הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

17.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52866

⸱

21 במאי 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

במאמר זה

סיכום

המתואר כאן הוא פרוטוקול לבידוד וניתוח הלויקוציטים החודרים של רקמות בממשק האם-עובר (רחם, דצידואה ושליה) של עכברים. פרוטוקול זה שומר על שלמותם של רוב סמני פני התא ומניב מספיק תאים ברי קיימא ליישומים במורד הזרם, כולל ניתוח זרימה ציטומטרית.

תקציר

סובלנות חיסונית בהריון דורשת שהמערכת החיסונית של האם עוברת שינויים ייחודיים במטרה לקבל ולטפח את העובר המתפתח. סובלנות זה הוא שיזמה במהלך משגל, הוקמה במהלך הפריה וההשתלה, ונשמרה לאורך הריון. מתווכים תאיים ומולקולריים פעילים של סובלנות אימהית-עוברית מועשרים באתר של קשר בין רקמות עובריות ואימהיות, הידוע בממשק האימהי-עוברי, הכולל את השליה ורחם ורקמות decidual. ממשק זה מורכב מתאי סטרומה ולויקוציטים הסתננות, ומאפייני השפע ופנוטיפי לשנות במהלך ההריון. לויקוציטים מסתנן בממשק האימהי-עוברי כולל נויטרופילים, מקרופאגים, תאים דנדריטים, תאי פיטום, תאי T, תאי B, תאי NK, ותאי NKT שיחד יוצרים מיקרו-הסביבה המקומית המקיימת הריון. חוסר איזון בין תאים אלה או כל inappropשינוי riate בפנוטיפים שלהם נחשב למנגנון של מחלה בהריון. לכן, המחקר של לויקוציטים שלהסתנן הממשק אימהי-העוברי הוא חיוני על מנת להבהיר את מנגנוני החיסון שיובילו לסיבוכים הקשורים להריון. תאר במסמך זה הוא פרוטוקול שמשתמש בשילוב של ניתוק מכאני העדין ואחריו disaggregation האנזימטית חזק עם מפרקי חלבונים וקוקטייל האנזימטית collagenolytic לבודד את כדוריות דם לבנות שחדרו מהרקמות עכברי בממשק אימהי-העוברי. פרוטוקול זה מאפשר הבידוד של מספרים גבוהים של כדוריות דם לבנות קיימא (> 70%) עם מאפייני אנטיגני ופונקציונליים מספיק שימור. אז יכולים להיות מנותח על ידי כדוריות דם לבנות מבודדים כמה טכניקות, כולל immunophenotyping, מיון תא, הדמיה, immunoblotting, ביטוי mRNA, תרבית תאים, ובמבחני מבחנה פונקציונליים כגון תגובות מעורבות לויקוציטים, הפצה, או מבחני רעילים.

מבוא

סובלנות חיסונית בהריון היא תקופה בה שינויים ייחודיים להתרחש בתוך המערכת החיסונית של האם. שינויים אלו מאפשרים לאם לעובר תסבול, שתל למחצה אלוגנאית 1. העובר מבטא מורכב histocompatibility גדול אבהי (MHC) אנטיגנים 2, ותאים עובריים כבר נמצאו במחזור הדם האימהי 3; עם זאת, העובר לא נדחה 4,5. חידה זה לא מובן לחלוטין.

ההשערה האחרונה קובע כי סובלנות אימהית-עוברית נוצר במהלך משגל והפרית 6,7 ומתוחזק כדי לקיים הריון טווח מלא 8-10. פירוט של סובלנות אימהית-עוברי זה נחשב מנגנון של מחלה במהלך הריון 10-16 המוקדם ומאוחר שלבים. סובלנות האם ועובר כרוך בהשתתפות תת-אוכלוסיות לויקוציטים שונות, כוללים תאי T (תאי T רגולטורים, תאי Th1, תאי Th2, ותאי TH17), מקrophages, נויטרופילים, תאי פיטום, תאי NK, ותאי NKT, תאים דנדריטים, ותאי B, ששינוי בצפיפות ולוקליזציה במהלך הריון 15,17-19. סובלנות האם ועובר מועשרת בממשק אימהי-העוברי 20 - האתר אנטומיים בי המערכת החיסונית של האם אינטראקציה עם אנטיגנים העובריים 20,21.

