באמצעות הדנ"א הגנומי של פ gingivalis ופריימרים הבאים: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'ו5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' 10. בצע amplifications עם תנאי המחזור הבאים: 35 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות 20 שניות אחרי ארכה 5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס 10,11.
    2. להגביר את הבדיקה eubacterial באמצעות 70-נ"ב קטע DNA (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') מסונתזים כoligonucleotide ופריימרים הבאים: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' ו5'-AGG GTT GCG CTC 11 'GTT-3. בצע amplifications עם תנאי המחזור הבאים: 40 מחזוריםבשעה 9 4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות 20 שניות אחרי ארכה 5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס 11,12.
    3. לזרז את מוצרי ה- PCR (≥500 μl) על ידי הוספת 3 נתרן אצטט M (pH 5.2) ואתנול 100% (ב- 10: 1: 2 יחס) ודוגרים ב -20 ° C לשעה 2.
    4. צנטריפוגה את התערובת על 14,000 XG במשך 15 דקות, resuspend גלולה במאגר TE 100 של μl, ולמדוד את ריכוז ה- DNA על ידי צפיפות אופטית ב 260 ננומטר.
  2. DIG-תיוג באמצעות ערכת תיוג וזיהוי DIG DNA
    1. לערבב 3 מיקרוגרם של הבדיקה עם מים לנפח סופי של 15 μl.
    2. לפגל את ה- DNA על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולצנן במהירות על קרח.
    3. הוסף 2 μl של 10x תערובת hexanucleotide, 2 μl של תמהיל dNTP תיוג, וμl 1 של אנזים Klenow 15 μl של ה- DNA מפוגל.
    4. לערבב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות עד 48 שעות ולעצור תגובה על ידי חימום על 65 מעלות צלזיוס.
  3. בדוק את הרגישות של הבדיקה שכותרת DIG באמצעות ערכת תיוג וזיהוי DIG DNA
    1. ידני 1 טען μl של דילולים סדרתי של חללית הבקרה החיובית המסופקים בערכה וng 1 של החללית שכותרת DIG על קרום הניילון ויבש במשך 5 דקות על RT.
    2. בקצרה להשרות את הקרום במאגר 2x SSC (0.3 M NaCl, 30 נתרן ציטרט מ"מ, pH 7.0) ו דגירה הקרום על 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לשתק את ה- DNA.
    3. בקצרה להשרות את הקרום במאגר חומצת maleic (MAB, 0.1 מ 'חומצת maleic, 0.15 מ' NaCl, pH 7.5) ו דגירה עם אנטי DIG phosphatase (AP) נוגדן -conjugated המדולל בסיסי (1: 5,000) ב 6 מיליליטר של תמיסת חסימה סיפק בערכה ב RT למשך 30 דקות.
    4. לשטוף את הממברנה עם MABT (MAB המכיל 1% Tween 20) ולהחיל 40 μl של פתרון NBT / BCIP מעורב עם חיץ 2 מיליליטר זיהוי (0.1 מ 'טריס HCl, 0.1 מ' NaCl, 0.05 M MgCl 2, pH 9.5) על גבי קרום 1 דקות. אם את הרגישות של הבדיקה שכותרתו היאאינו מספק, חזור על שלבים מ1.1.3 ל1.3.4.
    5. מדוד את ריכוז ה- DNA של החללית שכותרתו (OD260) ולהתאים את הריכוז עד 100 ng μl -1.
  4. בדקו את הספציפיות של הבדיקה שכותרת DIG
    1. לפגל דגימות הדנ"א הגנומי (25 ng 3 μl -1 לכל דגימה) ממיני חיידקים שונים, כוללים החיידק הממוקד על ידי הבדיקה הספציפית, על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולצנן במהירות על קרח.
    2. ידני לטעון את ה- DNA מפוגל על ​​קרום הניילון ויבש במשך 20 דקות ב RT.
    3. בקצרה להשרות את הקרום במאגר 2x SSC ודגירת הקרום על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לשתק את ה- DNA.
    4. חסום את הממברנה עם פתרון חסימה ב RT עבור שעה 1.
    5. לדלל את הבדיקה בng 1 μl -1 במאגר הכלאה, לפגל בדיקות מדוללים, ולהחיל על הממברנה.
    6. דגירה הקרום ב 45 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    7. לשטוף את הממברנה שלושפעמים עם חיץ 2x SSC.
    8. בקצרה להשרות את הקרום בMAB.
    9. דגירה עם הנוגדן אנטי DIG AP-מצומדות המדולל (1: 2,000) ב 6 מיליליטר של פתרון חסימה ב RT עבור שעה 1.
    10. לשטוף את הממברנה עם MABT ולהחיל 40 μl של פתרון NBT / BCIP מעורב עם חיץ זיהוי 2 מיליליטר.
    11. כאשר הבדיקה אינה משיגה את הספציפיות הצפויות, להגדיל את טמפרטורת ההכלאה עד הסגוליות הוא ציין.

