בו זמנית Vivo לשעבר בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי In vivo

סיכום

Ex vivo ERG יכול לשמש לתיעוד פעילות חשמלית של תאי רשתית ישירות מרשתית שלמה מבודדת של בעלי חיים או בני אדם. אנו מדגימים כאן כיצד ניתן להתאים מערכות ERG in vivo להקלטות ERG ex vivo על מנת לנתח את הפעילות החשמלית של תאי הרשתית.

תקציר

אות אלקטרורטינוגרמה in vivo (ERG) מורכב ממספר רכיבים חופפים שמקורם בסוגי תאי רשתית שונים, כמו גם רעש ממקורות חוץ-רשתיים. אקס ויוו ERG מספק שיטה יעילה לניתוח תפקוד תאי הרשתית ישירות מרשתית מבודדת שלמה של בעלי חיים או עיניים תורמות. בנוסף, ניתן להשתמש ב-ex vivo ERG כדי לבדוק את היעילות והבטיחות של חומרים טיפוליים פוטנציאליים ברקמת הרשתית מבעלי חיים או בני אדם. אנו מראים כאן כיצד ניתן להשתמש במערכות ERG in vivo הזמינות מסחרית לביצוע הקלטות ERG ex vivo מרשתית עכבר מבודדת. אנו משלבים את גירוי האור, היחידות האלקטרוניות והחימום של מערכת in vivo סטנדרטית עם מחזיק דגימה מעוצב בהתאמה אישית, מערכת זלוף מבוקרת כוח הכבידה ומיגון רעשים אלקטרומגנטי כדי להקליט אותות ERG ex vivo עם רעש נמוך בו-זמנית משתי רשתית עם תוכנת הרכישה הכלולה במסחרי in vivo מערכות. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד להשתמש בשיטה זו בשילוב עם טיפולים תרופתיים המסירים רכיבי ERG ספציפיים על מנת לנתח את התפקוד של סוגי תאי רשתית מסוימים.

מבוא

Electroretinogram (ERG) הוא טכניקה מבוססת היטב כי ניתן להשתמש כדי להקליט את הפעילות החשמלית של הרשתית מופעלת על ידי אור. אות ERG מופקת בעיקר משינויי מתח שנגרמו על ידי זרמי רדיאלי (לאורך הציר של קולטני האור ותאים דו קוטביים) זורמים במרחב תאי ההתנגדות של הרשתית. אות ERG הראשונה נרשמה בשנת 1865 על ידי הולמגרן מפני שטח של עין דג ^1. Einthoven וJolly 1,908 ² חילקו את תגובת ERG לתחילתה של אור לשלושה גלים שונים, נקראת a-, B-, וג-גלים, שכיום ידועים שישקפו בעיקר את הפעילות של קולטני האור, על תאים דו קוטביים, ואפיתל הפיגמנט תאים, בהתאמה ^3-8. ניתן להקליט ERG מהעיניים של בעלי חיים או בני אדם (in vivo) בהרדמה, מהכנת עין מבודדת ^9, על פני רשתית שלמה מבודדת (לשעבר vivo) ^3,10-15 או על פני שכבות רשתית ספציפיות עם microelectrodes (מקומיERG) ^4,16. מבין אלה, in vivo ERG הוא כיום השיטה הנפוצה ביותר להערכת תפקוד רשתית. זוהי טכניקה לא פולשנית שיכול לשמש למטרות אבחון או למעקב ההתקדמות של מחלות רשתית בבעלי חיים או חולים. עם זאת, בvivo הקלטות ERG לייצר אות מורכבת עם מספר מרכיבים חופפים, לעתים קרובות מזוהמות ברעש extraocular הפיזיולוגי (למשל, נשימה ופעילות לב).

