הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

12.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52861

⸱

9 באוקטובר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College of The City University of New York, 2Departments of Biology and Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida

במאמר זה

סיכום

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) הוכחו כממלאים תפקיד חשוב בגרורות גידול. כאן, מתוארת שיטה לבידוד והתפשטות של CTCs מהדם המלא של מודל גידול עכבר סינגני של גרורות קרצינומה של הכבד (HCC).

תקציר

גרורות סרטניות הן הגורם העיקרי למקרי מוות הקשורים לסרטן. מחקרים אחרונים הראו שתאי גידול במחזור (CTC) חשובים בגרורות סרטניות. ואכן, מספר ה-CTCs נמצא בקורלציה עם גודל הגידול. כאן, ניתן תיאור מפורט של מתודולוגיה לבידוד והתפשטות של CTCs ממודל עכבר סינגני של קרצינומה הפטו-תאית (HCC) המאפשר ניתוח במורד הזרם של מנגנונים מולקולריים בעלי פוטנציאל חשוב של גרורות גידול באיברים מוצקים. שיטה זו יעילה וניתנת לשחזור. זוהי טכניקה לא פולשנית ולכן יש לה פוטנציאל להחליף ביופסיה פולשנית של רקמות מבני אדם שעלולה להיות קשורה לסיבוכים. לכן, השיטה הנדונה כאן מאפשרת בידוד והתפשטות של CTCs מדגימות דם מלאות כך שניתן יהיה לבחון ולאפיין אותן. יש לכך פוטנציאל להסתגלות עתידית ליישומים קליניים כגון אבחון וטיפול ממוקד מותאם אישית.

מבוא

קהילת חקר הסרטן ידעה על קיומם של תאי גידול במחזור (CTC) מאז שנצפו לראשונה על ידי תומאס אשוורת' בשנת 18691. מאז, CTCs הוכחו כחשובים בגרורות גידול ובהתקדמות המחלה2-5. כיום, גידולים מוצקים הם גורם עיקרי לתחלואה ותמותה ברחבי העולם. CTCs הם תאים נדירים שמקורם בגידולים ראשוניים ועוברים דרך זרם הדם לאיברים שונים שרק חלק קטן מהם מתפתח בסופו של דבר לגרורות2-5. יש לציין כי קיים מתאם חיובי בין גודל הגידול למספר CTC3,4.

הבנה של ביולוגיה של CTC יכולה לתרום לחיפוש אחר טיפול ממוקד. יתר על כן, ל-CTCs עשויים להיות יישומי אבחון. כדי להשיג את היישומים הקליניים הפוטנציאליים הללו, יש להתגבר על כמה אתגרים עכשוויים לחקר CTCs. אתגר אחד קשור לעובדה ש-CTCs עשויים להיות נוכחים כתאים בודדים או כאשכולות והם עשויים אפילו להיות מסוגלים לשנות את הפנוטיפ שלהם בתגובה למיקרו-סביבת הדם2. יתר על כן, גילוי יכול להיות מאתגר מאוד, בין היתר בשל הספירה הנמוכה של CTCs (כמה עד מאות למיליליטר) בקרב מיליארד תאים המטולוגיים למיליליטר בדם6. עם זאת, בשנים האחרונות התעצם המחקר על היישומים הקליניים הפוטנציאליים של CTCs מסרטן איברים מוצקים.

למרות מאמצים אלה, האתגרים של לימוד והבנת תפקידם של CTCs נמשכים בשל נדירותם של CTCs וחוסר הכלים הטכנולוגיים הזמינים כיום. למרות האתגרים הללו, הפוטנציאל האדיר ליישומים קליניים ממשיך להוות תמריץ להמשיך במחקר על תפקידם של CTCs בגרורות סרטניות.

לאחרונה הצלחנו לבודד ולהתרבות CTCs בתרבית תאים ממודל עכבר סינגני אורתוטופי של גרורות קרצינומה הפטו-תאית (HCC)5. מטרת המאמר הנוכחי היא לתאר בפירוט את כל ההיבטים של המתודולוגיה המוצלחת. המשמעות של מתודולוגיה זו נעוצה בעובדה שניתן לשנות גישה זו על מנת לבודד ולהפיץ בהצלחה CTCs אנושיים בתרבית, ובכך לשפר את האפשרות למחקרי מבחנה של ביולוגיה של CTC.

ישנם מספר יישומים קליניים פוטנציאליים לשימוש ב-CTCs. CTCs עשויים להיות שימושיים לפרוגנוזה, ניטור תגובה, סינון, ניטור דינמי של שינויים מולקולריים בגידול וטיפול מותאם אישית4. לכן, להבנה טובה יותר של הביולוגיה של CTCs יש פוטנציאל גבוה להשפעה קלינית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: כל המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) של האנטר קולג 'של האוניברסיטה של ​​העיר ניו יורק.

