הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

"מטופל כמו" Orthotopic syngeneic עכבר הדגם של Hepatocellular Carcinoma גרורה

12.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52858

⸱

24 באוקטובר 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College of the City University of New York, 2Departments of Biology and Biochemistry, The Graduate Center of the City University of New York

במאמר זה

סיכום

ההתפשטות הגרורה של הסרטן היא הסיבה העיקרית למוות הקשורים לסרטן. אנו מספקים תיאור מעמיק של מתודולוגיה ניתוח ההישרדות שלנו להקמת מערכת "חולה-כמו" orthotopic מודל עכבר syngeneic לחקר המנגנונים של גרורות בגידולים מוצקים איבר.

תקציר

רוב מקרי המוות הקשורים לסרטן נגרמים על ידי גרורות של הסרטן ולא על ידי הגידול הראשוני עצמו. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של גרורות סרטניות עדיין אינם ברורים. מודלים של בעלי חיים חיוניים להבהרת המנגנונים ולהערכת אסטרטגיות חדשות לטיפול בסרטן גרורתי. כאן, ניתן תיאור מעמיק של מודל עכבר סינגני אורתוטופי "דמוי מטופל" לחקר מנגנוני הגרורות של גידולי איברים מוצקים. מתוארת השתלה כירורגית הישרדות של תאי קרצינומה הפטו-תאית של עכבר BNL 1ME A.7R.1 ישירות לכבד (איבר המוצא) של זן עכבר המעבדה המוכשר החיסוני המולד, BALB/c. ההצלחה והשחזור של מתודולוגיה זו ממליצה עליה לשימוש נרחב בהבהרת המנגנונים הביולוגיים של גרורות סרטן איברים מוצקים.

מבוא

קרצינומה של הכבד (HCC) היא אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר, עם פרוגנוזה גרועה ותוחלת חיים נמוכה. כמעט כל מקרי המוות הקשורים לסרטן נובעים מהתפשטות גרורתית של המחלה מהאיבר המקורי לאיברים מרוחקים נוספים2-6. התקדמות HCC היא תהליך מורכב. לכן, היכולת למדל את המיקרו-סביבה של הגידול הנמצאת באופן טבעי ב-HCC גרורתי במודלים של בעלי חיים יכולה להתגלות כדרך מוצלחת ושימושית לחשוף מנגנונים רלוונטיים בבני אדם. 7למרבה הצער, המנגנונים של גרורות סרטניות עדיין לא ברורים ברובם. לכן, יש צורך בהקמת מודלים בבעלי חיים שיאפשרו לנו להבהיר את המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של גרורות של סרטן כגון HCC3,5.

מערכות מודל עכברים הן גישה שימושית מאוד לתיחום מנגנונים והערכת אסטרטגיות חדשות לטיפול בסרטן אנושי גרורתי5,8. מערכות המודלים השונות של העכברים הקיימות כיום הן עדות למאמצי החוקרים לתאר נכון את מורכבות המחלה5,8,9.

Ogunwobi ועמיתיו השתמשו לאחרונה בגישה כירורגית הישרדות כדי להדגים הקמת מודל עכבר סינגני אורתוטופי חדש לחקר גרורות ב-HCC3. עבודתם ביססה מודל עכבר "דמוי מטופל" המסכם תכונות של HCCs אגרסיביים וגרורתיים3. הם הראו עוד כי ניתן להשתמש במערכת מודל עכברים זו כדי לחקור את הביולוגיה של תאי גידול במחזור הדם, וכי זה טומן בחובו פוטנציאל להשגת תובנות חדשות לגבי המנגנונים של גרורות סרטניות3.

מטרת מאמר זה היא לתאר בפירוט את המתודולוגיה המשמשת לביסוס מודל עכבר סינגני אורתוטופי "דמוי מטופל" זה של גרורות HCC3. המתודולוגיה כיצד להשתיל תאי HCC של עכבר BNL 1ME A.7R.1 ישירות לתוך הכבד (איבר המוצא) של זן עכבר המעבדה המוכשר החיסוני מסוג פרא, BALB/c3 באמצעות ניתוח הישרדות. בניגוד למודלים אחרים של גידול קסנוגרפט בעכברים שבהם מושתלים תאי גידול אנושיים בעכברים חסרי חיסון, מערכת זו היא סינגנית ולכן מתאימה לחקר תפקידה של מערכת החיסון בגרורות גידול3,5,8. גישה זו ככל הנראה תזכה לשימוש נרחב לחקר מנגנוני הגרורות בסרטן איברים מוצקים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה
כל המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) של האנטר קולג 'של האוניברסיטה של ​​העיר ניו יורק.