הממשק אימהי-העוברי נוצר במהלך placentation כאשר תאי trophoblast extravillous העובריים לפלוש רירית רחם 22-24. בצד העוברי של ממשק זה, הקרומים המקיפים את העובר ליצור משטח אפיתל מיוחד בתוך השליה, ותאי syncytiotrophoblast לשלוט בבורסה התזונתית באמצעות המגע הישיר שלהם עם דם אימהי 22. בצד האימהי של הממשק, decidua מגייס בריכת הטרוגנית של לויקוציטים שבעכברים כ -30% עד 50% מכל תאי decidual. בנוסף להשתתפותם בmaternסובלנות חיסונית אל, תאים אלה הם תורמים מרכזיים לתהליכים שונים במהלך הריון, למשל., שליה ההגנה על מערכת הרבייה מזיהומים, הפריה, השרשת עובר 7,25, אנגיוגנזה decidual 26, שיפוץ כלי דם 24,27, פלישת trophoblast 28, פיתוח 24,25, וסופו של דבר, עבודה ומסירה 15,17. לכן, המחקר של לויקוציטים המעורב בסובלנות אימהית-עוברית הוא חיוני להבהרת פתוגנזה של סיבוכים הקשורים להריון.

בעוד שהשימוש באימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence יצר נתונים להדמיה הישירה והלוקליזציה של רחם, decidual, או כדוריות דם לבנות שליה 29,30, cytometry זרימת הניתוח חשף נוסף תת ספציפי של לויקוציטים בכל אחד מרקמות אלה 31,32. בנוסף, cytometry זרימה נעשה שימוש כדי לקבוע את הצפיפות וחלקם של מאטרסופי-עוברי ממשק לויקוציטים 33 וביטוי רמות של חלבונים תאיים ו תאיים 8-10,34. ניתוח תזרים cytometric של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי דורש השעיה תא בודד. כדי לבודד לויקוציטים מסתנן מdecidual, הרחם, ורקמות שליה, שתי שיטות של ניתוק רקמה שימשו: מכאנית והאנזימטית. שני השיטות לאפשר את ההפרדה של לויקוציטים הסתנן מהמטריצה ​​תאית (ECM) של רקמות אלה. ניתוק רקמה אנזימתי עדיף על ניתוק רקמה מכאני שכן היא מאפשרת תשואה גבוהה יותר של כדוריות דם לבנות עם הנזק קשור-כוח גזירה פחות 35. כתוצאה מכך, ניתוק רקמה מכאני דורש איגום רקמות 36, אשר עשוי להגדיל את השונות וההטרוגניות של הדגימות. עם זאת, ניתוק מכאני עשוי להיות הבחירה כאשר אנטיגן של עניין ניתן לשנות על ידי ניתוק האנזימטית או כאשר פונקציונלי של התאים של צורך העניין לשימור (לדוגמא., רעיל של תאי NK) 35.

השימוש בproteolysis עם אנזימים ספציפיים לבזות ECM מבטל את התשואות נמוכות שנצפו עם ניתוק מכאני. מספר מחקרים דיווחו על השימוש בטריפסין 32, collagenase 37, 31 DNase, dispase 38, וקוקטיילים מסחריים של אנזימים שונים 32,39. עם זאת, הטבע והריכוז של אנזימים שונים ואת משך הזמן של עיכול חייב להיות מוגדר בקפדנות ומאומתים על מנת להבטיח שמירה על שלמותו של אפיטופים אנטיגני פני תא הנדרשים לimmunophenotyping. מבני המשטח שונים באופן דיפרנציאלי רגישים להרס על ידי אנזימים שונים, עם כמה אנזימים, כגון טריפסין, להיות ידוע לשמצה בהפשטת epitopes משטח יקוציט מוכרת על ידי רבים נוגדנים חד-שבטיים.