1. נהלים טרום ניסוי

  1. עם ההגעה למתקן בעלי החיים, בתחילה בית 3 עכברי BALB / ג לכלוב עם מצעים העליונים ועץ שבב מסונן. ודא שיש לי העכברים גישה חופשית למזון, אוכל מכרסם פורינה, ומים. מצעים ומזון צריכים להיות מוחלפים פעמיים בשבוע בזמן שיש לנקות כלובי פעם בשבוע.
  2. לגרום להרדמה כללית בעכברים באמצעות מכשיר אדים isoflurane יחד עם חמצן בקצב זרימה קבוע של 1 ליטר לדקה. המערכת היא עצמאית וכוללת מאדה דיוק.
  3. בעלי החיים מיקום בקופסא פלסטיק שיש מאדה הדיוק וגז / מערכת הרדמה המחוברת אליו. בתחילה להגדיר את מאדה 2.5 עד בעלי החיים הוא חסרי הכרה, ובשלב זה להפחית את האידוי 2.
  4. באותו זמן, לעבורקו שסתום, איטום אותו לתיבה ולפתוח אותו לחרטום.
  5. הזז את בעלי החיים לאזור ההכנה, עם החרטום ממוקם כראוי ומחובר (להרדמת תחזוקה).
  6. הכן 5 × 10 6 תאי HCC עכבר BNL 1ME A.7R.1 להשתלה לכל עכבר. BNL 1ME A.7R.1 צריך להיות גדל במדיום (10% חום מומת FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו -2 מ"מ L- גלוטמין) דוגרים בצלחת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified עם אוויר ו -5% CO 2.
  7. עם מזרק שיש 20 מחט G, של PBS 100 μl השתל המכיל 5 x 10 6 תאים קרצינומה hepatocellular עכבר BNL 1ME A.7R.1 לאונה של הכבד של עכברים / ג BALB לייצר גידולים הראשוניים. לאחר השתלה, בית העכברים / ג BALB בכלוב עם אותן דרישות הבית כטרום השרשה.
  8. בנקודת סיום הניסוי, עדות קלינית של קרצינומה hepatocellular היא נצפית כירידה משמעותית במצב גוףציון (בדרך כלל מזוהה לאחר 4 שבועות). בשלב זה, יש סיכוי שגידולים ראשוניים פיתחו בכבד ואילו פיקדונות גרורתי יצרו את הריאות. לאחר מכן, להתחיל התהליך של הבידוד והתפשטות תאים סרטניים במחזור.

2. אוסף של דם מלא למחזור בידוד תאים סרטניים

הערה: כראוי מחוטאת אזור הניתוח ולוודא שהוא נטול עומס. החיטוי כל מכשירי הניתוח או לטבול בחומר חיטוי בהתאם להמלצת יצרן

  1. להקריב עכברים על ידי המתת חסד הומנית בנקודת סיום ניסוי (עדות קלינית של התפתחות גידולים). מתת חסד של עכברים צריכה לערב CO 2 מחנק. שים לב לעכברים כראוי כדי לאשר הרדמה מופץ בצורה נכונה. פחמן דו חמצני יש לשחרר באיטיות לתוך התא על פני תקופה של 5 - 10 דקות, גורמים לדום נשימה. עקוב ידי exsanguination וcervic intracardiacאל עקירה. 5
  2. שימוש במחט 25 G מצורפת מזרק 1 מיליליטר לאוסף של כל דם. Heparanize המזרק עם 0.01 מיליליטר הפרין. עור לנקב מייד עם המחט נחותה xyphisternum הזווית של 45 מעלות בכ. קידום מחט לאט לנקב את הלב, ואז להנמיך את הזווית של המחט. הולך ומתפשט המחט ומזרק במקום, ולצייר את 500 μl - 1,000 μl של כל דם מהלב.
  3. הסר את המזרק ומחט ולהעביר את הדם לתוך צינור ללא pyrogen 1.5 מיליליטר שכותרתו מראש. צנטריפוגה כל הדם שנאסף לתוך 1.5 מיליליטר צינור ללא pyrogen ב1,167 XG במשך 5 דקות.
    הערה: צנטריפוגה שמפריד בין כל דגימת הדם לשלוש שכבות: השכבה התחתונה או המטוקריט המורכב מתאי דם אדומים, שכבת ביניים דקה של מעיל באפי, ושכבה עליונה פלזמה.
  4. הסר את הפלזמה בקפידה על ידי pipetting ואיסוף אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר pyrogen ללא נפרד לפירטניסויים אה כגון זיהוי של חומצות גרעין תא ללא 7.
  5. לבידוד של תאי גידול במחזור (CTCs), לאסוף את המעיל באפי לתוך צינור ללא pyrogen נפרד 1.5 מיליליטר בהכנה לתאי דם אדומים תמוגה (RBC). זה הכרחי כדי להסיר RBCs שייר בשכבת המעיל באפי.