2. הכלאה באתר

שים לב: כדי למנוע ייבוש של הדגימות וחומרים כימיים, לבצע את כל incubations בתא humidified המרופד במגבות נייר רטובות.

  1. דה-paraffinization והתייבשות של חלקי רקמות
    1. הכן 4 מיקרומטר סעיפי רקמות עבים מלוקים מוטבעים פרפין. פורמלין, paraformaldehyde, ומקבעים מבוסס אבץ בקנה אחד עם פרוטוקול זה.
    2. הכן את כל חומרים כימיים במי DEPC שטופל.
    3. שקופיות חום בתנור יבש ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ודגירת שקופיות ב RT למשך 30 דקות.
    4. לטבול את השקופיות בקסילן 100% במשך 5 דקות שלוש פעמים; להשתמש קסילן הטרי בכל פעם.
      הערה: האם הליך השעווה-דה זה במנדף כימי.
    5. לטבול את השקופיות באתנול 100% במשך 5 דקות פעמיים, תוך שימוש באתנול טרי בכל פעם, ורעננותם דגימות ב -90% סדרתי, 80% ופתרונות אתנול 70% במשך 5 דקות כל אחד.
    6. לטבול את השקופיות במי DEPC שטופל דקות 1 ולשטוף שקופיות בPBS (pH 7.4) DEPC שטופל במשך 6 דקות.
  2. Pretreatments של סעיפי רקמות
    1. לטבול את השקופיות ב 0.1 N חומצה הידרוכלורית עבור 20 דקות ולשטוף במי מגלשות DEPC שטופל למשך 30 שניות.
    2. לצייר מחסום הידרופובי סביב דגימות באמצעות עט שעווה.
      הערה: הגודל של המחסום הידרופובי תלוי בגודל של דגימות. לכן, הכרכים של חומרים כימיים המשמשים בשלבים הבאים משתנים בהתאם לגודלו של דגימות אבל צריכים למלא הי"דמחסום drophobic (50 μl לדגימות קטנות וμl 400 לדגימות גדולות).
    3. פנק את הדגימות עם 50-400 μl של proteinase K (1 עד 10 מיליליטר מיקרוגרם -1 בPBS DEPC שטופל) בתנור יבש על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולשטוף בשקופיות PBS 1x DEPC שטופל דקות 1.
    4. משרים שקופיות בparaformaldehyde 4% ב- ​​PBS DEPC שטופל במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף בשקופיות PBS DEPC שטופל דקות 1.
    5. משרים שקופיות ב 0.1 M triethanolamine-HCl (pH 8.0) המכיל 0.5% אנהידריד אצטית עבור 20 דקות ולשטוף במי מגלשות DEPC שטופל למשך 30 שניות.
  3. הכלאה עם בדיקה ושטיפה
    1. לטבול את השקופיות במאגר SSC 2x במשך 20 דקות.
    2. לדלל את הבדיקה בng 1 μl -1 במאגר הכלאה (4x SSC, 50% [כרך / כרך] פוראמיד, הפתרון של 1x Denhardt, 10% [כרך WT /] סולפט dextran, 0.1% [כרך WT /] נתרן גופרתי dodecyl, 0.4 מיליליטר מ"ג -1 DNA זרע סלמון). עבור פקדים שליליים, לערבב את החללית שכותרתו עםסכום עודף של פי 10 מבדיקה שכותרתו שאינה.
    3. לפגל הבדיקות מדוללים ולהחיל 50-400 μl על סעיפי רקמות. במקום להחליק כיסוי בשקופית וחותם עם לק.
    4. שקופיות חום בPCR מכונה על 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומגלשות דגירה בO תא humidified / N ב 45 ° C או בטמפרטורה אופטימלית נקבעו בצעד 1.4.11.
    5. לקרר את השקופיות על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, להסיר את המכסה מחליק, לטבול את השקופיות במאגר SSC סידורי כמו הדברים הבאים: 4x SSC במשך 10 דקות, (45 ° C) 2x SSC מראש התחמם במשך 20 דקות, 2x SSC במשך 10 דקות, ו0.2X SSC במשך 10 דקות.
  4. זיהוי עם נוגדן אנטי DIG AP-מצומדות
    1. לשטוף שקופיות בMABT במשך 5 דקות.
    2. לחסום עם 50-400 μl של חסימת פתרון עם 1% Tween 20 במשך 20 דקות.
    3. להוסיף 50-400 μl של נוגדן אנטי DIG-AP מדולל חסימת פתרון (1: 1000) anld לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
    4. לשטוף שקופיות בMABT במשך 10 דקות.
    5. לטבול שקופיות במאגר זיהוי המכיל 1% Tween 20 במשך 5 דקות.
    6. פנק עם 50-400 μ של levamisole 1 מ"מ (במאגר זיהוי המכיל 1% Tween 20) במשך 5 דקות כדי להשבית phosphatase אלקליין אנדוגני.
