הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

15.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52863

⸱

21 במאי 2015

 ,  ,  ,  , 
1Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Michigan, 3Department of Epidemiology and Biostatistics, Michigan State University, 4Department of Molecular Obstetrics and Genetics, Wayne State University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 6Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

מתואר כאן פרוטוקול לבידוד ומחקר נוסף של הלויקוציטים החודרים של ה-decidua basalis ו-decidua parietalis - הממשק האם-עובר האנושי. פרוטוקול זה שומר על שלמות סמני פני התא ומניב מספיק תאים ברי קיימא ליישומים במורד הזרם, כפי שהוכח על ידי ניתוח זרימה ציטומטרית.

תקציר

הריון מאופיין בחדירה של כדוריות דם לבנות ברקמות הרבייה ובממשק האימהי-עוברי (basalis decidua וparietalis decidua). ממשק זה הוא האתר האנטומי של קשר בין האם ורקמות עוברים; לכן, זה אתר חיסוני של פעולה במהלך הריון. לויקוציטים מסתנן בממשק אימהי-העוברי לשחק תפקיד מרכזי בהשתלה, תחזוקת הריון, ועיתוי של מסירה. לכן, אפיונים פנוטיפי ופונקציונליים של לויקוציטים אלה יספק תובנה המנגנונים המביאים להפרעות הריון. כמה פרוטוקולים תוארו כדי לבודד חדירה לויקוציטים מbasalis decidua וparietalis decidua; עם זאת, חוסר העקביות בחומרים הכימיים, אנזימים, ופעמים של דגירה עושה את זה קשה להשוות תוצאות אלו. מתואר כאן היא גישה חדשנית המשלבת את השימוש בDiss המכני והאנזימטית העדיןטכניקות ociation לשמר את הכדאיות ויושרה של סמנים תאיים ו תאיים בלויקוציטים מבודד מהרקמות האנושיות בממשק אימהי-העוברי. מלבד immunophenotyping, תרבית תאים, ומיון תא, היישומים העתידיים של פרוטוקול זה הם רבים ומגוונים. בעקבות פרוטוקול זה, יכולים לשמש לויקוציטים המבודדים כדי לקבוע מתילציה DNA, ביטוי של גני המטרה, במבחנה פונקציונלי יקוציט (כלומר, phagocytosis, רעיל, התפשטות תאי T, וגמישות, וכו '), והייצור של מיני חמצן מגיבים בממשק אימהי-העוברי. בנוסף, באמצעות הפרוטוקול המתואר, מעבדה זו הייתה מסוגלת לתאר לויקוציטים החדשים והנדירים בממשק אימהי-העוברי.

מבוא

הריון מאופיין בשלושה שלבים ברורים חיסוניים: 1) השתלה וplacentation המוקדם הקשורים בתגובה פרו-דלקתית (כלומר, השתלה דומה "פצע פתוח"); 2) השליש השני ורוב השליש השלישי של הריון כאשר הומאוסטזיס חיסון מושגת באמצעות מדינה בעיקר אנטי דלקתית בממשק אימהי-העוברי; והמלטה 3), מדינה פרו-דלקתית 1-7. תאים חיסוניים יש תפקיד חשוב בויסות התגובה הדלקתית בממשק אימהי-העוברי שבו השפע שלהם ושינוי הלוקליזציה במהלך הריון 6-9.