הציג במסמך זה הוא שיטה באמצעות proteolytIC וקוקטייל האנזימטית collagenolytic, נקרא Accutase. פתרון האנזימטית זה עדין מספיק ועדיין יעיל במתנער רקמות עכברי בממשק האימהי-עוברי, ואינו דורש תוספת של חומרים כימיים מתנערים אחרים או סרום לסיים את תגובת הניתוק. יתר על כן, הוא מוכן לשימוש כפי שסופק ו, למרות שהזמן של ניתוק צריך להיות מאומת, זה יותר חזק מאשר האנזימים הנ"ל 40,41.

הניצול של שילוב של שני הסוגים של רקמות disaggregation משפר את האיכות וכמות התאים שהושגו; כך, מספר מחקרים יישמו את השימוש בשילוב של ניתוק מכאני והאנזימטית עם תוצאות משביעות רצון 31,32,37. הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוקם ומאומתים במעבדה שלנו; היא משתמשת בשילוב של ניתוק מכאני עדין ואחריו disaggregation האנזימטית חזק. פרוטוקול זה מאפשר מחקר והבידוד נוסף שללויקוציטים מסתנן ברקמות עכברית בממשק האימהי-עוברי (רחם, decidua, ושליה). הפרוטוקול הבא גם שומר על השלמות של סמנים פני תא ותשואות מספיק תאי קיימא עבור יישומים במורד הזרם כפי שהודגם על ידי ניתוח התזרים cytometric. לבסוף, פרוטוקול זה שומר על העקביות של תא הכנה לניתוח והשוואה של רקמות עכברי שונות המרכיבות את הממשק אימהי-עוברי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

לפני העבודה עם הדגימות שהוזכרו בפרוטוקול זה, אישור אתי בבעלי החיים חייב להינתן על ידי הוועדה המקומית לחקר האתיקה ולוחות הסקירה המוסדית. כאשר עובדים עם דם של בעלי חיים, תאים, או סוכנים מסוכנים כאמור בפרוטוקול זה, פעולות הבטיחות הביולוגית ובטיחות במעבדה הנאותה חייבים להיות אחריו.