ERG המקומי ניתן להשתמש כדי להקליט את האות על פני שכבות מסוימות של הרשתית אבל זה חודרני ביותר ויש לו את היחס הנמוך ביותר אות לרעש (SNR) בהשוואה לתצורות הקלטת ERG האחרות. ERG המקומי הוא גם תובעני מבחינה טכנית ודורש ציוד יקר (למשל, מיקרוסקופ וmicromanipulators). Transretinal ERG מהרשתית שלמה, מבודדת (לשעבר vivo ERG) מציע פשרה בין in vivo ושיטות ERG מקומיים המאפשרת יציב וHIGהקלטות h SNR מרשתית שלמה של בעלי חיים או בני אדם ^17. לאחרונה, שיטה זו שמשה בהצלחה ללמוד לתפקד מוט וקולטי אור חרוט ברשתית של יונקים, קופים ובני אדם ^18-20. בנוסף, בשל היעדר אפיתל הפיגמנט ברשתית vivo לשעבר, מרכיב ג-הגל החיובי של אות ERG מוסר ורכיב איטי שלילי בולט PIII מתגלה בvivo לשעבר ההקלטות. רכיב PIII האיטי הוכח מקורן את הפעילות של תאי גליה מולר ^ב21-23 הרשתית. לפיכך, לשעבר vivo שיטת ERG יכול לשמש גם כדי ללמוד תאי מולר ברשתית ללא פגע. גם מספר מחקרים הראו כי vivo לשעבר הקלטות ERG יכולים לשמש למדידת ריכוז של סוכנים תרופתיים סביב ²⁴ הרשתית ולבדוק את הבטיחות ויעילות של תרופות ^25-27.

מסחרי מרובים במערכות vivo זמינים ומשמש במעבדות רבות שלא בהכרח יש לי רקע אלקטרופיזיולוגיה נרחב. לעומת זאת, מכשירי vivo לשעבר לא היו זמינים עד לאחרונה ¹⁷ וכתוצאה מכך רק מעט מאוד מעבדות כיום מנצלות טכניקה רבת עוצמה זו. זה יהיה מועיל לבצע הקלטות vivo לשעבר ERG זמינים ליותר מעבדות במטרה לקדם את הידע שלנו על פיזיולוגיה והפתולוגיה ברשתית, ולפתח טיפולים חדשים למחלות מסנוורים. אנו מדגימים כאן מכשיר vivo לשעבר ERG פשוט ובמחיר סביר ¹⁷ ולהראות כיצד ניתן להשתמש בו בשילוב עם מספר מערכות vivo ERG הזמינים מסחרי בלהקליט איתות rod- ותיווך קונוס (a- וB-גלים) והפונקציה של תאי מולר (להאט PIII) מרשתית עכבר wild-type בשלמותה.

פרוטוקול

כל פרוטוקולי הניסוי היו בהתאם המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים המחקרים המוסדית באוניברסיטת וושינגטון.