בבני אדם, הממשק אימהי-עוברי מייצג אזור של קשר ישיר בין האימהי (decidua) ועובר (סיסית או trophoblast) רקמות. ממשק זה כולל: 1) decidua parietalis שקווי חלל הרחם אינו מכוסה על ידי השליה והוא בסמיכותלlaeve סיסית; ו -2) basalis decidua, ממוקם בצלחת הבסיס של השליה שבו הוא פלש trophoblasts ביניים 10 (איור 1). האינטימיות של תחומי מגע אלה יוצר תנאים לחשיפה עוברית לאנטיגני 11-13 המערכת החיסונית של האם. שלא במפתיע, לויקוציטים מהווים עד 30-40% מתאי decidual 8,9,14,15 בנוסף לתאי סטרומה-סוג טיפוסיים ותאי בלוטות 8,14,16. התפקיד של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי כולל מספר רב של תהליכים הכוללים הגבלה של פלישת trophoblast 17, שיפוץ של עורקים סליליים 18,19, תחזוקה של סובלנות מצד 12,20, וחניכה של עבודת 21-26. לויקוציטים של שתי ההסתגלות וגפיים מולדים של מערכת החיסון, כלומר, תאי T, מקרופאגים, נויטרופילים, תאי B, תאים דנדריטים, ותאי NK, זוהו ברקמות decidual, ופרופורציות ומצב הפעלה הוכחו להשתנות מרחב ובזמן בכל הריון 6-10,12,14,24,27-30. הפרעות באוכלוסיית יקוציט ו / או הפונקציה משויכות הפלה ספונטנית 31, רעלת הריון 32, הגבלת גדילה תוך-רחמית 32,33, וצירים מוקדמים 7,24. לכן, המחקר של המאפיינים פנוטיפי והפונקציונליות של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי האנושי יאפשר הבהרת המסלולים החיסוניים dysregulated בהפרעות הריון.

טכנולוגיה אחד הכלים החזקים ביותר המשמשים לקביעת הפנוטיפ ומאפיינים פונקציונליים של לויקוציטים הוא cytometry זרימה, המאפשרת ניתוח כמותי של פרמטרים מרובים בו זמנית 34-36. כדי לנתח לויקוציטים ידי cytometry זרימה, נדרש בידוד של כדוריות דם לבנות בהשעית תא בודד. לכן, שיטה להפריד הסתננות Leuיש צורך kocytes מהממשק האימהי-העוברי ללמוד פנוטיפי ומאפיינים פונקציונליים.

כמה שיטות שתוארו לבודד את כדוריות דם לבנות מהממשק אימהי-העוברי האנושי 10,14,25,27,37-39. בעוד כמה להחיל disaggregation המכני 10,25,27,38, אחרים משתמשים עיכול אנזימטי 37,40 לניתוק רקמה. בגלל disaggregation המכני מייצר תשואה נמוכה וכדאיות מופחתת 41, וניתוק האנזימטית יכול להשפיע על כדאיות ופני תא שמירת סמן 42, בשיטה המתוארת במסמך זה משלב ניתוק מכאני עדין עם האנזימטית מראש טיפול להגדיל את התשואה של לויקוציטים המבודד מבלי להתפשר על כדאיות תא. שילוב דומה של שיטות הודגם כיעיל בבידוד של כדוריות דם לבנות מרקמות decidual בממשק האימהי-העוברי 39. לכן, הפרוטוקול המתואר במסמך זה כרוך Mechadisaggregation nical עם Dissociator רקמה אוטומטי שמגדיל עקביות תוך חיסכון בזמן ועבודה בהשוואה לגנדרני מסורתי עם אזמלים מנוגדים, סכיני גילוח, או מספריים כירורגיות 10,28. האנזים שנבחר לניתוק רקמה היה Accutase. שלא כמו collagenase הנפוץ 43, dispase 44, וטריפסין 45, Accutase (פתרון ניתוק תא) משלב את שני מפרקי חלבונים כלליים ופעילויות collagenolytic שתורמות לניתוק עדיין עדין יעיל 46,47. לאחר ניתוק, לויקוציטים מועשר מהאוכלוסייה הכוללת של תאי decidual ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. תקשורת שיפוע צפיפות שונות כבר נוצלה בעבר, הנפוץ ביותר מהם Percoll (השעיה של חלקיקי סיליקה colloidal) 48 וFicoll (פולימר של סוכרוז עם משקל מולקולרי סינטטי גבוה) 49. היעילות מעולה של בידוד על ידי פולימר סוכרוז כבר previoמוצג usly 50, והפרוטוקול המתואר במסמך נוסף מוכיח שתקשורת שיפוע צפיפות זו מייצרת טוהר גבוה מספיק של לויקוציטים mononuclear.