1. טיפול בעכבר ואוסף רקמות

  1. הכן תחנת עבודה סטרילית ולקבל כלים סטריליים לאוסף רקמות. כלים אלה כוללים מספריים קטנים וגדולים כירורגית, מלקחיים, ופינצטה בסדר-קצה. כולל מנות קטנות פטרי שכותרתו עם שמות הרקמות המתאימים, מלאים בפתרון 1x שנאגרו מלוח פוספט (PBS) (3 - 5 מיליליטר) equilibrated לRT (20 - 22 מעלות צלזיוס). כולל גם מנה גדולה פטרי, ללא תווית, מלאה בפתרון 1x PBS (10 - 15 מיליליטר).
  2. להרדים עכבר בהריון (לאחר coitum-10.5-19.0 ימים (DPC) או לפני משלוח) באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2). כדי להבטיח שהעכבר הוא מורדמים, להשתמש בטכניקת הנקע בצוואר הרחם.
    הערה: לפני 10.5 DPC, קשה להפריד ידני רקמות decidual מרקמות הרחם. אם הבידוד של לויקוציטים decidual אינו נדרש, כדוריות דם לבנות מרקמות הרחם של עכברים שאינם בהריון או אלה מעכברים ב< יכול גם להתבצע על ידי 10.5 DPC הבא פרוטוקול זה.
  3. בעזרת זוג מספריים כירורגיות סטריליות, להסיר לחלוטין את חלק הבטן התחתון של העור ורקמות ריריות. עם מלקחיים, לזוז הצידה את כל האיברים האחרים עד הרחם והשחלות הן גלויות. עם הרחם עדיין מחובר, להשתמש במלקחיים כדי להעביר אותה מחוץ לחלל הצפק (איור 1 א).
  4. אתר את השחלות דיסטלי לצומת oviduct וuterotubal של כל קרן רחם. באמצעות המספריים כירורגיות הקטנים, עושה חתך בצומת uterotubal ולהפריד את קרן הרחם מלפדר מכילים כלי הרחם; לאחר מכן,בלו בצוואר הרחם לנתק את קרן הרחם מחלל הצפק (איור 1).
  5. עם מספריים כירורגיות קטנים, עושה חתך בין צוואר הרחם והמגזר הנמוך של קרנות הרחם. חופשה המצורפת חלק של צוואר הרחם במהלך תהליך זה (איור 1 ג) להימנע מפתיחת קרן הרחם.
  6. לטבול את קרן הרחם (כולל צוואר הרחם) בצלחת פטרי גדולה מלאה בפתרון 1x PBS (10 - 15 מיליליטר) כדי ללחלח את אתרי השתלה.