3. מתכון לתאי דם אדומים (RBC) תמוגה מאגר

  1. הפוך פתרון 1 ליטר של חיץ תמוגה RBC.
  2. הפוך 500 מיליליטר של אמוניום כלוריד ו -500 מיליליטר של טריס. אז לערבב כדי ליצור פתרון 1 ליטר של חיץ תמוגה RBC עם ריכוז סופי של 155 מ"מ של אמוניום כלוריד ו -10 מ"מ של טריס.
  3. חיץ הפתרון לpH של 7.5. אחסן את מאגר תמוגה RBC ב2-8 מעלות צלזיוס, ולהביא לRT מייד לפני שימוש.

4. RBC תמוגה של מעיל באפי

  1. הוסף 1 מיליליטר של חיץ תמוגה RBC לצינור 1.5 מיליליטר סטרילי ללא pyrogen מכיל מעיל באפי שנאסף.
  2. מערבבים את התוכן של הצינור על ידיהיפוך מספר רב של פעמים. דגירה התוכן מעורב של הצינור במשך 5 דקות ב RT על הספסל. צנטריפוגה התוכן המעורב במשך 5 דקות ב1,167 x גרם.
  3. לאחר צנטריפוגה, תתקבל גלולה לבנבן. בטל supernatant האדמדם לאט ובזהירות לאקונומיקה 10% ללא כל הפרעה לגלולה. אם גלולה היא לא לבנבן, מחדש לעשות צעדים 3.1-3.5. הגדלת זמן הדגירה במאגר תמוגה RBC עד 10 - 15 דקות יכולה להיות גם מועילה.
  4. בבטחה להיפטר הפסולת הביולוגית פעם טיהור שפכים ביולוגיים באקונומיקת 10% תושלם לאחר 24 שעות.

5. ריבוי בתרבית תאים

הערה: תאי גידול בדרך כלל גדלו במהירות תאי תאי דם לבנים שנמצאים בשפע בשילוב המקורי של תאי זרע לתוך הצלחת. בעקבות שינוי חוזר ונשנה של מדיום, והמעברים הבאים של CTCs, כל תאי הדם הלבנים יוסרו ואוכלוסייה טהורה יחסית של CTCs נשארה.

  1. לאחרהשלכת supernatant לתוך 10% אקונומיקה, לשטוף את הכדור לבנבן ב1 נאגר מלוח פוספט מיליליטר (PBS) לפחות פעם אחת, וגלול במדיום התרבות השלם לריבוי בתרבית תאים.
  2. ברגע לשטוף הושלם, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום מלא BNL 1ME תרבות A.7R.1 (חום 10% מומת FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו2 מ"מ L-גלוטמין) לגלולה וresuspend גלולה במדיום התרבות.
  3. זרעי תערובת resuspended של תאים לתוך צלחת תרבית תאים. דגירה צלחת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified עם האוויר ו 5% CO 2.
  4. לשנות את מדיום תרבית תאים בכל יומיים-שלושה. לאחר חמישה עד שבעה ימים, CTCs יהיה דבק בצלחת תרבית תאים והתחיל מתרבים. תאים אלה יישארו קיימא מעבר 25 קטעים ואחרי מחזורי הקפאה להפשרה חוזרים ונשנים 5.

6. אימות של Hepatocellular Carcinoma מחזור קו תאים סרטניים

  1. בצע APolymerase תגובת שרשרת שיטה מבוססת (PCR), כדי להגביר קטע DNA ספציפי אחד של גן העכבר β-גלובין כדי לאשר שהרומן הוקם שורות תאי CTC הן תאי עכבר כמו הקו המקורי המושתל BNL 1ME A.7R.1 HCC. שיטה שתוארה במקור ומאומתים על ידי Steube et al. 5,8
  2. בצע immunostaining לאלמנט התגובה cAMP סמן hepatocyte הספציפי מחייב חלבון 3 כמו-3 (CREB3L3) באמצעות נוגדן ספציפי. זה יאשר שהרומן CTCs הוקם אכן hepatocytes כמו קו התא המקורי המושתל BNL 1ME A.7R.1. 5