1. הגדרה מחזיק זלוף והדגימה

1. הכן את הפתרון לזלוף הרשתית טרי ביום של הניסוי. השתמש במים מזוקקים וללא יונים. השתמש באחד משלושת הפתרונות הבאים.
   1. הכן יקרבונט המכיל 'הפתרון (1 ליטר): 1 בקבוק איימס' איימס התקשורת ו1.9 גרם של NaHCO _3,
   2. הכן את הפתרון של לוק (מ"מ): 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl _2, 1.2 CaCl _2, 10.0 HEPES, 20.0 ₃ NaHCO, 3.0 Na succinate, 0.5 גלוטמט Na, 0.02 EDTA, ו10.0 גלוקוז, ויטמיני ממ 0.1% ואמין חומצות
   3. פתרון HEPES שנאגר להכין רינגר (מ"מ): 133.3 NaCl, 3.3 KCl, 2.0 MgCl _2, 1.0 CaCl _2, 10.0 גלוקוז, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pHמותאם ל7.5 עם ~ 5.8 מיליליטר של 1 M NaOH, להוסיף L-15 0.72 גר '/ בינוני תרבות L ליבוביץ. השתמש 20-50 מיקרומטר DL-AP4 ו50-100 מיקרומטר BaCl ₂ לבודד את תגובת קולטי האור בכל מדיה זלוף.
2. הכן את הפתרון לאלקטרודות ²⁸ (מ"מ): 140.0 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl _2, 1.2 CaCl _2, 3 HEPES, 0.01 EDTA ולהתאים את ה- pH ל7.4-7.5 עם NaOH. פתרון אלקטרודה ניתן לאחסן ב RT במשך כמה חודשים.
3. להכין ולבדוק את בעל הדגימה.
   1. דבק נייר שחור / אפור מסנן על גבי הכיפות של חלק התחתון של בעל הדגימה (ראה איור 1 א). מורחים דבק אפוקסי 5 דקות שני מרכיבים בזהירות מסביב לקצוות של צמרות שטוחות של הכיפות. אם יש צורך, לעשות את זה תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
   2. חכה עד שהדבק הוא (כ -4 דקות) כמעט יבשות ולחץ על נייר הסינון על הכיפות באמצעות פריט שטוח. נייר סינון דבק לפחות יום אחד לפני הניסוי.נייר סינון ניתן להשתמש מספר פעמים אבל יש להחליף אחרי חודש של הקלטות. השתמש 70% אתנול לנקות כיפות בזהירות מכל שאריות דבק לפני התקנת נייר ההחלפה.
   3. מלא את ערוצי אלקטרודה עם פתרון אלקטרודה מנסה להימנע מכל בועות אוויר ולדפוק אלקטרודות גלולה סגורות עם מתאם הברגה לערוצי אלקטרודה (ראה איורים 1 א 'וב'). חבר את החתיכות העליונה ותחתונים של בעל הדגימה עם ארבעה ברגים ולמלא את שורות זלוף עם פתרון אלקטרודה.
   4. מדוד את ההתנגדות ומתח בין המוביל של כל זוג האלקטרודה באמצעות מודד (איור 1). התנגדות צריכה להיות מתחת ל -100 Ωk והמתח מתחת ל -10 mV אם הערוצים ללא בועה ואלקטרודות נמצאות במצב טוב.
4. יוצקים 400-700 מיליליטר של תקשורת זלוף בבקבוק הזכוכית. נפרד עוד 300 מיליליטר לשימוש בנתיחה של הרשתית ושלקרע אותו במקרר. הגדר את צינורות טפטוף בבלוק מחליף חום ולמקם את הבלוק שחומם מראש על צלחת החימום (ראה איור 1D).
5. הקף את הבקבוק עם מכסה שיש לו קשרים ל- CO ₂ / O ₂ גז (אם לוק של איימס "או משמש) ולצינורות טפטוף (ראה איור 1D). מחממים את הבקבוק עם התקשורת עד 37 ^מעלות צלסיוס ולמקם אותו על צלחת החימום או על החלק העליון של יחידת גירוי האור באמבט מים מוגדר 37 - C 39 ^{O 17.}
   1. ראש קווי זלוף על ידי מילוי אותם עם תקשורת זלוף ליזום הזרימה מונעת כוח המשיכה.
      1. במערכת LKC, הנח את הבקבוק בחלק העליון של יחידת ממריץ ¹⁷ כדי לספק זרימה הכבידתית משמעותית שמותאמת לאחר מכן על ידי רגולטורי זרימת שיעור בלי שהושפע מרמת ההפחתה של פתרון זלוף בבקבוק במהלך הניסוי.
      2. במערכת Ocuscience, למקם את pבקבוק erfusion בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את הרעש ואת מקום קווי פלט זלוף ארוך מבעל הדגימה (ראה שלב 2.8) הרבה מתחת לרמתו של בעל הדגימה (ובקבוק זלוף) כדי להגדיל את כונן הכבידה של הפתרון. להגן על קווי פלט אלה ולחבר את המגן לקרקע של המגבר כדי למנוע צימוד של רעש האלקטרומגנטים לאות ERG.
6. התאם את זלוף - 3 5 מיליליטר / דקה באמצעות רגולטורי ספיקה. חבר _2/95% גז 5% CO ₂ O מגליל עם רגולטור נכון ולהתאים את קצב הזרימה על מנת להבטיח מבעבע קבועה של התקשורת בבקבוק באמצעות אבן אוויר.