  7. אמנם עדיין שקועים בפתרון PBS 1x, לקצץ כל שומן מקרני הרחם עם המספריים כירורגיות הקטנים. שמור את הרקמות שקועים בפתרון PBS 1x ברחבי הנתיחה.
  8. מחזיק את קרן הרחם במקום עם המלקחיים, להסיר את אחד מאתרי ההשתלה מן הרחם עם רוחבי לחתוך את האזור בין-ההשתלה, באמצעות המספריים הקטנים כירורגית (1D איור). האתר מכיל השתלת העובר, מוקףקרומי, והרחם, decidual, ורקמות שליה.
  9. באמצעות המלקחיים, להחזיק את האתר במקום ולעשות חתך קטן בדופן הרחם הסמוך לשליה ורקמות decidual (1E איור). חתוך סביב ההיקף של השליה / decidua עד אלה להיות מופרדים משתי דופן הרחם והקרומי הכולל את העובר (איור 1F).
  10. הסר את השליה ורקמות decidual המצורפת ומקום בפתרון PBS 1x (3 - 5 מיליליטר; ראה שלב 1.12).
  11. מניחים את העובר מוקף בקרום chorioallantoic המצורף לרקמות הרחם בצלחת פטרי מלאה בפתרון 1x PBS (3 - 5 מיליליטר). הלחות של רקמות אלה תקל על ההפרדה הקרומית מדופן הרחם (ראה שלב 1.14).
  12. באמצעות פינצטה בסדר-קצה, בעדינות לקלף את רקמת decidual (שכבה לבנה-אפורה) ממשטח השליה. לבצע את זהצעד בזהירות כדי לשמור על השלמות של השליה ורקמות decidual (איור 1G).
  13. מניחים את השליה ורקמות decidual בשתי צלחות פטרי שכותרתו בנפרד מלאות פתרון 1x PBS (3 - 5 מיליליטר כל אחד).
  14. הוצא בעדינות את קיר רחם מקרומי עם פינצטה בסדר-קצה. אלה הם רקמות הרחם.
  15. מניחים את רקמות הרחם בצלחת פטרי מלאה בפתרון 1x PBS (3 - 5 מיליליטר).
  16. חזור על שלבים 1.8 דרך 1.15 עד שכל אתרי ההשתלה עובדו.
  17. לאסוף כמה רחם, decidual, ורקמות שליה כדי לשפר את התשואה של תאים במהלך עיכול אנזימטי. הסכום של רקמות תלויות בגודל ההמלטה; עם זאת, בידוד לויקוציטים דורש> 2 חתיכות של רקמות.
    הערה: למידע מפורט יותר בנוגע לנתיחה של אתרי השתלה בימי הריון שונים, להציג את התמונות מצאו בפרק ב 'של המדריך לInvestigatiבהריון עכבר 42.