לפיכך, הפרוטוקול המתואר במסמך זה משלב disaggregation הרקמה המכני עם Dissociator אוטומטי רקמות, עיכול אנזימטי עם פתרון ניתוק תא, והפרדה לויקוציטים עם תקשורת שיפוע צפיפות (1.077 + 0.001 g / מיליליטר) כדי לבודד לויקוציטים מרקמות decidual אנושיות. פרוטוקול זה הוכח לשמר אנטיגנים פני תא יחד עם כדאיות תא. לויקוציטים המבודד יכול לשמש ליישומים מרובים הכוללים immunophenotyping עם cytometry זרימה ומחקרים תפקודיים במבחנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה מתאים לבידוד יקוציט מbasalis decidua וparietalis decidua בהכנה לimmunophenotyping ידי cytometry זרימה. יתר על כן, התאים המבודדים יכולים לשמש למיון תא, תרבית תאים, בידוד RNA, וציטולוגיה. לפני העבודה עם הדגימות שהוזכרו בפרוטוקול זה, יש לקבל את האישור אתי אנושי מהוועדה המקומית לחקר האתיקה ולוחות סקירה מוסדית. האיסוף והניצול של דגימות אנושיות למטרות מחקר אושרו על ידי לוחות הסקירה המוסדית של המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר לבריאות ילד והתפתחות אדם (NICHD), מכון הלאומי לבריאות (NIH), מחלקת בריאות ושירותי אנוש (DHHS , Bethesda, MD, ארה"ב) והאוניברסיטה ויין סטייט (דטרויט, מישיגן, ארה"ב). נכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל הנשים בהריון לפני האוסף של דגימות רקמה.
הערה: בעת שעבדה בדם של בעלי חיים, תאים, או מפגעסוכני היחידות הארגוניות כאמור בפרוטוקול זה, זה חיוני כי בטיחות ביולוגית נכונה ופעולות בטיחות במעבדה להיות אחריו.

1. Dissection של רקמות Decidual האדם

הערה: צלחת הבסיס היא הבסיס מתחת ומחובר לשליה ומייצגת את פני השטח האימהיים. קרומי chorioamniotic כוללים amnion וסיסי. הצלחת הבסיסית כוללת basalis decidua והסיסי כולל parietalis decidua (איור 1).

  1. Decidua basalis
    1. לנתח פיסת הצלחת הבסיסית מטבורית אחד של השליה (איורים 1 א ו -1 B).
    2. מניחים אותו על קרש חיתוך סטרילי עם villi השליה פונה כלפי מעלה. הצד מראה villi השליה הוא בדרך כלל אדום מדם עם רקמת שעיר במראה. צלחת הבסיס חלקה וחיוורת בצבע אדום.
    3. שימוש במלקחיים חדים, מספריים ועדין נקודה כדי להסיר את Villכלי רקמה ודם היחידות הארגוניות. לשמור על הרקמה הספוגה ב1x PBS (Ca 2 + - וMg 2 + - ללא תשלום) בתהליך (איור 1 ג). לאסוף 2-3 חתיכות אלה ולשטוף אותם ביסודיות עם 1x PBS להסיר הדם (1D איור).
  2. Decidua Parietalis
    1. לנתח פיסת קרום chorioamniotic (כ 10 סנטימטרים x 10 סנטימטר, איור 1E). מניחים אותו על הלוח עם סיסית פונה כלפי מעלה. צד השליה מכיל קרישי דם, והוא בדרך כלל אור בצבע צהבהב.
    2. שימוש במלקחיים עדין נקודה כדי להסיר כמה שיותר קרישי הדם ככל האפשר (איור 1E). יש לשטוף את הקרום בסטרילי 1X PBS כדי לנקות את הדם העודף מהקרום עד PBS 1x פועל ברור.
    3. השתמש מגרד תא סטרילי חד פעמי כדי לגרד את שכבת decidual מן הקרום בעדינות. החל סטרילי 1X PBS על ממBrane בעת השלמת תהליך זה (איור 1F). אסוף את רקמות decidual ולמקם אותם בצינור פלסטיק 50 מיליליטר עם סטרילי 1X PBS (איור 1G).