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המתודולוגיה שתוארה כאן הוכיחה כי יכול להיות מבודד CTCs. עכברים מורדמים אנושיים בנקודת סיום ניסוי. מחנק התהליך מעורב פחמן דו חמצני, exsanguination פנים-לב, ונקע בצוואר הרחם. סכמטי של שלבים העיקריים של ההליך הם באיור 2. דגימות דם כל שנאספו על ידי exsanguination פנים-לב עובדו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל. לאחר ש, צנטריפוגה שימשה כדי לקבוע את שכבת מעיל באפי שהיה נתון לתמוגה RBC. זה היה לאחר מכן על ידי צנטריפוגה צעד אחר לאסוף גלולה לבנבן שנשטפה ב- PBS, וresuspended במד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה תוארו כיצד לבודד ולהפיץ CTCs מדם מלא של עכבר סינגני עם HCC. מטרת עבודה זו היא לשפר את המחקרים המתמשכים של מנגנוני הגרורות הסרטניות.

גורם התורם לפרוגנוזה גרועה של סוגי סרטן רבים הוא היעדר גילוי בזמן וכתוצאה מכך הפצה נרחבת של הממאירות3. CTCs מקורם בסרטן ראשוני ומתפשטים דרך זרם הדם לאיברים מרוחקים. ככזה, CTCs חשובים בגרורות סרטניות ויש להם פוטנציאל ליישומים קליניים מרובים, כגון לאבחון3,9,10. זה נתמך על ידי נתונים ממספר מחקרים קליניים שהראו כי ל-CTCs יש מתאם חזק עם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

העבודה במעבדה של ד"ר אוגונוובי נתמכת על ידי מענק של תוכנית מרכזי מחקר במוסדות מיעוטים מהמכון הלאומי לבריאות מיעוטים ופערי בריאות (MD007599) של המכונים הלאומיים לבריאות. התוכן של כתב יד זה הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-NIMHD או ה-NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מלח נתרן הפרין 1 גרםVWR89508-852
BTX שפופרת מיקרו 1.5 מ"ל שקוף NSVWR89511-2541.5 מ"ל  צינורות אפנדורף ללא פירוגן
מחט סטרילית Disp BD 25 גרם x 1 ב- VWRBD30512525 גרם מחט
Slp Tip SRNG 1 מ"ל 200 כל אחד לחבילהVWRBD3096591 מ"ל קצה מזרק
מזרק 1 מ"ל leur lok Pk 100VWRBD3096281 מ"ל מזרק
VWR רקמות מלקחיים 6VWR82027-446מלקחיים
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 מ"מ PK 100VWR25608-924Cyromold
Cryo-oct compund 4 ozVWR25608-930Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 מ"מ PK72VWR48311-703שקופיות
VWR כיסוי זכוכית #2 22 x 50 מ"מVWR48-382-128כיסוי זכוכית
VWR תיבת שקופיות אמיתי צפון fm puVWR89140-278תיבת שקופיות
סופר HT PAP עטVWR89427-058PAP עט
מים RNASe ו- DNA חינם 2 LVWR101454-204מאגר מים ללא נוקלאז
Tris Ultra טהור כיתה 500 גרםVWR97061-796Tris Buffer
אמוניום כלוריד ACS כיתה 2, 5 ק"גVWR97062-048אמוניום כלוריד חוצץ
פלקון צלחת תרבית רקמות בז 60 x 15 מ"מ סגנון פוליסטירןVWR353002צלחת תרבית רקמות
Clorox Germicidal Bleach, רגילVWR89501-620Clorox Bleach
PBS, 1x (מי מלח חוצץ פוספט) ללא סידן ומגנזיום (500 מ"ל)Thermo Fischer Scientific21-040-CVPBS, 1x
DMEM, 1x  עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז & L-גלוטמין ללא נתרן פירובטתרמו פישר סיינטיפיק10-017-CVDMEM 1x מדיה לתאי BNL 1ME A.7R.1
סרום בקר עובריתרמו פישר מדעי35-010-CVFBS
פניצילין תמיסת סטרפטומיצין, 100xתרמו פישר מדעי30-002-Clפניצילין סטרפטומיצין
סורוול ביופוגה פיקותרמו פישר 75002411מדעיצנטריפוגה 13,000 סל"ד

מקורות

  1. Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).
  2. van de Stolpe, A., den Toonder, J. Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future. Cancers. 6, 1195-1207 (2014).
  3. Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).
  4. George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. "Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer. Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).
  5. Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS one. 8, e63765(2013).
  6. Cheng, B., et al. Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture. International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).
  7. Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).
  8. Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction. Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).
  9. Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. Cancer micrometastases. Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).
  10. Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).
  11. Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).
  12. De Giorgi, U., et al. Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).
  13. Eloubeidi, M. A., et al. Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications. The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).
  14. O'Toole, D., et al. Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration. Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CTCBuffy CoatPCR
בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.