הערה: שמונה עכברי BALB / ג שמשו בהליך ניסיוני זו. חמישה עכברים / ג BALB הושתלו עם 5 X 10 6 תאי קרצינומה hepatocellular BNL 1ME A.7R.1 עכבר כדי לייצר גידולים הראשוניים. שלושה עכברי BALB / ג ללא השתלות שמשו כקבוצת ביקורת. BNL 1ME A.7R.1 היא שורת תאי קרצינומה עכברית hepatocellular שנגזרה על ידי שינוי כימי משורת תאי hepatocyte שאינו סרטנית בעכברי BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 התקבל מהסוג האמריקאי תרבות האוסף (ATCC).

1. טרום ניתוח

  1. ודא עכברים שלכל ניתוחי ההישרדות בריאים. כדי להבטיח שעכברים בריאים, לבדוק סימנים של התייבשות על ידי האהלה של העור. אין להשתמש בעכברים עם כל ראיה של מחלה או דאיסטרס בניסויים אלה.
  2. לשקול עכברים כדי לוודא שהם לא בתת משקל. ודא שהמשקל הוא לפחות 16-20 גרם.
  3. הכן 5 × תאי HCC עכבר 10 6 BNL 1ME A.7R.1 להשתלה לעכבר:
    1. תקשורת לשאוב מ- 10 מיליליטר 60% - 70% צלחת תרבית תאים ומחוברות של תאי HCC עכבר A.7R.1 BNL 1ME. לשטוף פעמיים עם 5 מיליליטר PBS. הוסף 2 מיליליטר של טריפסין לצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם האוויר ו 5% CO 2 למשך 5 דקות.
    2. בהמשך לכך, פיפטה 10 μl trypsinized תאים לתוך hemocytometer ידני לספירת תאים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 10X. לספור את המספר הכולל של תאים הנמצאים בארבעה הריבועים הפינתיים הגדולים ולהכפיל את הגורם לדילול במספר הכולל של תאים. לאחר מכן, לחלק במספר הריבועים נספרו ולהכפיל ב -10 6 לריכוז התאים (תאים למ"ל).
    3. שימוש בחישוב, לאסוף 5 מיליון תאים לכל עכבר בסטרילי1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge. תווית 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge.
  4. Resuspend 5 × 10 6 תאי BNL 1ME A.7R.1 עכבר HCC בשל נאגר מלוח פוספט 100 μl (PBS). לשמור על תאים אלה על קרח עד השתלה בניתוח.
  5. לבצע פעולות הנדרשות להכנת עכברים לניתוח כגון אינדוקציה הרדמה ושיער גזיר מציוד וחומרי סטרילי כדי למנוע זיהום.
  6. לגרום להרדמה כללית בעכברים על ידי שאיפה של isoflurane באמצעות מכשיר אדים isoflurane יחד עם חמצן בקצב זרימה מתמיד של ריכוז 1 ליטר לדקה (כ. 2.1%). הערה: מערכת היא עצמאית, וכוללת מאדה דיוק, אספקת חמצן ופחם מיכל שצמוד למעגל נשימה הדרוש להדחת גז / הרדמה.
  7. ודא שהרדמה היא נאותה כדי למנוע את החיה מעובר כאב במהלך הניתוח. בצע הבוהן קמצוץ ולצפות בבעלי חיים לאי-responתאוות כדי לאשר הרדמה.
  8. באותו זמן, לעבור את קו השסתום, חותם לתיבה ופתוח לחרטום.
  9. ברגע שהעכבר הוא מורדם, למרוח כמות קטנה של משחת עיניים לקרניות כאמצעי מניעה מייבוש והנזק.
  10. בהמשך לכך, להעביר את בעלי החיים לאזור ההכנה, עם החרטום ממוקם כראוי ומחובר (להרדמת תחזוקה). הכן את האתר של החתך הניתוחי לניתוח על ידי הסרת שיער באזור הכנה זו.
  11. ודא שהאזור של ניתוח הוא במיקום ללא כל הפעילות אחרת.
  12. ודא שמשטח העבודה יציב ומחוטא כראוי, לא הוכתם ולפני הניתוח ללא עומס. מניחים פיסת פשתן או מגש כירורגית על זה סטרילי.
  13. ודא שהשדה האופרטיבי הוא זמין רק אנשי ביצוע הניתוח. ודא שחדר הניתוח הוא ניקה ושטף עם חומר ניקוי מתאים וריסס עם disinfe מתאיםctant.
  14. לוודא שהוא גם ממוקם במרחק של דלתות וחלונות כזרמי אוויר יכול להתפשט אבק מוביל לזיהום של האתר.
  15. לבצע את ניתוח ההישרדות עם מכשירים סטריליים. כך או לספוג מכשירים בחומר חיטוי בהתאם להמלצתו של היצרן או החיטוי. השתמש בחומרים מתכלים בסיסיים סטרילי כי הם מוכנים לשימוש.
  16. מכשירים נפרדים לפי פונקציה כדי למנוע זיהום של אזורים סטריליים.
  17. לגלח כ 1 אינץ 'סביב האתר של חתך (חתך קו האמצע) כדי לגשת לכבד של בעלי החיים. להסיר את השיער מבעלי החיים מהמקום של ניתוח.
  18. לאחר גילוח, לשפשף את האזור עם סבון חיטוי (לשפשף בטאדין כירורגית) ולשטוף את חומר החיטוי העודף משם עם פתרון PBS סטרילי. בצע את זה כמה פעמים, בתהליך שנמשך כ לשפשף כל 5 דקות. הסר והושלך כפפות משומשות.
  19. לאחר מכן, לשנות לביגוד מגן כגון surgicשמלת אל, ראש לשפשף, ופניו מסכה. בשלב הבא, לטהר את הידיים עם פתרון לשפשף נכון לפני שתרכיב את כפפות מנתחים. הערה: זה הוא צעד הכרחי כדי למנוע שפיכה ומזהם את האתר כירורגית עם מזהמים פוטנציאליים.