2. מכאני disaggregation ואנזימתי עיכול

  1. שטוף את הרקמה גזור מbasalis decidua (משלב 1.1.3) או parietalis decidua (משלב 1.2.3) עם סטרילי 1X PBS בצינור פלסטיק 50 מיליליטר. לאסוף כדורי רקמה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT.
  2. לשאוב supernatant ממוקם מעל גלולה הרקמה בזהירות מבלי להפריע גלולה.
    הערה: בשלב זה, את כדורים הם רופפים מאוד משום שהם מכילים תאי דם אדומים. אם הנפח של גלולה הוא על או פחות מ 3 מיליליטר, מחדש להשעות את גלולה ב 6 מיליליטר של תמיסת ניתוק תא מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. אם גלולה היא גדולה יותר מאשר 3 מיליליטר של נפח, להוסיף עוד פתרון ניתוק תא (להוסיף על פי 2 הדואר נפח של דגימות הרקמה).
  3. העבר את הרקמות הומוגני (basalis decidua + parietalis פתרון או decidua ניתוק תא + פתרון ניתוק תא) לצינור C.
  4. מניחים את צינור C בDissociator האוטומטי ולהפעיל את התכנית המתאימה.
    הערה: התכנית לbasalis decidua פועלת לשניות 17 עם 668 סיבובים הכולל לטווח. התכנית לparietalis decidua פועלת לשניות 37 עם 235 סיבובים הכולל לטווח. תוכניות אלה מותאמים אישית כדי לבודד לויקוציטים מbasalis decidua או parietalis decidua עם תשואה טובה וכדאיויות תא.
  5. בעקבות disaggregation המכני של הרקמות, לעכל את הרקמות עם פתרון ניתוק תא זמין מסחרי כגון Accutase; (קוקטייל המכיל מפרקי חלבונים ואנזימי collagenolytic) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.

3. בידוד של לויקוציטים

  1. לאחר דגירה, להוסיף 10 מיליליטר של 1x PBS לDIGEתערובת stion ולהעביר אותו דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור פלסטיק 50 מיליליטר. בהתאם לדביקות של תערובת העיכול, אחד ייתכן שיצטרך להשתמש בכמה מסננות תא לתערובת אחת.
  2. מלא את הצינור עם 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על RT. הסר את PBS 1x מעל כדורי התא בזהירות מחדש להשעות את כדורים עם 5 מיליליטר של חיץ FACS קר כקרח.
    הערה: כדי ללמוד את כדוריות דם לבנות polymorphonuclear וmononuclear יחד, עבור לשלב 6.1; ללמוד לויקוציטים mononuclear, המשך לשלב 3.3.
  3. הוסף 5 מיליליטר של 20% תקשורת שיפוע צפיפות (1.077 + 0.001 g / מיליליטר) לצינור פלסטיק 15 מיליליטר וכיסוי לאט ההשעיה התא על גבי מדיה שיפוע צפיפות. בעוד שכבות המדגם, חשוב לא לערבב תקשורת שיפוע צפיפות עם ההשעיה התא.
  4. צנטריפוגה עם הרוטור את נדנדה-XG ב 500 במשך 30 דקות ב 4 C ללא הבלם. זה מאוד חשוב כדי לכבות את הבלם כדי למנוע ערבוב התאים וlosing השיפוע. לויקוציטים יימצא בממשק בין תקשורת שיפוע צפיפות וחיץ FACS.
  5. הסר את השכבה העליונה המכילה את המאגר ופסולת תא FACS בזהירות בעזרת פיפטה. הלהקה בממשק מכילה תאי mononuclear decidual וחלק מכדוריות הדם לבנות polymorphonuclear.
  6. להעביר את התאים בממשק לחלוטין לצינור פלסטיק 15 מיליליטר חדש. הוסף עוד נפח לפחות 3 פעמים של חיץ FACS.
  7. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות לpelletize התאים. לשאוב supernatant ולשטוף את התאים עם חיץ FACS. Pelletize את התאים עם צנטריפוגה אחרת ב XG 300 במשך 5 דקות על RT.
    הערה: כדי לבצע את תרבית התאים, ראה שלב 4. כדי לבצע מיון תא, ראה שלב 5. כדי לבצע immunophenotyping, ראה שלב 6.