הכנת 2. דוגמא

1. להרכיב מכשירי נתיחה נקיים וחדים כולל microscissors ישר-להב, אחד או שתיים 45 ^o פינצטה, סכין גילוח ופיסת נייר סינון מלבני.
2. יוצקים כ -200 מיליליטר של perfu הקרפתרון שיאון בצלחת פטרי גדולה כל כך שכל החלק התחתון של בעל הדגימה (כולל כיפות) יכול להיות שקוע בפתרון. צעד זה הופך להיות חשוב כאשר ההרכבה הרשתית על הכיפות (ראה שלב 2.6). למרות כמה פתרונות נועדו להיות רווי בcarbogen (5% CO _2/95% O _2), זה לא חיוני לצורך הנתיחה ולא נעשה בניסויים שתוארו כאן.
3. לניסוי טיפוסי, לשמור על בעלי חיים ב12/12 שעות אפלים מחזור האור / וכהה להתאימם ל6-12 שעות לפני ההקלטות. להרדים את החיה משאיפת CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם תחת אור אדום עמום ולעשות את כל ההליכים תחת אור אדום או IR העמום הבאים (השתמש למשל, מסנן אדום מול מקור מיקרוסקופ האור).
   1. משוך את העיניים החוצה באמצעות פינצטה ולשים אותם בתקשורת. מניחים עין אחת בכל פעם על פיסת נייר קטנה (למשל, כמה נייר סינון רגיל) ולעשות כהדליק כ ברמה של serrata אורה תוך החזקת עין עם פינצטה (זה נעשה מחוץ לפתרון כאן).
4. לחתוך לאורך serrata אורה (או קרוב יותר לקו המשווה של העין) עם microscissors ולהסיר את הקרנית והעדשה. מניחים את כוס עין בתקשורת הקרה בצלחת פטרי הגדולה וחזור על אותו התהליך עם העין השנייה.
5. לחתוך חתך קטן מהחלק העליון של כוס עין לכיוון עצב הראייה על ידי שמירה על המספריים בין הרשתית ולובן העין על מנת לשמור על הרשתית כשלמה ככל האפשר. אחיזה בלובן העין משני צידי החתך באמצעות שתי פינצטה ולמשוך את פינצטה אחד משני כדי לנתק את הרשתית.
   1. חותך את עצב הראייה ולנסות לבודד את הרשתית עם כמות מינימאלית של מגע פיזי אל פני השטח דיסטלי. הרשתית תהיה בעיקר לנתק באופן אוטומטי מהרשתית במהלך תהליך הנתיחה. חשוב יותר, כדי למנוע הפרעה מכאנית של הרשתית מאשר לבצענתיחה במהירות, בדרך כלל ניתן מודגרות רשתית לפחות 30 דקות בפתרון ללא השפעה משמעותית על מאפייני התגובה.
6. הר הרשתית על הכיפות של בעל הדגימה (איור 1 ג). לטבול את החלק התחתון של בעל הדגימה בצלחת פטרי עם הרשתיות גזור. חלק את הרשתית, צד קולטי האור (המשטח הקמור של הרשתית המבודדת) כלפי מעלה, מעל לכיפה ולהרים את בעל הדגימה כך שהרשתית מצרפת על נייר הסינון. חזור על התהליך עבור הרשתית אחרת.
7. ייבש את צלחת בעל בזהירות כדי למנוע crosstalk החשמלי בין הרשתיות כמו גם הסטת רעש ואות. יש בעל דגימת O- טבעות סביב כיפות חלק התחתונה כדי למנוע דליפת פתרון בין התחתית והחלקים העליונים של בעל, כמו גם לעזור לבידוד חשמלי של הצדדים קולטי האור ותא גנגליון של הרשתית בודדת. צרף את החלק העליון של בעל עם ארבעה ברגים (ראה איור 1) ולמלא את ערוצי זלוף עם פתרון זלוף באמצעות מזרק ומחט.
8. העבר את בעל הדגימה ליד הבלוק מחליף החום ולחבר את קווי קלט והפלט זלוף לבעל הדגימה (1D איור). חבר את האלקטרודות למגבר ERG (אלקטרודות העליונה להתחבר לאדמה / מינוס הסיכה במגבר) ולצרף את יחידת ממריץ / שליטה בבעל הדגימה באמצעות מתאם או להחליק את כרית החימום ליחידת ממריץ תלוי באיזה in vivo משמשת מערכת ERG.