2. דיסוציאציה רקמת רחם, Decidual, והשליה

  1. תווית מספר 2 מיליליטר סטרילי צינורות חרוטי עם שם הרקמות המתאים, ומניח את בקבוקון עם 1,000 μl של פתרון האנזימטית על קרח.
  2. מצלחת פטרי מלאה פתרון 1x PBS, להעביר שתי חתיכות (100 - 150 מ"ג) של הרחם, decidual, או רקמות שליה לצינור חרוטי 2 מיליליטר שכותרת.
  3. הוסף 500 μl של פתרון האנזימטית קר לכל צינור חרוטי 2 מיליליטר.
  4. עם מספריים סטרילי בסדר, מתחיל לנתק את הרקמה שקועה בפתרון האנזימטית עד שהוא טחון דק. לאורך זמן, ההשעיה תפתח מראה חלבי. צעד זה לא יעלה יותר מ -2 דקות כדי למנוע מעל-מניפולציה של המדגם.
  5. ברגע שהרקמה כבר ניתקה, להוסיף 500 μl נוסף של פתרון האנזימטית קר לצינור חרוטי 2 מיליליטר.
  6. מניחים את צינור חרוטי 2 מיליליטר על קרח.
  7. חזור על שלבים 2.2 דרך 2.6 עם כל רקמה בודדת עד שכל הרקמות עובדו.
  8. העבר את כל 2 מיליליטר צינורות חרוטי עם רקמה הומוגני (רקמות טחונות + פתרון האנזימטית) דגימות מהקרח לתוך חממה ב 37 מעלות צלזיוס ולבצע תסיסה עדינה מסלולית (80 סל"ד). דגירה של 30 - 35 דקות. ודא את הטמפרטורה של החממה הוא התייצב לפני תחילת זמן הדגירה.
  9. לאחר דגירה, להסיר את 2 צינורות חרוטי מיליליטר עם רקמות ניתקו מן החממה ולמקם אותם על קרח כדי למנוע כל עיכול נוסף.
  10. תווית צינורות חרוטי 50 מיליליטר סטרילי בהתאם לסוג רקמה. הסר את המכסים ולהחליף אותם עם מסננת סטרילי תא (100 מיקרומטר גודל נקבובית).
  11. יוצקים את הרקמות ניתקו מ2 מיליליטר צינורות חרוטי דרך מסננת התא באמצעות ~ 20 מיליליטר של תמיסת 1x PBS. שברי הרקמה יישארו במסננת התא והשעית התא תעבור דרכו.
  12. שטוף את דירקמות ssociated במסננת התא 2 - 3 פעמים עם 20 מיליליטר של תמיסת 1x PBS באמצעות פיפטה העברה.
  13. יש לשטוף את 2 מיליליטר הריק צינורות חרוטי עם פתרון PBS 1x (1 מיליליטר) ויוצקים את התוכן דרך מסננות התא.
  14. הסר את מסננות תא משל 50 צינורות חרוטי מיליליטר ולהחליף את המכסים. צנטריפוגה הצינורות ב1,250 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  15. זהירות, לשאוב supernatant מבלי להפריע תא גלולה. התא גלולה מכיל כדוריות דם לבנות מבודדות ותאי סטרומה.
  16. להשעות מחדש את התא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות RPMI ללא סרום שור עוברי (FBS). מערבבים בעדינות. אל תשתמש במערבולת.
  17. הוסף 500 μl של FBS המסודר לצינור פלסטיק קלקר 5 מיליליטר וכיסוי ההשעיה התא לאט.
  18. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 1100 XG ללא הבלם בRT לגלולת תאי קיימא תוך סלולרית פסולת נשמרת בממשק PBS / FBS.
  19. לשאוב supernatant בלי לגעת בתא גלולה. Celגלולה l מכילה תאים בעיקר קיימא.
  20. לחלופין: כדי לרכז את תאי mononuclear, להשתמש בפתרון פוליסכריד הרווי 20%, כפי שיתואר להלן.
    1. Resuspend התא גלולה ב1,000 μl של מדיום תרבות RPMI ללא FBS.
    2. הוסף 1 מיליליטר של 20% פתרון פוליסכריד רווי לצינור פלסטיק קלקר 5 מיליליטר וכיסוי ההשעיה התא על גבי פתרון זה לאט, על פי הוראות היצרן. בעוד שכבות המדגם, להימנע מהערבוב של 20% פתרון פוליסכריד רווי ההשעיה התא.
    3. צנטריפוגה עם הרוטור את נדנדה-XG ב 500 במשך 30 דקות ב RT ללא בלם. זה מאוד חשוב כדי לכבות את הבלם כדי למנוע ערבוב התאים ולאבד את השיפוע. תאי mononuclear יימצאו בממשק שבין 20% פתרון פוליסכריד הרווי ופתרון 1x PBS.
    4. לשאוב וזורקים supernatant. התא גלולה מכיל תאים בעיקר mononuclear.
      לאטה: כדי לבצע צביעת כדאיות וצביעה תאית, ראה שלב 3. כדי לבצע immunophenotyping, ראה שלב 4. כדי לבצע צביעת כדאיות וצביעה תאית בלבד, ראה שלב 5. כדי לבצע תרבית תאים של לויקוציטים המבודד, ראה שלב 6. כדי לבצע מיון תא מגנטי, ראה שלב 7.