2. ניתוח

  1. לספק מקור חום חיצוני לחום לאורך כל התקופה של הרדמה. בעלי החיים עלולים להיתקל כמה היפותרמיה בגלל הרדמה גורמת להפרעות בויסות החום; לכן, לשמור על טמפרטורת הגוף.
  2. הנח את העכבר על גבה לאורך כל הניתוח.
  3. תקן את הגפיים קדמי, גפיים אחוריות והזנב של העכבר על שולחן הניתוחים עם חתיכות של קלטות כירורגית.
  4. לעשות חתך קו ישר באופן מיידי נחותים xyphisternum.
  5. השתמש במפשק כירורגי שמירה עצמית סטרילי לחשוף את הכבד.
  6. עם מזרק שמחט 20G, לאט ובזהירות להזריק של PBS 100 μl המכיל 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1תאי העכבר HCC לאונה הימנית של הכבד.
  7. לאחר הסרת המחט, תחול מקלון צמר גפן סטרילי דקות לפחות 1 לעצור כל דימום פוטנציאלי עקב גבוה כלי דם של הכבד.
  8. סגור את הרקמה התת עורית עם תפר נספג ואחרי סגירת עור באמצעות קליפים כירורגית. בהמשך לכך, לנקות את הפצע שוב עם לשפשף בבטאדין. הערה: הפעולה זו תבטיח את סגירת פצע הניתוח.
  9. תת עורי לתת למלח רגיל 100 μl.

3. לאחר ניתוח

  1. מייד לאחר ניתוח, להעביר את העכבר לכלוב נקי עם כרטיס זיהוי שלאחר ניתוח להודיע ​​מטפלים של מצב העכבר. לספק מזון ומים. הערה: מניסיוננו, עכבר שזה עתה עבר ניתוח יעלה בגורלם הטוב ביותר אם שוכנו לבד עם אוכל ומים רטובים לתקופה שלאחר הניתוח 24 שעות הראשונית.
  2. שמור חמים לבעלי החיים עם מנורת חום שיוצר חום לא מצוין 38 מעלות צלזיוס. Use מדחום למדידת הטמפרטורה עד העכבר התאושש לחלוטין.
  3. בית החיה בכלוב רצוי עם מצעי נייר כדי להבטיח נוחות.
  4. לאחר התאוששות ראשונית, לפקח על בעלי החיים לסימנים של אי נוחות, דימום, כאב ומצוקה. תן עצירות (0.05 -0.1 מ"ג / קילוגרם) כדי להקל על כאב. באופן הדוק לפקח על הפעילות, ההתנהגות ומראה, כמו גם מים וצריכת מזון לכ 2 שעות. אם אמבולטורי, להעביר את בעלי החיים בחזרה לאזור לדיור רגיל רגיל של עכברים וימשיך לעקוב במרווחים של 6-12 שעות שללאחר ניתוח 24 שעות. לבצע בדיקת משקל אם תרצה בכך.
  5. עם זאת, אם בעל החיים הוא שיש בעיות מחלים, לנקוט בפעולות טיפול תומך מתאימות. אם עכברים אינם מסוגלים לשחזר, הומני להרדים עכברים באמצעות CO 2 מחנק ונקע בצוואר הרחם. פעל לפי הנחיות מוסדיות מאושרות להמתת חסד.
  6. לאחר ניתוח, לבדוק ראיות קליניות של HCC שהיא בדרך כלל observabהפחתה משמעותית כle בציון מצב גוף. הערה: בשלב זה, גידול ראשוני סביר שפותח בכבד ובפיקדונות גרורתי שסביר להניח שפותחו בריאות.
  7. בשלב זה, להקריב את כל העכברים (ניסיון ושליטה) מעורבים בניסוי על ידי המתת חסד הומנית. להכפיף את העכברים למחנק פחמן דו חמצני: לשחרר באיטיות פחמן דו חמצני לתוך התא על פני תקופה של 5 -10 דקות. זה יגרום דום נשימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הכבדים של עכברים / ג BALB הושתלו עם 5 × 10 6 תאי HCC עכבר BNL 1ME A.7R.1. ראיות קליניות של פיתוח HCC הייתה נצפות 63 ימים שלאחר ניתוח. כתוצאה מכך, עכברים מורדמים אנושי. נתיחה לאחר המוות בוצעה בעכברים מורדמים. הריאות והכבד היו כריתה ובדיקת ברוטו זהירה בוצעה לזהות גידולים מקרוסקופית. בעכבר אחד, גידול שטחי נצפה על פני השטח של הכבד עם כמה קובץ מצורף לקיר הבטן (איור 1 א). בעכבר שני, כבד באופן חריג למראה נצפה. החריגות בצורה חזקות מאוד נראית כמו גידול שטחי