3. הקלטות

1. הגדר את הגדרות מגבר וגירוי באמצעות התוכנה של מערכת in vivo. הגדר את תדירות הרכישה לערך בין 1 kHz ו -10 ונמוך לעבור סינון 300 הרץ. אל תשתמש בסינון גבוה לעבור. השתמש 60 הרץ (או 50 הרץ באירופה) לחרוץ מסנן במידת צורך.
2. שיא בסיס ללא גירוי ושנינות אורh גירוי עמום (למשל., אור הירוק של -35 dB או 0.3 מ"ר MCD ^-2) לבדיקת חיבור חשמלי טוב בין האלקטרודות ומדגם רשתית. חכה 10 - 20 דקות לפני תחילת איסוף הנתונים, כך שטמפרטורה ובתפקוד רשתית להגיע למצב יציב.
   1. בחר פרמטרים גירוי פי כל ניסוי ספציפי ולהתחיל איסוף הנתונים. לדוגמא, משתמשת באור ירוק מ -40 עד 0 dB או מ0.1 עד 1,000 מ"ר MCD ^-2 למשפחת תגובת scotopic. השתמש על 2 עד 3 יומן-יחידות בהירות הבזקים בהקלטות photopic בי מוטות צריכה להיות מורחק על ידי אור הרקע (3-30 CDM ^-2) או הבזק בדיקה (מ"ר על 1.3 Cd ^-2 = dB 1, ראה איור 3).
   2. עם זאת, יש לזכור כי ערכי עוצמת אור המדויקים עשויים להיות מעט תלויים בכיול המערכת ותנאי ניסוי שלך. ככלל אצבע, בעוצמות בקנה מידה על ידי 5-10 פי לעומת in vivo הקלטות בעת שימוש באור ירוק ^17. כיסוי שחור עם פתחים מעל הרשתית (הכלולה במערכת המתאם המסחרית) ניתן להשתמש כדי להפחית את פיזור אור בבעל הדגימה ולהקל גירוי אחיד ושווה של שני הרשתיות על ידי כדור Ganzfeld של במסחר vivo מערכות.
      הערה: להקלטות מרשתית כהה מותאם, בעוצמות של הבזקי בדיקה המשמשים באקונומיקת ניסוי טיפוסית חלק זניח בלבד של פיגמנט, כך שחוסר ההתחדשות מונעת הרשתית היא לא בעיה. בנוסף, זה כבר הראה בעבר כי התחדשות פיגמנט החרוט עדיין יכולה להתרחש ברשתית המבודדת באמצעות תא מולר המחזור ²⁰ החזותי.
3. כניסויים יימשכו בדרך כלל בין 30 דקות עד כמה שעות, לפקח להיסחף בסיסיים, רמת רעש ויציבות תגובה במהלך הניסוי כשינויים באלה עלולים להצביע על בעיות טכניות.
   רעש מוגבר או ירידה: הערהאמפליטודות תגובת ד עשויה להצביע על בועות אוויר בערוצי זלוף או אלקטרודה, טמפרטורה נמוכה מדי או גבוהה, פתרון דליפה / שפך או עקירה של הרשתית.

4. ניקוי

1. לנתק את בעל דגימה מקווי זלוף, לפתוח אותו ולשטוף את הרשתית מנייר הסינון. הסר את האלקטרודות ולשטוף אותם במים מזוקקים (לא משתמש באתנול). נקה את בעל הדגימה (כולל ערוצי זלוף) עם אתנול ו / או מים מזוקקים. צינורות סומק זלוף בזהירות עם> 70% אתנול.
2. יש לשטוף את בקבוק זלוף עם מים מזוקקים (לא משתמש בחומרי ניקוי). אתנול יכול לשמש גם כדי לנקות את הבקבוק.