מכתים הכדאיות 3. לתאים ניתן לתקן

  1. Resuspend התא גלולה ב1,100 μl של פתרון 1x PBS. מערבבים בעדינות באמצעות מיקרו-פיפטה.
  2. העברת ההשעיה התא 100 μl לתוך צינור פלסטיק 5 מיליליטר קלקר. להוסיף 400 μl של פתרון 1x PBS לצינור קלקר 5 מיליליטר. צינור זה הוא שליטת auto-הקרינה רקמות. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד שלב 3.5.
  3. העבר 1,000 μl הנותר של ההשעיה תא צינור פלסטיק קלקר 5 מיליליטר חדש. הוסף 1 μl של צבע הכדאיות ובעדינות homogenize. דגירה למשך 30 דקות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר דגירה, להוסיף 1,000 & #181; L של פתרון 1x PBS. מערבבים בעדינות ביד.
  5. צנטריפוגה 5 מיליליטר שני צינורות פלסטיק פוליסטירן (שלבים 3.2 ו -3.3) ב 1250 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוב וזורקים supernatant.
    הערה: התא גלולה (שלב 3.3) ישמש בשלב 4. התא גלולה (שלב 3.2) ישמש כבקרה אוטומטית הקרינה רקמות.

4. immunophenotyping

  1. Resuspend התא גלולה ב 50 μl של אנטי עכבר CD16 / CD32 (בדילול 1: 100 במאגר FACS [BSA 0.1%, 0.05% אזיד הנתרן, פתרון 1x PBS, pH 7.4]). מערבבים את ההשעיה התא בעדינות. אל תשתמש במערבולת.
  2. דגירה ההשעיה התא בצינור הקלקר 5 מיליליטר בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. לאחר דגירה, להוסיף 50 μl של כל נוגדנים חד שבטיים נגד יקוציט מגיבים עם סמנים פני תא תאיים או נוגדן שליטה בהתאמה אלוטיפ (דילולים נוגדן חייב להיות מאומת). לדוגמה, כדי לנתח את תת-אוכלוסיות לויקוציטים, להשתמש אנטי-מולהשתמש נוגדנים מגיבים עם סמני משטח יקוציט התאים הבאים: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 ו( טבלת 1).
  4. ברגע שנוגדנים כנגד סמנים תאיים נוספו לצינור פלסטיק קלקר 5 מיליליטר, מערבב בעדינות. דגירה בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. במהלך דגירה זה, להכין מראש לחמם את פתרון חיץ קיבעון (מדולל במים ללא יונים, 1: 5) עד 37 מעלות צלזיוס, במידת הצורך. שמור את החיץ על 37 מעלות צלזיוס בחושך עד השימוש בו הוא נחוץ.
  6. לאחר 30 דקות דגירה, להוסיף 500 μl של חיץ FACS בצינור פלסטיק קלקר 5 מ"ל ולערבב בעדינות. יש צורך בשלב זה כדי לשטוף את התאים ולהסיר כל עודף של נוגדן מאוגד.
  7. צנטריפוגה הדגימות ב1,250 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב וזורקים supernatant.
    הערה: אם לא נדרש מכתים תאיים, ראה שלב 5. אם נדרש מכתים תאיים, לבצע permeabilization וintracell צביעת ular כאן, ולאחר מכן להמשיך עם הקיבעון (שלב 4.8).
  8. הוסף 500 μl של פתרון חיץ קיבעון המחומם מראש לתא גלולה ודגירה בחושך במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  9. לוותר 500 μl של חיץ FACS לצינור פלסטיק קלקר 5 מיליליטר. מערבבים בעדינות.
  10. צנטריפוגה הדגימות ב1,250 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב וזורקים supernatant.
  11. הוסף 500 μl של חיץ FACS לכל דגימה. עכשיו ניתן לנתח דגימות אלה על ידי cytometry זרימה. לרכוש את הדגימות מייד לתוצאות הטובות ביותר.

מכתים הכדאיות 5. לתאי unfixable

  1. לאחר immunophenotyping תאי, resuspend התא גלולה ב 500 μl של חיץ FACS.
  2. הוסף 1 μl של 4, dihydrochloride '6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 200 מיקרוגרם / מיליליטר) ממש לפני שרכשת את המדגם.
  3. דמיינו את הדגימות בתוך 1 - 2 דקות לאחר הוספת DAPI באמצעות cytometer זרימה.

ילדה = "jove_title"> 6. תרבית תאים

  1. הכן תחנת עבודה תחת מנדף סטרילי. טרום חם התרבות בינוני RPMI 37 ° C באמצעות אמבט מים.
  2. Resuspend התא גלולה בשנת 1000 μl של חיץ FACS לספירת תאים.
  3. לספור את מספר תאי קיימא באמצעות דלפק אוטומטי תא או hemocytometer ופתרון כחול 0.4% trypan, הבא להוראות היצרן. רשום את ספירת תאים חיות הכוללת.
  4. צנטריפוגה התאים ב1,250 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר את חיץ FACS.
  5. Resuspend התא גלולה ב 500 μl של מדיום תרבות RPMI מראש חימם בעדינות על ידי pipetting 2 עד 3 פעמים.
  6. פלייט המספר הרצוי של תאים בצלחת 24 גם סטרילי ולדגור על 37 מעלות צלזיוס. זמן הדגירה ייקבע על ידי שאלת המחקר.