    7. להפיץ 50-400 μl של הפתרון המעורבב מראש NBT / BCIP (בדילול במאגר זיהוי בשעה 1: 100) על כל דגימה ודגירת שקופיות בתא humidified ב RT עבור 2 עד 3 שעות עד האות פיתחה היא משביעת רצון.
    8. יש לשטוף את שקופיות עם מים מיוננים להפסיק הדמיה ולהחיל 50-400 μl של 0.05% [כרך WT /] ירוק מתיל ככתם דלפק על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    9. יש לשטוף את שקופיות עם מים מיוננים, ליבש באתנול 100%, ולטבול בקסילן.
    10. החל 80 μl של פתרון הרכבה על כל שקופית ולכסות עם מכסה מחליק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מופעי איור 1 dot סופג של בדיקות שכותרת DIG לעומת הבדיקה הבקרה החיובית המסופקת בערכה כדי לקבוע את רגישותם. 343 נ"ב פ הבדיקה -specific gingivalis היא 25 פעמים יותר רגישה מבדיקת eubacterial 70 נ"ב. איור 2 מראה הכלאה באתר של רקמות חניכיים המתקבלות מחולים עם מחלת חניכיים כרוניות לגילוי של פ gingivalis וeubacteria. אותות החיידקים, מוצגים בסגול, התגלו בתוך epithelia, propria lamina, וbiofilm הממוקם מחוץ לרקמה. עם זאת, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנה פרוטוקול למקם חיידקים בתוך רקמות מוטבעים פרפין באמצעות בדיקה DNA שכותרת DIG תואר. הבדיקה מתמקדת במולקולות ה- DNA או RNA של גן 16S rRNA חיידקים, ויכולות להיות מתוכננות בדיקות 16S rRNA המיקוד כמו גם מינים ספציפיים או אוניוורסלי. הכלאה מסוימת של פ הבדיקה -specific gingivalis לפ gingivalis אבל לא לחיידקים אוראליים אחרים כבר הראה בעבר 10. לעומת זאת, הבדיקה eubacterial הכלאה לכל DNA החיידקים הגנומי שנבדק (17 מינים שונים), למרות שיעילות הכלאה מגוונת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענק (2013R1A1A3005669) מקרן המחקר הלאומית של קוריאה ומענק (HI13C0016) של בריאות הטכנולוגיה מו"פ פרויקט, משרד הבריאות והרווחה הקוריאני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטי אנהידרידסיגמא6404
50% תמיסת דקסטרן סולפטMilliporeS4030
50X Denhardt' s פתרוןSigmaD2532
DEPCSigmaP159220
DIG ערכת תיוג וזיהוי DNARoche11 093 657 910
FormamideSigmaF9037
ImmEdge™ PenDakoH-400
LevamisoleVectorSP-5000
מגנזיום כלורידSigma246964
חומצה מאליתSigmaM0375
מתיל ירוקSigmaM6776
ParaformaldehydeSigmaP1648
PermountFisherSP15-500
תמיסת DNA של זרע סלמוןInvitrogen#15632-011
נתרן כלוריSigmaS9625
נתרן ציטראטDuksanD1420
נתרן דודציל סולפטאמרסקו227
Triethanolamine-HClSigma90279
Tris-HClResearch אורגניים3098T

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
  2. Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
  3. Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
  4. Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
  5. Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
  6. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  7. Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
  8. Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
  9. Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
  10. Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
  11. Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
  12. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
  13. Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
  14. Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
  16. Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ibridization in situargeting 16S rRNA

מאמרים קשורים