4. יישומים - תרבות סלולארי

  1. להשעות מחדש התאים משלב 3.7 ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות RPMI 1640. ספירת תאי קיימא using דלפק אוטומטי תא או hemocytometer ופתרון trypan כחול 0.4%.
  2. להוסיף את הסכום של מדיום תרבות RPMI לעשות ריכוז תא של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. תאים מוכנים לתרבות החברה.

5. יישומים - בידוד של המקרופאגים לתרבית תאים ראשוניים

  1. כדי לבודד CD14 + תאים, מגנטי התווית התאים משלב 3.7 עם microbeads CD14 (20 חרוזים μl לכל 10 7 תאים), דגירה במשך 15 דקות ב 4 C, וCD14 נפרד + תאים מסוגים אחרים של תאים על ידי הפעלת שדה מגנטי. לאחר 2 שטיפות עם חיץ MACS וההסרה של השדה המגנטי, elute תאי CD14 + עודפים המגנטיים עם חיץ MACS.
  2. בעקבות צנטריפוגה, מחדש להשעות את כדורי התא בינוני תרבות RPMI 1640. התאים מוכנים לציפוי (איור 2).

6. יישומים - immunophenotyping

  1. כדי להשתמש בתאים לimmunophenotyping, מחדש להשעות את התאים משלב 3.7 ב 1 מיליליטר של 1x PBS. ספירת תאי קיימא באמצעות דלפק אוטומטי תא או hemocytometer ופתרון trypan כחול 0.4%.
  2. תווית התאים עם צבע ניתן לתקן כדאיות (איור 3). לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ FACS מחדש להשעות את התאים במאגר כתם. דגירה עם חוסם FCR במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
  3. להוסיף נוגדנים תאיים מצומדת לfluorochromes. לדוגמא, בפרוטוקול זה, להשתמש באנטי-CD3, נוגדנים נגד CD19, אנטי CD14, אנטי CD15, ואנטי-CD56 (טבלה 1). דגירה של 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.
  4. לאחר 2 שטיפות עם 1x PBS, התאים ינותחו ב500 μl של חיץ כתם באמצעות cytometer זרימה. ייצוג של אסטרטגית gating להשתמש כדי לנתח את תת-האוכלוסיות לויקוציטים נמצאו ברקמות decidual מוצג באיור 4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