7. מיון תא מגנטי

  1. הגדר את תחנת עבודה נקייה עם החומרים הבאים: עמודות MS, מפריד תא מגנטי, 15צינורות מיליליטר חרוטי, 30 מיקרומטר מסננים מראש הפרדה, ורבה-עמדה.
  2. Resuspend התא גלולה ב 500 μl של חיץ MACS (BSA 0.5%, 2 מ"מ EDTA, פתרון 1x PBS, pH 7.2).
  3. שימוש בדלפק אוטומטי תא או hemocytometer ושל 0.4% פתרון trypan כחול, לספור ולרשום את ספירת תאים חיות הכוללת.
  4. צנטריפוגה התאים ב1,250 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב וזורקים supernatant. להוסיף עוד 500 μl של חיץ MACS.
  5. המשך לבצע את ההפרדה המגנטית בעקבות ההמלצות של היצרן.
  6. לקבוע טוהר ידי cytometry זרימה או מיקרוסקופ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הנתיחה של רקמות עכברי מהממשק האימהי-העוברי מוצגת באיור 1; הליך זה כולל פתיחת חלל הצפק (איור 1 א ', ב'), קרן הרחם (איור 1 ג) כוללים אתרי ההשתלה (1D איור), והאוסף של רקמות הרחם (איור 1E), שליה (איור 1F), ורקמות decidual (איור 1G) בשעה 16.5 DPC. איור 2 מציג את המורפולוגיה של מקרופאגים המבודדים (F4 / 80 +) שנאספו מרקמות decidual ורחם ב16.5 DPC...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

איסוף נתונים עקביים שמתעד את מאפייני השפע ופנוטיפי של לויקוציטים מסתנן בממשק אימהי-העוברי הוא חיוני להבנת הפתוגנזה של סיבוכים הקשורים להריון. כמה טכניקות תוארו המאפשרות הבידוד של חדירה לויקוציטים מהרקמות עכברי בממשק האימהי-עוברי במהלך הריון 31,38,39,43-46. עם זאת, כל טכניקה היא שונה, שימושים שונים אנזימים או שילובי אנזים, דורש פעמים ניתוק שונות, אינו מציין כמויות של רקמה, והכי חשוב, לא תמיד לציין את הכדאיות של התאים המבודדים. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר הבידוד של חד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לחשוף אין ניגודי אינטרסים.

תודות

NGL נתמכה על ידי Perinatal אוניברסיטת היוזמה ויין מדינה באימהי, Perinatal ובריאות ילד. אנו בתודה להכיר מורין McGerty ואיימי א Furcron (אוניברסיטת ויין סטייט) לקריאה הביקורתית שלהם של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Magentic Cell Separation
MS ColumnsMilitenyi Biotec130-042-201
מפריד תאיםMilitenyi Biotec130-042-102
30 μ m מסנני הפרדה מוקדמתMilitenyi Biotec130-041-407
MultistandMilitenyi Biotec130-042-303
צינורות חרוטיים 15 מ"לThermo Fisher339650
MACS BufferMilitenyi BiotecLaboratoryPreparation (0.5% אלבומין בסרום בקר, 2mM EDTA ו-1x PBS, pH 7.2)<
תמיסה אנזימטית AccutaseLife TechnologiesA11105-01
Anti-mouse CD16/CD32BD Biosciences533142
נוגדנים חוץ-תאיים נגד עכברBD Bioscences/eBiosciencesטבלה 1
נתרן אזידפישרS227-500
אלבומין בסרום בקר (BSA)סיגמא-אולדריץ'A7906-100G
צבע חי/מת חיTechnologiesL23105
תמיסת חיץ קיבועBD Biosciences558049
FACS BufferBD Biosciencesהכנה למעבדה0.1% BSA, 0.05% נתרן אזיד, 1x PBS, pH 7.4
תמיסה כחולה טריפן 0.4%BIO-RAD145-0013
סרום בקר עוברי (FBS)Life Technologies16000-044
<חזק>מכשירים נוספים
אינקובטור עם שייקרThermo ScientificMaxQ 4450
Flow cytometerBD LSRFortessa
Thermo ScientificLegend LXTR
מעבדתואקום
חממהThermo ScientificIncubator 3307
אמבט מיםמונה תאים 51221035
BIO-RADTC20 מונה
מיקרוסקופים אופטיים ופלואורסצנטייםZeiss ו-OlympusZeiss LSM780 ו-Olympus CKX41
td colspan="4"><חזק>ריאגנטים Life צנטריפוגה מערכת נבנתהמדויקתאים אוטומטי

מקורות

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806(2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46(2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring's health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28(2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.