תוצאות

הקלטנו תגובות הבזק מסוג wild-כהה מותאם (WT) C57BL / 6 רשתית עכבר ידי ביצוע פרוטוקולי הניסוי שתואר לעיל ושמודגמים באיור 1 על ידי שימוש בפתרוני זלוף סטנדרטיים שונים (איור 2). גל התגובה וקינטיקה כמו גם הרגישות של קולטני אור מוט הופיעו דומים באיימס 'והתקשורת של לוק (איור 2 א' וב '). מצד השני, תחת פתרון HEPES שנאגר רינגר (לא O CO _2/95% ביקרבונט או 5% ₂₎ אמפליטודות התגובה היתה קטנה יותר באופן משמעו...

דיון

אנו מדגימים כאן את השלבים הקריטיים להשגת הקלטות vivo ERG לשעבר באיכות גבוהה בו זמנית משתי רשתיות עכבר מבודדות באמצעות רכיבים במערכת vivo ERG יחד עם vivo לשעבר מתאם ERG. במחקר זה אנו perfused שני הרשתיות מבעלי החיים עם אותו הפתרון (או איימס ', לוק של או רינגר) אבל זה גם אפשרי לינקב כל רשתית עם למשל פתרון שונה, למטרות בדיקת סמים. הצעדים החשובים ביותר לקבלת נתונים באיכות גבוהה הם מיגון מרעש אלקטרומגנטים, לנתיחה זהירה של ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
In vivo מערכת ERG	OcuScience	HMsERG	www.ocuscience.us/id77.html
In vivo מערכת ERG	LKC Technologies	UTAS-E 3000	www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex מתאם vivo מתאם	OcuScience	Ex VIVO ERG	www.ocuscience.us/id107.html
דיסקציה מיקרוסקופ	North Central Instruments	Leica M80	רשאי להשתמש בכל פולט מותג
IR	Opto Diode Corp.	OD-50L	www.optodiode.com
Prowler ראיית לילה היקפי	B.E. Meyers אלקטרואופטיקה	D4300-I	מוצר בדרגה צבאית.
מסנן אדום	Rosco Laboratories	Roscolux #27 אדום בינוני	ניתן להשתמש במקום מערכת IR
אור ראש אדום	OcuScience	ERGX011	www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors	WPI, Inc.	500086	www.wpiinc.com/
Dumont פינצטה #5	WPI, Inc.	14101
סכיני גילוח	Electron Microscopy Sciences	72000	www.emsdiasum.com
Scale	Metler Toledo	AB54-S/FACT	a href="http://www.sigmaaldrich.com/">רשאי להשתמש בכל מד ואלקטרודה pH של המותג
	Beckman Coulter	pHI 350	רשאי להשתמש בכל מותג
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	רשאי להשתמש בכל מותג
KCl	Sigma-Aldrich	60129	רשאי להשתמש בכל מותג
MgCl2	Sigma-Aldrich	63020	1.0 M תמיסה
CaCl2	Sigma-Aldrich	21114	1.0 M פתרון
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	עשוי להשתמש בכל מותג
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	עשוי להשתמש בכל מותג
נתרן ביקרבונט	Sigma-Aldrich	S6297	עשוי להשתמש בכל מותג
Ames medium	Sigma-Aldrich	A1420	עשוי להשתמש בכל מותג
BaCl2	Sigma-Aldrich	B0750	עשוי להשתמש כל מותג
DL-AP4	Tocris Bioscience	101	רשאי להשתמש בכל מותג
חומצה סוקסינית מלח דיסודיום	Sigma-Aldrich	224731	רשאי להשתמש בכל מותג
L-חומצה גלוטמית	Sigma-Aldrich	G2834	עשוי להשתמש בכל מותג
D-(+)-גלוקוז	Sigma-Aldrich	G7528	עשוי להשתמש בכל מותג
מדיום תרבית לייבוביץ L-15	Sigma-Aldrich	L4386	עשוי להשתמש בכל מותג
ויטמינים MEM	Sigma-Aldrich	M6895
חומצות אמינו MEM	Sigma-Aldrich	M5550
Carbogen	Airgas	UN3156	5% CO2