. הנתיחה של רקמות אנושיות בממשק האימהי-עוברי (basalis decidua וparietalis decidua) מוצגת באיור 1 הליך זה כולל את הנתיחה של הצלחת הבסיסית, הכוללת את basalis decidua (איור 1 א - ד). Basalis decidua מתקבל על ידי הסרת villi השליה (הצד עוברי) מצלחת הבסיס (איור 1 ג). Parietalis decidua נאסף על ידי בעדינות מגרד את קרום כוריוני (איור 1E - F). איור 2 מציג את המורפולוגיה של מקרופאגים המבודד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אפיון התכונות הפונקציונליות ופנוטיפי של חדירה לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי האנושי הוא חיוני להבנה של מנגנוני החיסון שיובילו להפרעות הריון. כמה טכניקות שתוארו כדי לבודד לויקוציטים מהממשק אימהי-העוברי האנושי במהלך הריון 10,14,25,28,37,42,43. עם זאת, כל אחד מטכניקות אלה הוא שונה, שימושים שונים אנזימים או שילובי אנזים, דורש פעמים ניתוק שונות, אינו מציין כמויות של רקמה, והכי חשוב, לא תמיד לציין את הכדאיות של התאים המבודדים. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר הבידוד של חדירה לו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם חושפים ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מכון יוניס קנדי שרייבר הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם, NIH / DHHS. עבודה זו נתמכה גם, בחלקו, על ידי Perinatal אוניברסיטת היוזמה ויין מדינה באימהי, Perinatal ובריאות ילד. הכרת תודה אנו מודים מורין McGerty (אוניברסיטת ויין סטייט) לקריאה הביקורתית של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Dissection
כלי דיסקציה סטריליים: מספריים כירורגיים, מלקחיים ופינצטה עדינה כל ספק20012-027
1X פוספט חוצץ מלח (PBS)Life Technologies(1X PBS)
צלחות פטרי גדולות וקטנותכל ספק
<חזק>דיסוציאציה
AccutaseLife TechnologiesA11105-01(פתרון ניתוק תאים)
סטרילי 2 מ"ל צינורות חרוטיים נעילה בטוחהכל ספק
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיכל ספק
100 ומיקרו; מסנני תאים mFALCON/Corning352360
5 מ"ל מבחנות פוליסטירן תחתון עגולכל ספק
העברת פיפטותכל ספק
צינורות CMiltenyi Biotec130-093-237
<חזק>תרבית תאיםתרבית
RPMI בינונית 1640 Life Technologies22400-0891X) (10% FBS ו-1% P/S)
מגלשות תא פלסטיקThermo Scientific177437
IncubatorThermo Scientific CorporationHEPA Class 100
אמבט מיםפישר סיינטיפיקISOTEMP 110
מונה תאיםNexelcomCellometer Auto2000
מיקרוסקופאולימפוסאולימפוס CKX41
<חזק>הפרדת תאים
MS עמודותMiltenyi Biotec130-042-201
מפריד תאיםMiltenyi Biotec130-042-109
30 μ m מסנני הפרדה מראשMiltenyi Biotec130-041-40
MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
15 מ"ל צינורות חרוטיים נעילה בטוחהכל ספק
MACS buffer (0.5% אלבומין בסרום בקר, 2 מ"מ EDTA ו-1X PBS)<
FcR חוסמיםMiltenyi Biotec130-059-901(Fc Block)
נוגדנים אנטי-אנושיים אנטי-פני תאים BD Biosciences(טבלה 1)
אלבומין בסרום בקר SigmaA7906
צבע חי/מת כדאיותBD Biosciences564406
מאגר Lyse/Fix BD Biosciences346202
מאגר FACS (0.1% BSA, 0.05% נתרן אזיד ו-1X PBS, pH = 7.4)
מאגר מכתים BD Biosciences554656
Trypan Blue solution 0.4%Life Technologies15250-011
FicollGE Healthcare17-1440-02מדיה שיפוע בצפיפות 20% (1.077 + 0.001 גרם/מ"ל)
<חזק>מכשירים נוספים
אינקובטור עם שייקרThermo ScientificMAXQ 4450
ציטומטר זרימהBD BiosciencesLSR-Fortessa
 בקמן קולטרSpinChron DLX
מערכת ואקוםכל ספק
מפרק רקמות אוטומטי Miltenyi BiotecgentleMACS Dissociator
(td colspan="4"><חזק>ריאגנטים צנטריפוגה

מקורות

  1. Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
  2. Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
  3. Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
  4. Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M. Inflammatory pathways in the mechanism of parturition. BMC Pregnancy Childbirth. 7, Suppl 1. S7(2007).
  5. Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
  6. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  7. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
  8. Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
  9. Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E. Immune cells in the placental bed. Int J Dev Biol. 54 (2-3), 281-294 (2010).
  10. Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
  11. Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
  12. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  13. Christiansen, O. B. Reproductive immunology. Mol Immunol. 55 (1), 8-15 (2013).
  14. Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
  15. Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
  16. Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
  17. Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
  18. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  19. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  20. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  21. Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
  22. Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
  23. Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
  24. Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39(2012).
  25. Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
  26. Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946(2013).
  27. Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
  28. Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
  29. Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
  30. Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
  31. Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
  32. Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
  33. Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
  34. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  35. He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
  36. Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
  37. Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
  38. Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
  39. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
  40. Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
  41. Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
  42. White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
  43. Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
  44. Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
  45. Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
  46. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  47. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  48. Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
  49. Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
  50. Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
  51. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  52. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  53. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.