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה תיאור מעמיק של השיטה הוא נתון שלאחרונה דווח על ידי Ogunwobi ועמיתים של ההקמה המוצלחת של מודל עכבר syngeneic orthotopic של גרורות HCC (איור 2) 3. שיעור המיצוי של גידולים להליך זה הוא בדרך כלל גבוה. יש לנו שנצפה קודם לכן שיעור מיצוי גידול של 100% 3. עם זאת, השיעור המיצוי יכול להיות משתנה בהתאם לסמכותו של החוקר. בניסוי האחרון שבוצע על ידי סטודנט לתואר שני חדש תחת הדרכה, שיעור מיצוי הגידול היה נמוך כמו 40%. למרות שרוב הניסויים הסתיימו ב ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

ברצוננו להודות לפסקל דובואה על הגהה של המאמר. המחברים רוצים להודות גם לצוות מתקן החיות במכללת האנטר של אוניברסיטת העיר ניו יורק. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH RCMI להאנטר קולג'.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פינצטה מיקרו ניתוח Roboz(RS-5040)קצה 0.20 x 0.12 מ"מ
Graefe מיקרו חיתוך מלקחיים, קצה מעוקל משונןRoboz(RS-5111)1 X 2 שיניים, רוחב קצה מעוקל 0.6 מ"מ
מיקרו מפסק-אגריקולה (3 על 3 שיניים)Roboz(RS-6501)קהה 3 X 3 שיניים, עומק 4 מ"מ, מפוזר 25 מ"מ
מיקרו מפסק-גולדשטיין (3 על 3 שיניים)Roboz(RS-6503)קהה, 3 X 3 שיניים, עומק 4 מ"מ, מפוזר 19 מ"מ
קליפר ג'יימסון (מודד גידולים)Roboz(RS-6466)סולם 80 מ"מ/3 אינץ', מצופה כרום 
מספריים מיקרו חיתוך, מספריים טבעתיים גדולים,רובוז(RS-5852)להבים 23 מ"מ, אורך 4 אינץ', שוקיים שטוחות וטבעות גדולות
אזמל עם להבים, להליכי ניתוח עדיניםRoboz(RS-9861-36)
ידית אזמל Roboz(RS-9884)מוצק
Littauer תפר SissorsRoboz(RS-7074)אורך 4.5 אינץ'
מחזיק מחט חום, לקשירת תפרים קלהRoboz(RS-7960)לסת קמורה, שיניים עדינים
רפלקס 7 מ"מ תפסי פצע עם רפלקס 7 קליפ אפליקציהRoboz(RS-9262)שיטה חלופית בטוחה ומאובטחת לסגירת פצע
מגש מכשירים ומכסהRobozRT-1350S
מיני קוצץ עם להב ניתן להסרהRoboz (RS-5903)
Germinator 500 (The Germ Terminator) סטריליזטור יבשRobozDs-400, DS-401, DS-501לטיהור מהיר של מכשירי חיתוך מיקרו.   מכשירים מטהרים תוך 15 שניות 
מחטי מיקרו-הזרקהVWRBD305125מחט 25G
ישר וחד

מקורות

  1. Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
  2. Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
  3. Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765(2013).
  4. Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
  5. Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
  6. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
  7. Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
  8. Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
  9. Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
  10. Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
  11. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
  12. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
  13. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
  14. Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
  15. Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל עכבר אורטוטופיגרורות סרטניותהשתלה כירורגיתהזרקת תאיםגרורות בכבדקרצינומה הפטוצלולרית בעכבריםעכברי BALB/cגרורות גידול
"מטופל כמו" Orthotopic syngeneic עכבר הדגם של Hepatocellular Carcinoma גרורה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.